Summary
وتتناول عملية electrospinning البوليمرات للهندسة الأنسجة والخلايا الثقافة في هذه المقالة. على وجه التحديد ، هو وصفها electrospinning من macromers photoreactive مع قدرات معالجة إضافية من photopatterning وelectrospinning متعددة البوليمر.
Abstract
باعتبار أن هذا المجال من تطور هندسة الأنسجة ، وهناك طلب هائل على انتاج مزيد من المواد المناسبة وتقنيات المعالجة من أجل تلبية الاحتياجات (على سبيل المثال ، الميكانيكا والأوعية الدموية) من أجهزة أكثر تعقيدا والأنسجة. Electrospinning هو الاسلوب الشعبي لإنشاء السقالات الليفية التي تحاكي العمارة ومقياس حجم المصفوفة خارج الخلية الأصلية. هذه السقالات ليفية مفيدة أيضا بمثابة ركائز الثقافة الخلية حيث يمكن استخدام ألياف لتوجيه السلوك الخلوية ، بما في ذلك تمايز الخلايا الجذعية (انظر نقدية مستفيضة Mauck
Protocol
ألف مفردة بوليمر Electrospinning
- قبل إعداد حل electrospinning ، وجعل 0.5 ٪ بالوزن حل photoinitiator ، Irgacure 2959 (I2959) ، في ماء منزوع الأيونات عن طريق إذابة عند 37 درجة مئوية لعدة أيام. هذه الخطوة غير ضرورية إذا لم يتم بوليمر photoreactive المستخدمة.
- الجمع بين حمض الهيالورونيك methacrylated (MeHA ، انظر Burdick وآخرون لتخليق) ، وبولي (أكسيد الاثيلين) (PEO ، و 900 كيلو دالتون) ، وI2959 في الماء منزوع الأيونات لإعداد الحل النهائي مع التركيز على 2 ٪ بالوزن MeHA ، 3 ٪ بالوزن PEO ، و 0.05 ٪ بالوزن I2959. استخدام مزيج من دوامة الحل حتى يتبين. يمكن تعديل نوع البوليمر والتركيز ، فضلا عن استخدام المذيبات في هذه الخطوة تبعا لخصائص سقالة المطلوب.
- نقل الحل إلى حقنة وإرفاق قياس 18 ، 6 بوصة طويلة ، إبرة حادة نهاية إلى نهاية.
- برنامج ضخ حقنة لإخراج بمعدل 1.2 مل / ساعة. إدراج المحاقن والإبر في الجهاز.
- إرفاق يؤدي أساس مصدر الطاقة العالية الجهد لجهاز التحصيل. لجمع وزعت عشوائيا ألياف استخدام لوحة معدنية مسطحة ، أو استخدام مغزل بالتناوب في ~ 10 م / ث لجمع ألياف الانحياز. إرفاق يؤدي المشحونة إيجابيا على الإبرة. انظر الشكل رقم 1 لالتخطيطي لجهاز electrospinning.
- ضبط الجهاز إبرة أو جمع ، مثل وجود مسافة 15 سم بين الاثنين.
- بدء تدفق على ضخ حقنة. عندما السائل هو تصور على رأس الإبرة ، بدوره على مصدر الطاقة وتعيين الجهد إلى 22 كيلو فولت.
- بعد اكتمال جمع (من عدة دقائق للأفلام رقيقة ، لتصل إلى 24 ساعة لأكثر سمكا حصيرة) ، إزالة السقالة من جهاز جمع وتخزين تحت فراغ بين عشية وضحاها لضمان الإزالة الكاملة للمذيب.
- تصور مورفولوجيا الألياف باستخدام المجهر الإلكتروني (SEM) ، تظهر سقالة ممثل في الشكل رقم 1 لكلا هياكل الانحياز وعدم الانحياز.
