Summary
Il processo di electrospinning polimeri per l'ingegneria tissutale e colture cellulari è affrontato in questo articolo. In particolare, il electrospinning di macromers fotoreattivo con capacità di elaborazione aggiuntive di photopatterning e multi-polimero electrospinning è descritto.
Abstract
Poiché il campo dell'ingegneria tissutale evolve, c'è un'enorme richiesta per produrre materiali più idonei e tecniche di lavorazione al fine di affrontare le esigenze (ad esempio, la meccanica e vascolarizzazione), di organi e tessuti più intricate. Electrospinning è una tecnica popolare per creare ponteggi fibroso che imitano l'architettura e la scala di grandezza della matrice extracellulare nativa. Queste impalcature fibroso sono utili anche come substrato di coltura cellulare in quanto le fibre possono essere utilizzati per dirigere il comportamento cellulare, quali la differenziazione delle cellule staminali (vedi un'esauriente recensione di Mauck
Protocol
A. singolo Polymer Electrospinning
- Prima di preparare la soluzione electrospinning, fare una soluzione di 0,5% in peso del fotoiniziatore, Irgacure 2959 (I2959), in acqua deionizzata, sciogliendo a 37 ° C per diversi giorni. Questo passaggio non è necessario se un polimero fotoreattivo non viene utilizzato.
- Combina methacrylated acido ialuronico (Meha, vedere Burdick et al. Per la sintesi), poli (ossido di etilene) (PEO, 900 kDa), e I2959 in acqua deionizzata per preparare una soluzione con una concentrazione finale del 2% in peso Meha, 3% in peso PEO e 0,05% in peso I2959. Utilizzare un vortice per miscelare la soluzione fino a quando non è chiaro. Il tipo di polimero e la concentrazione, così come l'uso di solventi possono essere modificati in questa fase a seconda delle proprietà desiderate patibolo.
- Trasferire la soluzione in una siringa e collegare un manometro 18, 6 pollici lungo, l'ago senza punta fino alla fine.
- Programma di una pompa a siringa per espellere a una velocità di 1,2 ml / ora. Inserire la siringa e l'ago nel dispositivo.
- Collegare il cavo di messa a terra di una sorgente ad alta tensione per l'apparato di raccolta. Per raccogliere le fibre distribuite in modo casuale utilizzare una piastra piana di metallo, o utilizzare un mandrino ruota a ~ 10 m / s per raccogliere le fibre allineate. Collegare il cavo carica positiva per l'ago. Vedere la Figura 1 per uno schema dell'apparato electrospinning.
- Regolare l'ago o dispositivo di raccolta, in modo tale che vi è un 15 cm di distanza tra i due.
- Avviare il flusso della pompa siringa. Quando il fluido è visualizzato sulla punta dell'ago, accendere la sorgente di alimentazione e impostare la tensione a 22 kV.
- Dopo la raccolta è completa (da alcuni minuti di film sottili, fino a 24 ore per una stuoia spessa), rimuovere l'impalcatura dall'apparato raccolta e conservare sotto vuoto durante la notte per garantire la completa rimozione del solvente.
- Visualizzare la morfologia delle fibre mediante microscopia elettronica a scansione (SEM), un ponteggio rappresentante è mostrata in Figura 1 per entrambe le strutture allineati e non allineati.
Nota: La portata del campione, a distanza di dispositivi di raccolta, e la tensione dipendono dalla combinazione di polimeri e solvente e devono essere ottimizzati per ciascun sistema, di solito osservando la morfologia patibolo con SEM.
B. Photocrosslinking e Photopatterning
- Tagliare 5 millimetri campioni x 5mm dal tappetino patibolo.
- Preparati per reticolazione mettendo ogni impalcatura su un foglio coperto vetrino, mettendo il fotomaschera direttamente sul patibolo, coprendo con un vetrino pulito e ritaglio entrambe le estremità con clip legante. Nota: quattro campioni può essere fatto in una sola volta, ed una trasparenza senza uno schema può essere usato per reticolazione se un modello non è desiderato.
- Purge dell'impalcatura in una camera di azoto. E 'importante mantenere il costrutto privo di ossigeno, che possono inibire la reticolazione.
- Luogo di installazione ponteggio in camera di azoto sotto ~ 10 mW / cm 2 luce 365 nm con un adattatore di collimazione per 5 minuti. Vedi schema in Figura 2.
- Rimuovere ogni impalcatura e mettere in un piatto ben 12.
