Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Standardize Hazırlık gentleMACS Dissociator kullanarak Fare Akciğer Doku Tek Hücre Cezalar

doi: 10.3791/1266 Published: July 2, 2009

Summary

Belirli doku tiplerinin hücreleri Dissociating doku ajitasyon için belirli parametreler uygulanabilir kültürlenebilen hücrelerinin yüksek ses elde etmek için gereklidir. Miltenyi gentleMACS dissociator basit, pratik bir protokol ile bu görevi en iyi hale getirir. Bu yayında akciğer dokusunda bu cihazların kullanımı açıklanmıştır.

Abstract

Dokuların tek hücre süspansiyonları hazırlık hücre araştırmalarında birçok deneyler için önemli bir ön koşuldur. Bütün organlar dissociating süreci, tekrarlanabilir bir şekilde yüksek bir sayıda canlı hücreleri elde etmek için belirli parametreler gerektirir. GentleMACS Dissociator basit, pratik bir protokol ile bu görevi en iyi hale getirir. Cihaz fare akciğerler dahil olmak üzere çeşitli doku tipleri, verimli ama nazik ayrılma için optimize edilmiş, önceden programlanmış ayarları içerir. Bu yayında farelerden elde edilen akciğer dokusunda gentleMACS Dissociator kullanımı gösterilmiştir.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Steril koşullar altında çalışmak için, bir laminer akış kaputun içindeki tüm adımları gerçekleştirmek için tavsiye edilir.

1. Malzemeler

  1. HEPES tamponu: 10 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM MgCl 2, 1.8 mM CaCl 2)
  2. Kollajenaz D çözüm: kollajenaz D: 100 mg / ml (kollajenaz D> 0.15 U / mg) Hepes, tampon
  3. DNaz I çözüm: 20.000 U / ml DNaz I
  4. PBS pH 7,2
  5. PEB tampon: 20 kısım 1 kısım BSA Stok Çözüm Çözüm Durulama autoMACS
  6. Doku: 6 / 7 hafta eski komşu organlara yetişkin erkek BALB / C fare, ikinci elde edilen akciğer.
  7. İsteğe Bağlı: CD11c mikro, MACS MS Sütunlar fare akciğer tek hücre süspansiyonu dendritik hücrelerin izolasyonu için MACS Ayırıcı

2. Akciğer dokusu Dissociating

  1. Eritrositler kaldırmak için PBS içeren bir Petri kabındaki doku durulayın.
  2. 4.9 mL HEPES tamponu içeren bir gentleMACS C Tüp maksimum 450 mg akciğer dokusunda bir aktarın.
  3. 2 mg / ml kollajenaz D. nihai konsantrasyonu 100 mcL kollajenaz Ge çözüm
  4. 150 mg doku (40 U / ml DNaz I final konsantrasyon) veya 150-450 mg akciğer dokusunda için 20 mcL DNaz I (80 U / ml DNaz I final konsantrasyon) için 10 mcL DNaz I çözüm ekleyin.
  5. Sıkıca C Tüp yakın ve gentleMACS Dissociator üzerine ekleyin. Sonra programı çalıştırın "m_lung_01".
  6. 37 ° 30 dakika ° C'de otomatik rotasyon veya elle her 5 dakikada bir dönüm.
  7. GentleMACS Dissociator örnek dönün ve "m_lung_02" programı çalıştırın.

3. Süzme

  1. 70 mikron mesh hücre süzgecinden kap değiştirerek filtre hücreleri toplamak için 50 ml tüp hazırlayın.
  2. Sonra ikinci gentleMACS Programı tüp örnek malzeme dağıtımı bağlı olarak, biter, tüpün alt kısmında örnek malzeme toplamak için kısaca tüp santrifüj olabilir.
  3. Uygun bir 1000 ul pipet kullanarak C Boru septum kapalı kap aracılığıyla hücreleri hücre süzgeç çıkarın ve bunları uygulamak.
  4. RT 5 ml HEPES tamponu ile hücre süzgeç yıkayın.
  5. 10 dakika 300xg 50 ml tüp hücreleri bir pelet Santrifüj.
  6. Süpernatantı aspire ve PEB tampon istenen hacmi hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin.