ملاحظة : معدل تدفق العينة ، والمسافة للوصول إلى جهاز جمع والجهد وتعتمد على الجمع بين البوليمر والمذيبات ويجب أن يكون الأمثل لكل نظام ، وعادة من خلال مراقبة التشكل سقالة مع SEM.
وباء Photocrosslinking Photopatterning
- قطع 5mm 5mm X عينات من سقالة حصيرة.
- الاستعداد لوضع كل يشابك بواسطة سقالة على شريحة زجاجية مغطاة احباط ، ووضع الضوئية الرئيسية مباشرة على منصة الاعدام ، وتغطي مع شريحة زجاجية نظيفة والقطع مع طرفي مقاطع الموثق. ملاحظة : يمكن القيام به أربع عينات في وقت واحد ، ويمكن استخدام الشفافية دون وجود نمط ليشابك إذا لم يتم المطلوب نمط.
- تعيين سقالة تطهير في برلمان النيتروجين. فمن المهم للحفاظ على بناء خالية من الأكسجين ، والتي يمكن أن تحول دون يشابك.
- مكان سقالة الإعداد في غرفة تحت النيتروجين ~ 10 ميغاواط / سم 2 365 نانومتر الخفيفة مع محول الموازاة لمدة 5 دقائق. انظر التخطيطي في الشكل 2.
- إزالة كل سقالة والمكان في لوحة 12 أيضا.
- إضافة 2 مل من الماء منزوع الأيونات في كل بئر ، parafilm لوحة لمنع تبخر الماء والمكان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تغيير المياه ثلاث مرات.
- تصور تشكيل المسام تحت المجهر الخفيفة (انظر المثال في الشكل 2). والسقالات الآن جاهز للاستخدام.
ملاحظة : ليس من الضروري Photocrosslinking للعديد من أنواع البوليمرات ، ولكن يمكن فقط أن تستخدم photopatterning مع البوليمرات photoreactive.
جيم مزدوجة بوليمر Electrospinning مع نيون التصور الالياف
- إعداد ٪ بالوزن 5 حل PEO (200 كيلو دالتون) في الايثانول 90 ٪. ضجة عند 700 دورة في الدقيقة في 50 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة قبل electrospinning.
- نقل إلى حل PEO حقنة وإضافة دابي لتركيز النهائي من التركيز ملغ / 10 مل في حل electrospinning. التفاف حقنة في رقائق الألومنيوم لحمايته من الضوء.
- إعداد نفس الحل خطوة وصفها في A2 ، باستثناء أيضا إضافة methacryloxyethyl thiocarbamoyl رودامين B (MeRho ، 683.24 جم / مول) لتركيز النهائي من 25 ميكرومتر في حل electrospinning. التفاف حقنة في رقائق الألومنيوم لحمايته من الضوء.
- استخدام الشريط سكوتش بعناية لتأمين coverslips الزجاج methacrylated (انظر Khademhosseini وآخرون) إلى سطح مغزل. ملاحظة : سوف تصبح ألياف زجاجية مصطفة على coverslips methacrylated.
- نعلق قطعة واحدة من نهاية عملية طويلة من 5 ملم أنابيب السيليكون مع المرفقات قفل luer إلى واحد من المحاقن ونعلق على الطرف الآخر لإبرة. تضاف إلى ضخ حقنة حقنة ووضع الإبرة من خلال ثقب في fanner. كرر مع حقنة أخرى وfanner على موقع المعاكس للمغزل. وfanners ترجمة لوتستخدم ength من مغزل وضمان التوزيع المتساوي لكلا البوليمرات في سقالة الناتجة عن ذلك. انظر التخطيطي في الشكل 3.
- ضبط المعلمات وصفها في الفرع ألف وفقا للجدول رقم 1 بشكل مناسب. تأكد من أن تتركز النصائح إبرة على مغزل.