- Aggiungere 2 ml di acqua deionizzata in ciascun pozzetto, parafilm la piastra per impedire l'evaporazione dell'acqua e posto a 37 ° C per 24 ore. Cambiare l'acqua tre volte.
- Visualizza formazione di pori sotto microscopio ottico (vedi esempio in Figura 2). Le impalcature sono ora pronti per l'uso.
Nota: Photocrosslinking non è necessario per molti tipi di polimeri, tuttavia photopatterning può essere utilizzato solo con polimeri fotoreattivo.
C. doppio polimero Electrospinning con visualizzazione fluorescente Fibra
- Preparare una soluzione al 5% in peso di PEO (200 kDa) nel 90% di etanolo. Mescolate a 700 giri al minuto a 50 ° C per almeno 2 ore prima electrospinning.
- Trasferire la soluzione PEO a una siringa e aggiungere DAPI per una concentrazione finale di 10 mg / mL concentrazione nella soluzione electrospinning. Avvolgere la siringa in un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce.
- Preparare la stessa soluzione descritta in A2 dopo passo, ad eccezione di aggiungere anche methacryloxyethyl thiocarbamoyl rodamina B (MeRho, 683,24 g / mol) per una concentrazione finale di 25 mM nella soluzione electrospinning. Avvolgere la siringa in un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce.
- Usare con attenzione nastro adesivo per fissare coprioggetto di vetro methacrylated (vedi Khademhosseini et al.) Alla superficie del mandrino. Nota: le fibre saranno legati a coprioggetto di vetro methacrylated.
- Collegare un'estremità di un pezzo di 5 mm di tubo in silicone con attacchi luer lock ad una delle siringhe e collegare l'altra estremità ad un ago. Inserire la siringa nella pompa a siringa e inserire l'ago attraverso il foro il contadino. Ripetere con l'altra siringa e coltivatore sul lato opposto del mandrino. Il sventagliatori tradurre il llength del mandrino e vengono utilizzati per garantire un'equa distribuzione di entrambi i polimeri della risultante patibolo. Vedi schema in Figura 3.
- Regolare i parametri descritti nella sezione A appropriato in base alla tabella 1. Assicurarsi che le punte aghi sono centrate sul mandrino.
Tabella 1. Doppio polimero Electrospinning ParametriSiringa Fanner alla punta dell'ago (cm) La punta dell'ago a Mandrino (cm) Portata (ml / ora) Applicata tensione (kV) Meha 6 15 1,2 22 PEO 6 10 1,2 15 - Una volta che tutto è allineato correttamente, spegnere le luci e accendere il mandrino e le pompe siringa. Rimuovere il foglio di alluminio da siringhe. Quando il fluido è visibile sulla punta dei due aghi, contemporaneamente accendere l'alimentazione e collegare il sventagliatori.
- Quando la raccolta è completa, spegnere l'alimentazione e mandrino e scollegare il sventagliatori. Rimuovere con attenzione i coprioggetti e nastro con una lama di rasoio.
- Visualizza le fibre utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri per la rodamina e DAPI. Vedi esempio in Figura 3. Nota: le fibre fluorescenti sono più chiare per vedere se elettrofilate per brevi periodi di tempo (<3 minuti), tuttavia, questo processo può essere prolungato per un numero illimitato di tempo per creare spesse costrutti, soprattutto senza l'uso del vetro coprioggetto .
Cellule Semina il D. Ponteggi
- Posizionare ogni coprioggetto con elettrofilate polimero allegato in un individuo ben di una piastra di dimensioni appropriate bene. Nota: interazioni cellulari con le fibre sono facilmente visibili da electrospinning sul coprioggetto di vetro methacrylated. Inoltre, MeRho può ancora essere utilizzato per la visualizzazione delle fibre.
- Incubare i ponteggi in PBS durante la notte per garantire la completa rimozione del solvente e qualsiasi rilasciabili possibili sottoprodotti.
- Rimuovere la PBS dai pozzetti.
- Per sterilizzare i ponteggi, li posto sotto una lampada germicida in una cappa a flusso laminare per 30 minuti. Se una completa patibolo è stato seminato, capovolgere il patibolo sopra e posto sotto una lampada germicida per altri 30 minuti.
- Eseguire cultura cella standard e preparare una sospensione concentrata cella la densità cellulare desiderato (ad esempio, 6.000 cellule cm -2). Ad esempio, utilizzare un 100 ml di sospensione cellulare per un mm 22 X 22 coprioggetto mm. Posto in incubatrice per 1 ora.
