Summary
Процесс электропрядения полимеров для тканевой инженерии и клеточной культуры рассматривается в данной статье. В частности, электропрядения из фотореакционноспособных macromers с дополнительными возможностями обработки photopatterning и мульти-полимерный электропрядения описано.
Abstract
Как области тканевой инженерии развивается, есть огромный спрос, чтобы произвести больше подходящие материалы и методы обработки в целях удовлетворения требований (например, механиков и кровоснабжение) более сложные органы и ткани. Электропрядения является популярная техника для создания волокнистых строительные леса, которые имитируют архитектуру и размер масштаба родной внеклеточного матрикса. Эти волокнистые лесов могут быть также использованы в качестве субстратов культуре клеток с волокнами могут быть использованы для прямого сотовой поведения, включая дифференциацию стволовых клеток (см. обширные обзоры Mauck
Protocol
А. Одноместный Полимерные электропрядения
- До подготовки электропрядения решение, сделать 0,5% решение фотоинициатора, Irgacure 2959 (I2959), в деионизированной водой, растворяя при температуре 37 ° С в течение нескольких дней. Этот шаг не является необходимым, если фотореакционноспособных полимер не используются.
- Комбинат methacrylated гиалуроновой кислоты (MeHA см. Бердик и соавт. Синтеза), поли (этилен оксид) (ПЭО, 900 кДа) и I2959 в деионизированной воды для приготовления раствора с конечной концентрации 2% по весу MeHA, 3% по весу ПЭО, и 0,05% I2959. Используйте вихрь смешивать раствор, пока не ясно. Типа полимера и концентрации, а также растворитель, используемый может быть изменена на этом этапе в зависимости от требуемых свойств лесов.
- Перенесите раствор в шприц и присоедините 18 калибра, 6 дюйма длиной, тупой конец стрелки до конца.
- Программа шприцевой насос, чтобы извлечь из расчета 1,2 мл / час. Вставьте шприц и иглу в устройстве.
- Прикрепить обоснованные примеру источник высокого напряжения в коллекцию аппарата. Для сбора случайным образом распределены волокна использовать металлическую пластину, или использовать оправки вращающихся на ~ 10 м / с для сбора выровнены волокон. Прикрепить положительно заряженные привести к игле. См. рисунок 1 для схема электропрядения аппарата.
- Отрегулируйте иглы или сбора устройства, например, что есть расстоянии 15 см между ними.
- Начало течения на шприцевой насос. Когда жидкость визуализируется на кончике иглы, включите источник питания и установить напряжение до 22 кВ.
- После завершения коллекции (от нескольких минут для тонких пленок, чтобы до 24 часов для толще циновка), снять строительные леса из коллекции аппарата и хранить его под вакууме в течение ночи, чтобы обеспечить полное удаление растворителя.
- Визуализация морфологии волокна с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM), представитель эшафот показано на Рисунке 1 как для выравнивания и неприсоединившихся структур.
Примечание: расход пробы, расстояние до коллекцию устройства, и напряжение в зависимости от полимера и растворителя комбинация и должна быть оптимизирована для каждой системы, как правило, путем наблюдения морфологии эшафот с SEM.
Б. Photocrosslinking и Photopatterning
- Вырежьте 5 мм х 5 мм образцы из мата эшафот.
- Подготовка для сшивания, помещая каждую эшафот на фольги, покрытой стекло, размещение фотошаблон непосредственно на эшафот, покрывая чистую предметное стекло и обрезки обоих концах зажимы. Примечание: четыре образца может быть сделано сразу, и прозрачности без шаблон может использоваться для сшивания, если шаблон не желательно.
- Чистки эшафот создана в азоте камеры. Важно сохранить построить свободный от кислорода, который может подавлять сшивания.
- Место установки лесов азотом камере под ~ 10 мВт / см 2 365 нм свет с коллимирующей адаптер на 5 минут. См. схему на рисунке 2.
