Summary
特定の組織型から解離し細胞は組織の攪拌のための特定のパラメータは、実行可能な、培養可能な細胞の大量を取得する必要があります。ミルテニーgentleMACS dissociatorは、シンプルで実用的なプロトコルを使用してこのタスクを最適化します。本書では肺組織でこの装置の使用は説明されています。
Abstract
組織からの単細胞懸濁液の調製は、細胞の研究で多くの実験のための重要な前提条件です。全体の臓器を解離のプロセスは、再現可能な方法で生細胞の高い数値を得るために特定のパラメータが必要です。 gentleMACS Dissociatorは、シンプルで実用的なプロトコルを使用してこのタスクを最適化します。楽器は、マウスの肺を含む組織の種類、様々な効率的ですが穏やかな解離のために最適化され、事前にプログラム設定が含まれています。本書ではマウス由来の肺組織でgentleMACSのDissociatorの使用が示されている。
Protocol
無菌条件下で動作するように、それは層流フード内のすべての手順を実行することをお勧めします。
1。材料
- HEPES緩衝液：10mMのHEPES - NaOHでpH7.4の、150mMのNaCl、5mMのKClを、1mMのMgCl 2、1.8 mMのCaCl 2で ）
- コラゲナーゼD溶液：コラゲナーゼD：HEPESバッファーで100 mg / mLの（コラゲナーゼD> 0.15 U / mg）を、
- DNase I溶液：20,000 U / mlのDNase I
- pH7.2のPBSバッファー
- PEBバッファー：20部autoMACSすすぎ溶液の1部BSAストック溶液
- 組織：隣接臓器の自由な6月7日週齢の成体雌のBALB / Cマウス由来の肺。
- オプション：CD11cはマイクロビーズ、MACS MSカラム、マウスの肺単一細胞の懸濁液から樹状細胞の分離におけるMACSセパレーター
2。肺組織を解離
- 赤血球を除去するためにPBSを含むペトリ皿の中で組織をすすいでください。
- 4.9 mLのHEPES緩衝液を含むgentleMACS Cチューブに450mgの肺組織の最大値を転送する。
- 2 mg / mlのコラゲナーゼDの最終濃度に100μLのコラゲナーゼD溶液を加える
- 最大150 mgの組織（40 U / mlのDNase Iの最終濃度）または150から450 mgの肺組織の場合は20μLのDNase I（80 U / mlのDNase Iの最終濃度）に10μLのDNase I溶液を加える。
- しっかりとCチューブを閉じ、gentleMACSのDissociatorにそれを添付してください。次にプログラム"m_lung_01"を実行してください。
- 37℃で30分間インキュベート℃で自動化された回転または手動ですべての5分を回すと。
- gentleMACSのDissociatorにサンプルを返すとプログラム"m_lung_02"を実行してください。
3。ろ過
- 70μmのメッシュのセルストレーナーにキャップを交換することによってフィルタリングされた細胞を収集するための50 mlチューブを準備します。
- 1秒間に1回gentleMACSプログラムは、チューブ内の試料の分布に応じて、終了するには、チューブの下部にあるサンプルの材料を収集するために簡単にチューブを遠心することができる。
- 適切な1000μlのピペットチップを使用してC管の隔膜密封キャップを介して細胞を取り出して、セルストレーナーにそれらを適用する。
- 室温で5 mlのHEPES緩衝液でセルストレーナーを洗浄してください。
- 10分間300xgで50 mLのチューブにペレットに細胞を遠心分離します。
- 上清を吸引除去し、PEBバッファーのご希望の音量に細胞ペレットを再懸濁します。
パート4：代表的な結果：
gentleMACS™Dissociatorと図1。肺解離は92％生存細胞をもたらした。死んだ細胞は蛍光ヨウ化プロピジウム（PI）（;：なしPI染色左のドットプロット右ドットプロット）で染色した。
図2。実行可能な白血球と内皮細胞の高い割合でgentleMACSのDissociatorの結果を使用してマウスの肺組織の解離。由来の単細胞懸濁液は、CD45 - PEとCD146 - FITCまたはCD31 - FITCで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
マウスの肺組織由来の図3。単セル懸濁液をM - PDCA - 1マウスのCD11c 低を検出するために+形質樹だけでなく、CD11cは高い細胞をCD11cは- FITCおよび抗mPDCA - 1 - APCで染色した。
図4のCD11c MicroBeadsを用いて樹状細胞の濃縮、MiniMACSセパレータ二MSカラム。
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Discussion
このビデオでは、我々はマウスの肺組織の解離のための新しい方法を導入する。我々は、肺組織の機械的および酵素処理の組み合わせが可能な白血球と内皮細胞の高い割合をもたらしたことを示している。特に、組織の機械的な崩壊は、gentleMACSのDissociatorによって達成された。ステータシステム、穏やかな方法で解離の組織 - gentleMACS Cチューブは、ローターが含まれています。手順は、機器のプログラムの設定によって制御されます。設定は、セルの高収率および生存率を達成するために最適化された。由来の単細胞懸濁液は、CD45 - PEとCD146 - FITCまたはCD31 - FITCで染色し、白血球と内皮細胞を検出するフローサイトメトリーによって分析した。単一細胞懸濁液中の樹状細胞は、CD11cは- FITCおよび抗mPDCA - 1 - APCで染色した。さらに、マウスの肺単一細胞懸濁液からの樹状細胞は、MACS Technologyを用いて濃縮した。樹状細胞は、磁気のCD11c MicroBeadsを用いて標識し、MiniMACSセパレータおよびMSカラムを用いて分離された一般的には1,2、との新たな解離プロトコルの組み合わせ磁気細胞選別は、肺組織から特定の細胞型を取得するために標準化されたメソッドを表します。
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Acknowledgments
著者らは、ミルテニーバイオテク社、ドイツの従業員です。
Materials
References
- Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
- Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