- Aggiungere la quantità appropriata di terreni di coltura di cellule in ciascun pozzetto. Posizionare i ponteggi nuovamente dentro l'incubatrice.
- Macchia le cellule utilizzando un kit disponibile in commercio Live / Dead. Nota: altri tipi di colorazione delle cellule, come il DAPI (nuclei cellulari) e fluorescente falloidina (fibre di actina di stress) possono essere applicati per visualizzare le cellule.
- Visualizzare le cellule e le fibre utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri per TRITC e FITC. Vedi esempio in Figura 4.
Rappresentante dei risultati:
Figura 1. Schematica che illustra la configurazione del dispositivo per i non-allineati formazione ponteggio (in alto) e allineato la formazione di ponteggi (in basso). Esempio di microscopia elettronica a scansione di immagini di ogni tipo di ponteggio sono mostrati. Barra di scala = 5 micron. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 1.
Figura 2. Schematica del metodo di patterning. I modelli sono formate mettendo un fotomaschera tra la sorgente di luce e impalcatura durante photocrosslinking e poi lavando via polimero non reagito. Immagine fotomaschera e SEM di ponteggi dopo la formazione dei pori e liofilizzazione. Barra di scala = 100 micron. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 2.
Figura 3 Schema del multi-polimero configurazione elettrofilatura e parametri di lavorazione necessari, così come un'immagine rappresentativa fluorescente di una miscela di due popolazioni di fibre (esempio: rosso e blu Meha PEO). Cui sono stati contemporaneamente elettrofilate per formare un multi-polimero ponteggio . Barra di scala = 100 micron. Si prega di cliccare qui per vedere una grande Version di figura 3.
Figura 4. Un esempio Live / Dead immagine colorazione delle cellule staminali mesenchimali e le loro interazioni con le fibre elettrofilate. Barra di scala = 100 micron. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 4.
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Discussion
Electrospinning utilizzata per preparare i ponteggi fibroso da polimeri. Photocrosslinkable ponteggi a base di acido ialuronico sono stati utilizzati a titolo esemplificativo, in cui è necessaria l'esposizione alla luce per la reticolazione. Con l'uso di macromers reattivo, ad esempio Meha, i canali che hanno già dimostrato una maggiore distribuzione cellulare sono stati incorporati nel ponteggi con l'uso di una maschera durante photocrosslinking per formare impalcature macro e micro-porosa. Inoltre, due polimeri diversi sono stati contemporaneamente elettrofilate utilizzando il nostro apparato personalizzati. La presenza di due popolazioni distinte di fibre è stata verificata con l'aggiunta di un colorante fluorescente per ogni soluzione electrospinning, che è stato successivamente visualizzati con un microscopio a fluorescenza. Multi-polimero ponteggi possono essere utilizzate per migliorare la distribuzione cellulare, così come meglio sintonizzare la meccanica e il degrado di un ponteggio per un'applicazione particolare in relazione alla singola polimero ponteggi elettrofilate. Inoltre, la sterilizzazione e la semina delle cellule dei ponteggi è stata dimostrata. Molte di queste tecniche sono versatili e possono essere utilizzati per una serie di diversi polimeri per fabbricare diversi ponteggi per applicazioni in ingegneria dei tessuti e per la coltura di cellule.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una Fellowship dell'American Heart Association Predoctoral di JLI e istituti nazionali di Heath concedere R01AR056624.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Reagent | Invitrogen | D1306 | |
| I2959 | Reagent | Ciba Specialty Chemicals | ||
| PEO 200 kDa | Polysciences, Inc. | 17503 | ||
| PEO 900 kDa | Reagent | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Reagent | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Live/Dead Stain Kit | Reagent | Invitrogen | L3224 | Contains Calcein (stains live cells green) and ethidium homodime (stains red dead cells) |
| Syringe Pump | Equipment | KD Scientific | KDS100 | Two are needed for dual polymer spinning |
| Power Source | Equipment | Gamma High Voltage | ES30P-5W | Two are needed for dual polymer spinning |
| Motor | Equipment | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Equipment | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | Equipment | EXFO | S1000 | |
| Silicone Tubing | Equipment | McMaster-Carr | 51135K151 | |
| Luer Lock Female Adapter | Equipment | McMaster-Carr | 51525K293 | |
| Luer Lock Male Adapter | Equipment | McMaster-Carr | 51525K143 | |
| Needles | Equipment | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Equipment | Corning | 2875-22 |
References
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers. Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).
- Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).
- Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment. J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).
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- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity. , Forthcoming (2009).
