Summary
Dissociëren cellen van specifiek weefsel soorten vereist specifieke parameters voor weefsel opwinding tot het verkrijgen van een hoog volume van levensvatbare, kweekbare cellen. De Miltenyi gentleMACS dissociator optimaliseert deze taak met een eenvoudige, praktische protocol. In deze publicatie het gebruik van dit apparaat op longweefsel wordt uitgelegd.
Abstract
De voorbereiding van single-cell schorsingen van weefsel is een belangrijke voorwaarde voor veel experimenten in cellulair onderzoek. Het proces van dissociëren hele organen vereist specifieke parameters om een groot aantal levensvatbare cellen te verkrijgen op een reproduceerbare manier. De gentleMACS Dissociator optimaliseert deze taak met een eenvoudige, praktische protocol. Het instrument bevat voorgeprogrammeerde instellingen die zijn geoptimaliseerd voor het efficiënt, maar zachte dissociatie van een verscheidenheid van weefsels types, inclusief muis longen. In deze publicatie het gebruik van de gentleMACS Dissociator op longweefsel zijn afgeleid van muizen is aangetoond.
Protocol
Om te werken onder steriele omstandigheden, is het raadzaam om alle stappen in een laminaire stroming kap uit te voeren.
1. Materialen
- HEPES buffer: 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl 2)
- Collagenase D oplossing: Collagenase D: 100 mg / ml (Collagenase D> 0,15 U / mg), in HEPES buffer
- DNase I oplossing: 20.000 U / ml DNase I
- PBS buffer bij pH 7,2
- PEB buffer: een deel BSA Stock Solution in 20 delen autoMACS spoeloplossing
- Tissue: long afgeleid van 6 / 7 weken oude volwassen vrouwelijke BALB / C muizen, vrij van aangrenzende organen.
- Optioneel: CD11c microbolletjes, MACS MS Columns, MACS Separator voor de isolatie van dendritische cellen van muizen long single-celsuspensie
2. Dissociatie het longweefsel
- Spoel weefsel in een petrischaal met PBS aan erythrocyten te verwijderen.
- Overdracht een maximum van 450 mg longweefsel naar een gentleMACS C Tube met 4,9 ml HEPES buffer.
- Voeg 100 ul Collagenase D-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 2 mg / ml Collagenase D.
- Voeg 10 uL DNase I-oplossing voor maximaal 150 mg weefsel (uiteindelijke concentratie van 40 U / ml DNase I) of 20 il DNase I voor 150 tot 450 mg longweefsel (uiteindelijke concentratie van 80 U / ml DNase I).
- Goed afsluiten van de C metro en bevestig deze op de gentleMACS Dissociator. Dan start je het programma "m_lung_01".
- Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C met automatische rotatie of handmatig draaien om de 5 minuten.
- Keer terug naar de sample gentleMACS Dissociator en start het programma "m_lung_02".
3. Filtratie
- Bereid een 50 mL buis voor het verzamelen van cellen gefilterd door het vervangen van de kap met een 70 um mesh cel zeef.
- Zodra de tweede gentleMACS programma eindigt, afhankelijk van de verdeling van het monster materiaal in de buis, kunt u kort centrifugeer de buis om het monster materiaal op de bodem van de buis te verzamelen.
- Verwijder de cellen door het septum gesloten kap van de C-Tube met behulp van een geschikte 1000 il pipetpunt en toepassen op de cel zeef.
- Was de cel zeef met 5 ml HEPES buffer bij RT.
- Centrifugeer de cellen een pellet in een 50 ml buis 300xg gedurende 10 minuten.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de cel pellet in uw gewenste volume van de PEB buffer.
Deel 4: representatieve resultaten:
Figuur 1. Lung dissociatie met de gentleMACS ™ Dissociator resulteerde in 92% levensvatbare cellen. Dode cellen werden fluorescent gekleurd met propidiumjodide (PI) (rechts dot plot, links dot plot: geen PI kleuring).
Figuur 2. Dissociatie van de muis longweefsel met behulp van de gentleMACS Dissociator resulteert in een hoog percentage van de levensvatbare leukocyten en endotheelcellen. De afgeleide single-cell suspensies werden gekleurd met CD45-PE en de CD146-FITC of CD31-FITC en geanalyseerd door flowcytometrie.
Figuur 3. Single-celsuspensie afgeleid van muizen longweefsel werd gekleurd met CD11c-FITC en Anti-mPDCA-1-APC voor muis CD11c laag m-PDCA-1 + plasmacytoïde DCs evenals CD11c hoge cellen te detecteren.
Figuur 4. Verrijking van dendritische cellen met behulp van CD11c microbolletjes, een MiniMACS Separator en twee MS kolommen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze video, introduceren we een nieuwe methode voor de dissociatie van de muis longweefsel. We laten zien dat een combinatie van mechanische en enzymatische behandeling van het longweefsel een hoog percentage van levensvatbare leukocyten en endotheelcellen opgeleverd. In het bijzonder, was de mechanische desintegratie van het weefsel bereikt door de gentleMACS Dissociator. De gentleMACS C Tubes zijn een rotor - stator systeem, dat scheidt weefsel in een zachte manier. De procedure wordt gecontroleerd door de programma-instellingen van het instrument. De instellingen zijn geoptimaliseerd om een hoge opbrengst en de levensvatbaarheid van de cellen te bereiken. De afgeleide single-cell suspensies werden gekleurd met CD45-PE en de CD146-FITC of CD31-FITC en geanalyseerd door flowcytometrie naar leukocyten en endotheelcellen op te sporen. Dendritische cellen in de single-celsuspensie werden gekleurd met FITC CD11c-en Anti-mPDCA-1-APC. Verder werden dendritische cellen van een muis long single-celsuspensie verrijkt met MACS Technology:. Dendritische cellen werden magnetisch gelabeld met behulp van CD11c microbolletjes en gescheiden met behulp van een MiniMACS Separator en MS Columns 1,2 In het algemeen, de combinatie van onze nieuwe dissociatie protocol met magnetische celsortering is een gestandaardiseerde methode om specifieke celtypen te verkrijgen van longweefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs zijn medewerkers van Miltenyi Biotec GmbH, Duitsland.
Materials
References
- Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
- Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
