Summary
특정 조직 유형의 세포를 Dissociating하면 조직의 동요에 대한 특정 매개 변수가 가능한, culturable 세포의 높은 볼륨을 얻기 위해 필요합니다. Miltenyi gentleMACS dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 이 발행물에서 폐 조직에서이 장치의 사용이 설명되어 있습니다.
Abstract
조직에서 단일 셀 suspensions의 준비 세포 연구에 많은 실험을위한 중요한 사전 요구 사항에 해당됩니다. 전체 장기 dissociating의 과정은 재현성 방식으로 가능한 세포의 높은 숫자를 얻기 위해서는 특정 매개 변수를 필요로합니다. gentleMACS Dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 악기는 마우스를 포함하여 폐 조직 유형의 다양한 효율적이지만 부드러운 분리에 최적화된 미리 프로그램된 설정이 포함되어 있습니다. 이 간행물의 생쥐에서 파생된 폐 조직에 gentleMACS의 Dissociator의 사용을 시연합니다.
Protocol
무균 조건 하에서 해결하려면, 그것은 층류 후드의 모든 단계를 수행하는 것이 좋습니다.
1. 자료
- HEPES 버퍼 : 10 MM HEPES - NaOH 산도 7.4, 150 MM NaCl, 5 KCl MM, 1 MM MgCl 2, 1.8 MM CaCl 2)
- Collagenase D 솔루션 : Collagenase D : 100 MG / ML (Collagenase D> 0.15 U / MG) HEPES에서 버퍼
- DNase I 솔루션 : 20,000 U / ML DNase I
- 산도 7.2에서 PBS 버퍼
- PEB 버퍼 : 20 부품 1 부품 BSA 주식 솔루션 Rinsing 솔루션 autoMACS
- 조직 : 인접한 장기 무료 7분의 6 week 오래된 성인 여성 BALB / C 마우스에서 파생된 폐.
- 옵션 : CD11c MicroBeads, 맥 MS 열, 마우스 폐 단일 셀 정지 돌기 세포의 격리 Mac 용 세퍼레이터
2. 폐 조직을 Dissociating
- 적혈구를 제거하는 PBS가 포함된 배양 접시에있는 조직을 씻어.
- 4.9 ML의 HEPES 버퍼를 포함하는 gentleMACS C 튜브 450 MG의 폐 조직의 최대 전송합니다.
- 2 MG / ML Collagenase D.의 최종 농도 100 μL Collagenase D 솔루션 추가
- 150 MG 조직 (40 U / ML DNase I의 최종 농도) 또는 150-450 MG의 폐 조직을 20 μL DNase I (80 U / ML DNase I의 최종 농도)에 10 μL DNase I 솔루션을 추가합니다.
- 단단히 C 튜브를 닫고 gentleMACS의 Dissociator에 그것을 연결합니다. 그런 다음 프로그램 "m_lung_01"를 실행합니다.
- 37 30 분 품어 ° C 자동 또는 수동으로 회전마다 5 분 터닝과 함께.
- gentleMACS의 Dissociator에 샘플을 반환하고 프로그램 "m_lung_02"를 실행합니다.
3. 여과법
- 70 μm의 메쉬 셀 스트레이너와 뚜껑을 교체하여 필터링 세포를 수집하기 위해 50 ML 튜브를 준비합니다.
- 일단 두 번째 gentleMACS 프로그램이 튜브의 샘플 자료의 배포에 따라 종료, 당신은 튜브 하단의 샘플 자료를 수집하기 위해 간단히 튜브를 원심 수 있습니다.
- 적당한 1,000 μl 피펫 팁을 사용하여 C 튜브의 심장 봉인 캡을 통해 세포를 제거하고 세포 스트레이너에게 적용됩니다.
- RT에서 5 ML HEPES 버퍼와 셀 스트레이너 씻으십시오.
- 10 분 300xg에서 50 ML 튜브의 펠렛에 세포를 원심 분리기.
- 뜨는을 기음과 PEB 버퍼의 원하는 볼륨의 세포 펠렛을 resuspend.
4 부 : 대표 결과 :
그림 1. gentleMACS ™ Dissociator과 폐 분리가 92% 가능한 세포의 결과. 죽은 세포는 찬란 propidium 요오드화물의 (PI) (; 없음 PI의 얼룩 왼쪽 도트 플롯 바로 도트 플롯)와 스테인드되었습니다.
그림 2. 가능한 leukocytes 및 내피 세포의 높은 비율의 gentleMACS의 Dissociator 결과를 사용하여 마우스 폐 조직의 해리. 파생된 단일 셀 suspensions는 CD45 - PE와 CD146 - FITC 또는 CD31 - FITC 물들일 및 유동세포계측법에 의해 분석되었다.
그림 3. 마우스 폐 조직에서 파생된 단일 셀 정지 CD11c - FITC와 안티 mPDCA - 1 - APC 마우스 CD11c 낮은 M - PDCA - 1 + plasmacytoid의 DC가뿐만 아니라 CD11c 높은 세포를 감지하는 물들일했다.
그림 4. CD11c MicroBeads, MiniMACS 구분 기호와 두 MS 열을 사용하여 돌기 세포의 농축.
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Discussion
이 비디오에서는, 우리는 마우스 폐 조직의 분리를위한 새로운 방법을 소개합니다. 저희는 폐 조직의 기계적 효소 치료의 조합이 가능한 leukocytes 및 내피 세포의 높은 비율을 알아낼 것을 보여줍니다. 특히, 조직의 기계적 붕괴는 gentleMACS의 Dissociator에 의해 달성되었다. 고정자 시스템, 부드러운 방식으로 dissociates 조직 - gentleMACS C 튜브는 로터가 포함되어 있습니다. 절차는 악기의 프로그램 설정에 의해 제어됩니다. 설정은 세포의 높은 수율과 생존을 달성하기 위해 최적화되었다. 파생된 단일 셀 suspensions는 CD45 - PE와 CD146 - FITC 또는 CD31 - FITC 물들일 및 leukocytes과 내피 세포를 감지하는 유동세포계측법에 의해 분석되었다. 단일 세포 현탁액에서 돌기 세포는 CD11c - FITC와 안티 mPDCA - 1 - APC 물들일되었습니다. 또한, 마우스 폐 단일 셀 정지 돌기 세포는 맥 기술을 사용하여 풍부하게되었습니다. 돌기 세포는 자기 (磁气) CD11c MicroBeads를 사용하여 분류하고 MiniMACS 구분 기호와 MS 열을 사용하여 분리되었다 일반적으로 1,2와 새로운 분리 프로토콜의 결합 자기 셀 정렬은 폐 조직의 특정 세포 유형을 얻을 수있는 표준 방법을 나타냅니다.
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Acknowledgments
Miltenyi Biotec 저자 GmbH를, 독일의 직원입니다.
Materials
References
- Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
- Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