Bölüm 4: Temsilcilik Sonuçları:

Şekil 1
Şekil 1: Akciğer disosiasyon gentleMACS ™ Dissociator% 92 canlı hücreler ile sonuçlandı. Ölü hücreler floresan propidium iyodür (PI (); PI boyama sol nokta arsa sağ nokta arsa) ile boyandı.

Şekil 2
Şekil 2 fare akciğer dokusunun canlı lökosit ve endotel hücreleri yüksek oranda gentleMACS Dissociator sonuçlarını kullanarak Ayrılma. CD45-PE ve CD146-FITC veya CD31-FITC kökenli tek hücre süspansiyonları ile boyandı ve flow sitometri ile analiz edildi.

Şekil 2c
Şekil 3 fare akciğer dokusundan elde edilen tek hücre süspansiyonu CD11c-FITC ve Anti-mPDCA-1-APC fare CD11c düşük m-PUKÖ-1 + plazmasitoid DC'ler yanı sıra CD11c yüksek hücreleri algılamak için boyandı .


Şekil 4
Şekil 4 CD11c mikro, MiniMACS Ayırıcı ve iki MS Sütunlar kullanarak dendritik hücrelerin zenginleştirilmesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu video, fare akciğer dokusunun ayrışma için yeni bir yöntem tanıtmak. Biz akciğer dokusunun mekanik ve enzimatik tedavi bir arada yaşayabilir lökosit ve endotel hücreleri yüksek oranda vermiştir olduğunu göstermektedir. Özellikle, doku mekanik parçalanması gentleMACS Dissociator tarafından elde edildi. Stator sistemi, yumuşak bir şekilde ayrışmaktadır doku gentleMACS C Tüpler bir rotor. Bu prosedür, cihazın program ayarları tarafından kontrol edilir. Ayarları, yüksek verim ve hücre canlılığı elde etmek için optimize edilmiştir. Kökenli tek hücre süspansiyonları CD45-PE ve CD146-FITC veya CD31-FITC ile boyandı ve lökosit ve endotel hücreleri algılamak için flow sitometri ile analiz edildi. Tek hücre süspansiyonu dendritik hücreler CD11c-FITC ve Anti-mPDCA-1-APC ile boyandı. Ayrıca, bir fare akciğer tek hücre süspansiyonu dendritik hücreler MACS Teknoloji kullanılarak zenginleştirildi. Dendritik hücreler manyetik CD11c mikro kullanarak etiketli MiniMACS Ayırıcı ve MS Sütunlar kullanarak ayrıldı genel olarak 1,2 ile yeni disosiasyon protokolü kombinasyonu Manyetik hücre sıralama, belirli bir hücre türleri akciğer dokusundan elde etmek için standart bir yöntem temsil eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Yazarlar Miltenyi Biotec GmbH, Almanya çalışanları.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C Tubes Miltenyi Biotec Order no. 130-093-237 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
gentleMACS™ Starting Kit Miltenyi Biotec Order no. 130-093-235 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ Tube Rotator Miltenyi Biotec Order no. 130-090-753 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-091-222 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-091-376 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
CD11c MicroBeads Miltenyi Biotec Order No. 130-052-001 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx
CD11c-FITC, CD11c-PE Miltenyi Biotec Order no. 130-092-026130-091-830 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx
Anti-mPDCA-1-APC Miltenyi Biotec Order no. 130-091-963 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx
CD146-FITC Miltenyi Biotec Order no. 130-092-026 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx
CD45-PE Miltenyi Biotec Order no. 130-091-610 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx
Propidium Iodide Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-093-233 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx
Art 1000 Reach Pipet Tips Molecular BioProducts Order no. 2079 http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61
http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
  2. Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
Standardize Hazırlık gentleMACS Dissociator kullanarak Fare Akciğer Doku Tek Hücre Cezalar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (29), e1266, doi:10.3791/1266 (2009).More

Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (29), e1266, doi:10.3791/1266 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter