Summary
Dissociare cellule di tipi di tessuto specifico richiede parametri specifici per l'agitazione dei tessuti per ottenere un elevato volume di vitali, cellule coltivabili. Il Miltenyi gentleMACS dissociatore ottimizza questa operazione con un semplice protocollo pratico. In questa pubblicazione l'utilizzo di questo apparecchio sul tessuto polmonare viene spiegata.
Abstract
La preparazione di singole cellule dai tessuti sospensioni è un presupposto importante per molti esperimenti nel campo della ricerca cellulare. Il processo di dissociazione organi interi richiede specifici parametri per ottenere un elevato numero di cellule vitali in modo riproducibile. Il dissociatore gentleMACS ottimizza questa operazione con un semplice protocollo pratico. Lo strumento contiene le impostazioni pre-programmate che sono ottimizzati per la dissociazione efficiente ma gentile di una varietà di tipi di tessuto, tra cui i polmoni del mouse. In questa pubblicazione l'utilizzo del dissociatore gentleMACS sul tessuto polmonare derivati da topi è dimostrata.
Protocol
Per lavorare in condizioni sterili, si raccomanda di eseguire tutti i passaggi in una cappa a flusso laminare.
1. Materiale
- HEPES tampone: 10 mm HEPES-NaOH pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl 2)
- Collagenasi soluzione D: D Collagenasi: 100 mg / ml (Collagenasi D> 0,15 U / mg), in HEPES tampone
- DNasi I soluzione: 20.000 U / mL DNasi I
- Tampone PBS a pH 7,2
- PEB buffer: 1 parte di soluzione stock BSA in 20 parti autoMACS soluzione di risciacquo
- Tessuto: polmone derivati da 6 / 7 settimana di vita adulto femmina BALB / C del mouse, privo di organi adiacenti.
- Opzionale: microsfere CD11c, MACS Colonne MS, separatore MACS per l'isolamento di cellule dendritiche da polmone del mouse cella singola sospensione
2. Dissociare il tessuto polmonare
- Lavare il tessuto in una capsula di Petri contenente PBS per rimuovere eritrociti.
- Trasferire un massimo di 450 mg di tessuto polmonare stecca gentleMACS C contenente 4,9 ml di tampone HEPES.
- Aggiungere 100 ul soluzione Collagenasi D per una concentrazione finale di 2 mg / ml Collagenasi D.
- Aggiungere 10 L DNasi soluzione che ho fino a 150 mg di tessuto (concentrazione finale di 40 U / ml DNasi I) o 20 l DNasi I per 150-450 mg di tessuto polmonare (concentrazione finale di 80 U / mL DNasi I).
- Chiudere bene il tubo C e attaccarlo sul dissociatore gentleMACS. Quindi eseguire il programma "m_lung_01".
- Incubare per 30 minuti a 37 ° C con rotazione automatica o manuale trasformando ogni 5 minuti.
- Ritorno del campione al dissociatore gentleMACS ed eseguire il programma "m_lung_02".
3. Filtrazione
- Preparare una provetta da 50 ml per la raccolta di cellule filtrata sostituendo il tappo con un colino 70 celle mesh micron.
- Una volta che il secondo programma gentleMACS si conclude, a seconda della distribuzione di materiale campione nel tubo, si può centrifugare la provetta brevemente per raccogliere il materiale del campione sul fondo della provetta.
- Rimuovere le cellule attraverso il tappo sigillato setto della metropolitana C con una punta adatta 1000 microlitri pipetta e applicarli al filtro delle cellule.
- Lavare il filtro delle cellule con 5 ml di tampone HEPES a temperatura ambiente.
- Centrifugare le cellule a una pallina in un tubo da 50 ml a 300xg per 10 minuti.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet di cellule nel volume desiderato di tampone PEB.
Parte 4: Risultati Rappresentante:
Figura 1. Polmone dissociazione con l'™ gentleMACS dissociatore portato a 92% cellule vitali. Le cellule morte sono state fluorescenti colorate con ioduro di propidio (PI) (dot plot a destra; dot plot a sinistra: nessuna colorazione PI).
Figura 2. Dissociazione del tessuto polmonare del mouse utilizzando i risultati dissociatore gentleMACS in un'alta percentuale di leucociti vitali e cellule endoteliali. Il derivato cella singola sospensioni sono state colorate con CD45-PE e CD146-CD31-FITC o FITC e analizzate mediante citometria a flusso.
Figura 3. Singola cellula sospensioni derivate da tessuti polmonari del mouse era macchiata di CD11c-FITC e anti-mPDCA-1-APC per rilevare il mouse CD11c bassa m-PDCA-1 + DC plasmacitoidi così come le cellule CD11c alto.
Figura 4. Arricchimento delle cellule dendritiche con microsfere CD11c, un separatore MiniMACS e due colonne MS.
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Discussion
In questo video, si introduce un nuovo metodo per la dissociazione del tessuto polmonare mouse. Abbiamo dimostrato che una combinazione di trattamento meccanico ed enzimatica del tessuto polmonare ha prodotto un alta percentuale di leucociti vitali e cellule endoteliali. In particolare, la disintegrazione meccanica del tessuto è stato ottenuto il dissociatore gentleMACS. I tubi C gentleMACS includono un rotore - sistema dello statore, che il tessuto si dissocia in modo gentile. La procedura è controllata dalle impostazioni del programma dello strumento. Le impostazioni sono state ottimizzate per ottenere alto rendimento e la vitalità delle cellule. Il derivato cella singola sospensioni sono state colorate con CD45-PE e CD146-CD31-FITC o FITC e analizzate mediante citometria a flusso per rilevare leucociti e cellule endoteliali. Cellule dendritiche nella cella singola sospensione sono state colorate con CD11c-FITC e anti-mPDCA-1-APC. Inoltre, le cellule dendritiche da un mouse polmone cella singola sospensione sono state arricchite grazie alla tecnologia MACS:. Cellule dendritiche sono magneticamente etichettati utilizzando microsfere CD11c e separati da un separatore MiniMACS e colonne MS 1,2 In generale, la combinazione della nostra dissociazione protocollo con separazione delle cellule magnetica rappresenta un metodo standardizzato per ottenere specifici tipi cellulari da tessuto polmonare.
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Acknowledgments
Gli autori sono dipendenti di Miltenyi Biotec GmbH, Germania.
Materials
References
- Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
- Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
