Summary
الفصل بين أنواع خلايا من نسيج معين يتطلب بارامترات محددة للتحريض الأنسجة للحصول على كميات كبيرة من الخلايا ، قابلة للحياة زروع. وgentleMACS Miltenyi dissociator يحسن هذه المهمة مع بروتوكول بسيطة وعملية. هذا المنشور هو شرح استخدام هذا الجهاز عن نسيج الرئة.
Abstract
إعداد وحيدة الخلية تعليق من الأنسجة شرطا مسبقا هاما لكثير من التجارب في مجال البحوث الخلوية. عملية الفصل بين أجهزة كله يتطلب المعلمات محددة من أجل الحصول على عدد كبير من خلايا قابلة للحياة بطريقة استنساخه. وDissociator gentleMACS يحسن هذه المهمة مع بروتوكول بسيطة وعملية. الأداة مبرمجة مسبقا يحتوي على الإعدادات التي هي الأمثل للكفاءة ولكن لطيف تفارق من مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة ، بما في ذلك الرئتين الماوس. في هذا المنشور ويتجلى استخدام Dissociator gentleMACS على أنسجة الرئة المستمدة من الفئران.
Protocol
على العمل تحت ظروف معقمة ، فمن المستحسن لتنفيذ كافة الخطوات في تدفق الصفحي هود.
1. المواد
- HEPES العازلة : 10 مم HEPES - هيدروكسيد الصوديوم الهيدروجيني 7.4 ، 150 مم كلوريد الصوديوم ، 5 ملي بوكل ، 1 ملم MgCl 2 و 1.8 ملي CaCl 2)
- كولاجيناز D الحل : كولاجيناز D : 100 ملغ / مل (كولاجيناز D> 0.15 U / ملغ) ، في HEPES العازلة
- الدناز أنا الحل : 20،000 U / مل أنا الدناز
- PBS العازلة عند الرقم الهيدروجيني 7.2
- PEB العازلة : 1 ألبوم جيش صرب البوسنة في 20 جزءا الحل أجزاء autoMACS الحل الشطف
- نسيج : سرطان الرئة المستمدة من 07/06 الاسبوع القديمة الماوس الكبار BALB / C الإناث ، وخالية من الأجهزة المجاورة.
- اختياري : CD11c MicroBeads ، MACS أعمدة MS ، MACS فاصل لعزل الخلايا الجذعية من الايقاف فأر وحيد الخلية الرئة
2. عدم الربط بين أنسجة الرئة
- شطف الأنسجة في طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني لإزالة كريات الدم الحمراء.
- نقل كحد أقصى من 450 ملغ إلى أنسجة الرئة أنبوب C gentleMACS تحتوي على 4.9 مل HEPES العازلة.
- إضافة 100 ميكرولتر حل D كولاجيناز إلى تركيز النهائي من 2 دال كولاجيناز ملغ / مل
- أضف 10 ميكرولتر الحل الأول الدناز لمدة تصل إلى 150 ملغ الأنسجة (تركيز النهائي من 40 يو / مل الدناز I) أو 20 ميكرولتر الدناز I 150-450 ملغ لأنسجة الرئة (تركيز النهائي من 80 الدناز I U / مل).
- إغلاق الأنبوب بإحكام C ونعلق وضعها على Dissociator gentleMACS. ثم تشغيل برنامج "m_lung_01".
- احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع تناوب الآلي أو يدويا تحول كل 5 دقائق.
- عودة إلى عينة Dissociator gentleMACS وتشغيل برنامج "m_lung_02".
3. تصفية
- يعد أنبوب 50 مل لجمع الخلايا التي تمت تصفيتها من خلال استبدال الغطاء بمصفاة 70 ميكرومتر شبكة خلية.
- مرة واحدة في برنامج gentleMACS الثانية بعد ، اعتمادا على توزيع المواد العينة في الأنبوب ، قد الطرد المركزي في أنبوب لفترة قصيرة لجمع مادة العينة في الجزء السفلي من الأنبوب.
- إزالة الخلايا من خلال الغطاء الحاجز مختومة من الأنبوب C باستخدام ماصة مناسبة 1000 غيض ميكرولتر وتطبيقها على مصفاة الخلية.
- غسل مصفاة الخلية مع 5 مل HEPES العازلة في RT.
- الطرد المركزي الخلايا لبيليه في أنبوب مل 50 في 300xg لمدة 10 دقيقة.
- نضح في وطاف resuspend الكرية في حجم الخلية التي تريدها ، PEB العازلة.
الجزء 4 : النتائج الممثل :
الشكل 1. أسفرت الرئة تفارق مع Dissociator ™ gentleMACS في خلايا قابلة للحياة 92 ٪. وكانت ملطخة fluorescently الخلايا الميتة مع يوديد propidium (PI) (الحق مؤامرة نقطة ؛ اليسار مؤامرة نقطة : لا تلطيخ PI).
الشكل 2. تفكك أنسجة الرئة باستخدام الماوس نتائج Dissociator gentleMACS في ارتفاع نسبة الكريات البيض قابلة للحياة والخلايا البطانية. وكانت ملطخة المستمدة حيدة الخلية مع تعليق PE - CD45 و CD146 FITC أو CD31 FITC وتحليلها من قبل التدفق الخلوي.
وكان الرقم 3 الملون. حيدة الخلية تعليق المستمدة من أنسجة الرئة الفأر مع CD11c - FITC ومكافحة mPDCA APC - 1 - لكشف الماوس CD11c منخفضة M - PDCA - 1 + بلازماوية البلدان النامية وكذلك ارتفاع CD11c الخلايا.
الشكل 4. إثراء باستخدام الخلايا الجذعية MicroBeads CD11c ، وهو فاصل MiniMACS واثنين من أعمدة MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا الفيديو ، نقدم طريقة جديدة للتفكك أنسجة الرئة الماوس. نظهر أن الجمع بين المعالجة الميكانيكية والأنزيمية للأنسجة الرئة حققت نسبة عالية من الكريات البيض قابلة للحياة والخلايا البطانية. على وجه التحديد ، وقد تحقق تفكك الميكانيكية للأنسجة التي Dissociator gentleMACS. جيم أنابيب gentleMACS تشمل الدوار -- نظام الموالي ، والتي تنأى الأنسجة بطريقة لطيفة. يتم التحكم في الإجراء إعدادات البرنامج للصك. وكانت الأمثل لتحقيق الضبط عالية الغلة وسلامة الخلايا. وكانت ملطخة المستمدة حيدة الخلية مع تعليق PE - CD45 و CD146 FITC أو CD31 FITC وتحليلها من قبل التدفق الخلوي للكشف عن الكريات البيضاء وخلايا بطانة الأوعية الدموية. تم صبغ الخلايا الجذعية في تعليق وحيد الخلية ، مع FITC CD11c ومكافحة mPDCA APC - 1. علاوة على ذلك ، وقد أثرى الخلايا الجذعية من الايقاف فأر وحيد الخلية الرئة باستخدام تقنية MACS : وصفت مغناطيسيا الخلايا الجذعية باستخدام MicroBeads CD11c وفصلها باستخدام فاصل MiniMACS وأعمدة MS 1،2 في العام ، ومزيج من التفكك لدينا بروتوكول جديد مع الفرز المغناطيسي الخلية يمثل طريقة موحدة للحصول على أنواع معينة من الخلايا من أنسجة الرئة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
الكتاب هم من موظفي شركة محدودة Miltenyi بيوتيك ، ألمانيا.
Materials
References
- Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
- Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