الجدول 1. المزدوج بوليمر معلمات Electrospinningمحقنة Fanner تلميح إلى الإبرة (سم) تلميح إلى إبرة مغزل (سم) معدل التدفق (مل / ساعة) تطبيق الجهد الكهربائي (كيلو فولت) MeHA 6 15 1.2 +22 PEO 6 10 1.2 +15 - حالما يتم محاذاة كل شيء بشكل صحيح ، إطفاء الأنوار وتشغيل مضخات مغزل والمحاقن. إزالة رقائق الألومنيوم من المحاقن. عندما السائل مرئيا على نصائح كل من الإبر ، وتتحول في وقت واحد على امدادات الطاقة والمكونات في fanners.
- عند اكتمال جمع ، إيقاف إمدادات الطاقة ومغزل وافصل fanners. إزالة بعناية وcoverslips الشريط باستخدام شفرة حلاقة.
- تصور الألياف باستخدام المجهر الفلورسنت مجهزة بمرشحات لرودامين ودابي. انظر المثال في الشكل 3. ملاحظة : ألياف نيون هي الأكثر واضحة لعرضها عند electrospun لفترات قصيرة من الزمن (<3 دقائق) ، ومع ذلك ، ويمكن تمديد هذه العملية للحصول على كمية غير محدودة من الزمن من اجل خلق بنيات أكثر سمكا ، ولا سيما من دون استخدام الزجاج coverslips .
خلايا البذر دال على السقالات
- وضع كل ساترة مع البوليمر electrospun تعلق في الفرد جيدا لوحة بئر بحجم مناسب. ملاحظة : التفاعلات الخلوية مع ألياف مرئية بسهولة على electrospinning coverslips methacrylated الزجاج. أيضا ، يمكن أن تستخدم مرة أخرى MeRho لرؤية الألياف.
- والسقالات في احتضان PBS بين عشية وضحاها لضمان الإزالة التامة للالمذيبات وأي المرتشحة ممكن من المنتجات.
- إزالة برنامج تلفزيوني من الآبار.
- لتعقيم السقالات ، ووضعهم تحت مصباح مبيد للجراثيم في التدفق الصفحي غطاء لمدة 30 دقيقة. إذا كان يتم المصنف سقالة كاملة ، والوجه أكثر من السقالة ومكان تحت مصباح مبيد للجراثيم لمدة 30 دقيقة.
- أداء قياسي خلية ثقافة ويعد تعليق خلية تتركز في كثافة الخلايا المطلوبة (على سبيل المثال ، 6000 الطول الخلايا -2). على سبيل المثال ، استخدم 100 مل من التعليق الخلية عن 22 مم X 22 مم ساترة. مكان في الحاضنة لمدة 1 ساعة.
- أضف الكمية المناسبة من وسائل الإعلام إلى كل خلية ثقافة أيضا. وضع السقالات العودة إلى الحاضنة.
- وصمة عار على استخدام عدة خلايا متاحة تجاريا لايف / الميت. ملاحظة : يمكن تطبيق أنواع أخرى من تلطيخ الخلية ، مثل دابي (نواة الخلية) وphalloidin fluorescently المسمى (ألياف الأكتين الإجهاد) لتصور الخلايا.
- تصور خلايا وألياف باستخدام المجهر الفلورسنت مجهزة بمرشحات لTRITC وFITC. انظر المثال في الشكل 4.
ممثل النتائج :
الشكل 1. تخطيطي يوضح الإعداد لتشكيل جهاز سقالة عدم الانحياز (أعلى) ومحاذاة سقالة تشكيل (القاع). وترد سبيل المثال المجهر الإلكتروني الماسح الصور لكل نوع من السقالة. مقياس شريط = 5μm. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.
الشكل 2. تخطيطي طريقة الزخرفة. تتشكل أنماط بوضع الضوئية الرئيسية بين مصدر الضوء وسقالة أثناء photocrosslinking ثم تجرف البوليمر غير المتفاعل. الضوئية الرئيسية وSEM صورة السقالات بعد تشكيل المسام وlyophilization. مقياس بار = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2.
الشكل 3 تخطيطي لإعداد electrospinning متعددة البوليمر والمعلمات اللازمة لمعالجة البيانات ، وكذلك صورة ممثل الفلورسنت من خليط من السكان من الألياف اثنين (على سبيل المثال : MeHA الحمراء والزرقاء PEO). electrospun في نفس الوقت التي كانت لتشكل سقالة متعددة البوليمر . مقياس بار = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لرؤية أكبر versioن من الشكل 3.
الشكل 4. تلطيخ صورة مثال لايف / الميت من خلايا الجذعية الوسيطة وتفاعلاتها مع الألياف electrospun. مقياس بار = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كان يستخدم لإعداد Electrospinning السقالات ليفية من البوليمرات. Photocrosslinkable السقالات على أساس حمض الهيالورونيك استخدمت كمثال توضيحي ، حيث هناك حاجة إلى التعرض للضوء ليشابك. مع استخدام macromers رد الفعل ، مثل MeHA ، أدرجت القنوات التي أثبتت سابقا التوزيع المعززة الخلوية في السقالات مع استخدام قناع خلال photocrosslinking السقالات لتشكل الكلي والجزئي التي يسهل اختراقها. علاوة على ذلك ، كان اثنان البوليمرات متميزة في وقت واحد باستخدام جهاز electrospun عادتنا. تم التحقق من وجود المجموعتين السكانيتين الألياف متميزة مع إضافة صبغة الفلورسنت لelectrospinning كل حل ، والتي كان ينظر إليها في وقت لاحق باستخدام المجهر الفلورسنت. ويمكن استخدام متعددة البوليمر السقالات لتعزيز التوزيع الخلوية ، فضلا عن أفضل توليف الميكانيكا وتدهور سقالة لتطبيق معين نسبة إلى واحد السقالات electrospun البوليمر. وعلاوة على ذلك ، فقد ثبت التعقيم وبذر خلية من السقالات. كثير من هذه التقنيات هي متعددة الاستعمالات ويمكن استخدامها لمجموعة واسعة من البوليمرات المختلفة لافتعال السقالات متنوعة للتطبيقات في هندسة الأنسجة وثقافة من الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الاميركية زمالة Predoctoral لمبادرة التعلم المشتركة والمعاهد الوطنية للمنح R01AR056624 هيث.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Reagent | Invitrogen | D1306 | |
| I2959 | Reagent | Ciba Specialty Chemicals | ||
| PEO 200 kDa | Polysciences, Inc. | 17503 | ||
| PEO 900 kDa | Reagent | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Reagent | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Live/Dead Stain Kit | Reagent | Invitrogen | L3224 | Contains Calcein (stains live cells green) and ethidium homodime (stains red dead cells) |
| Syringe Pump | Equipment | KD Scientific | KDS100 | Two are needed for dual polymer spinning |
| Power Source | Equipment | Gamma High Voltage | ES30P-5W | Two are needed for dual polymer spinning |
| Motor | Equipment | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Equipment | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | Equipment | EXFO | S1000 | |
| Silicone Tubing | Equipment | McMaster-Carr | 51135K151 | |
| Luer Lock Female Adapter | Equipment | McMaster-Carr | 51525K293 | |
| Luer Lock Male Adapter | Equipment | McMaster-Carr | 51525K143 | |
| Needles | Equipment | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Equipment | Corning | 2875-22 |
References
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers. Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).
- Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).
- Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment. J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).
- Mauck, R. L., Baker, B. M., Nerurkar, N. L., Burdick, J. A., Li, W. J., Tuan, R. S., Elliott, D. M., M, D. Engineering on the Straight and Narrow: The Mechanics of Nanofibrous Assemblies for Fiber-Reinforced Tissue Regeneration. Tissue Engineering B. 15, 171-193 (2009).
- Sill, T. J., Von Recum, H. avon Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity. , Forthcoming (2009).