- Удалите каждую эшафот и место в 12-луночного планшета.
- Добавьте 2 мл деионизованной воды в каждую лунку, парафильмом пластина для предотвращения испарения воды и место при 37 ° С в течение 24 часов. Меняйте воду в три раза.
- Визуализируйте порообразования под световым микроскопом (см. пример на рисунке 2). Строительные леса в настоящее время готова к использованию.
Примечание: Photocrosslinking не является необходимым для многих типов полимеров, однако photopatterning могут быть использованы только с фотореакционноспособных полимеров.
C. Двойная Полимерные электропрядения с Флуоресцентный волоконно Визуализация
- Подготовка 5 мас% раствор ПЭО (200 кДа) в 90% этанола. Движение при 700 оборотов в минуту при 50 ° С в течение по крайней мере за 2 часа до электропрядения.
- Перенесите раствор ПЭО в шприц и добавить DAPI для конечной концентрации 10 мг / мл в концентрации электропрядения решение. Оберните шприц в алюминиевой фольгой для защиты от света.
- Подготовка же решение описано в шаге А2, за исключением также добавить methacryloxyethyl тиокарбамоил родамина B (MeRho, 683,24 г / моль) для конечной концентрации 25 мкМ в электропрядения решение. Оберните шприц в алюминиевой фольгой для защиты от света.
- Осторожно использовать скотч для обеспечения methacrylated покровные стекла (см. Khademhosseini и др.). К поверхности оправки. Примечание: волокна станут привязанным к methacrylated покровные стекла.
- Подключите один конец 5 мм длинный кусок силиконовой трубки с вложениями Luer Lock с одним из шприца и прикрепите другой конец иглы. Вставьте шприц в шприцевой насос и поставить иглу через отверстие в веялка. Повторите с другой шприц и веялка на противоположной сайт оправки. Fanners переводить лength из оправки и используются для обеспечения равномерного распределения и полимеров в результате эшафот. См. схему на рисунке 3.
- Настройте параметры, описанные в разделе надлежащим в соответствии с таблицей 1. Убедитесь, что игла советы сосредоточены на оправку.
Таблица 1. Двойной Полимерные электропрядения ПараметрыШприц Fanner на кончике иглы (см) Иглы для оправки (см) Скорость потока (мл / ч) Приложенного напряжения (кВ) MeHA 6 15 1,2 +22 ПЭО 6 10 1,2 +15 - Как только все будет выровнен должным образом, выключить свет и включить оправки и шприцевые насосы. Удалить из алюминиевой фольги от шприцев. Когда жидкость видна на кончиках игл и, одновременно включить блоки питания и подключить fanners.
- Когда сбор завершится, выключите источники питания и оправки и отключите fanners. Осторожно удалите покровные и ленту с помощью лезвия бритвы.
- Визуализируйте волокон с использованием флуоресцентного микроскопа оснащен фильтрами для родамин и DAPI. См. пример на рисунке 3. Примечание: Флуоресцентный волокна наиболее четко, чтобы посмотреть, когда electrospun в течение коротких периодов времени (<3 минут), однако этот процесс может быть продлен на неограниченное количество времени, чтобы создать толще конструкции, особенно без использования стекла покровные .
Д. Посев Ячейки Строительные леса
- Место каждого покровное с electrospun полимеров прилагаются в отдельных скважин из соответствующего размера и пластины. Примечание: межклеточных взаимодействий с волокнами хорошо видны на электропрядения на methacrylated покровные стекла. Кроме того, MeRho можно снова использовать для волоконно-визуализации.
- Инкубируйте лесов в ФБР всю ночь, чтобы обеспечить полное удаление растворителя и любые возможные выщелачиванию побочных продуктов.
- Удалить PBS из скважин.
- Для стерилизации леса, поставить их под бактерицидной лампой в ламинарном потоке на 30 минут. Если полный эшафот в настоящее время отобранный, флип эшафот снова и место под бактерицидной лампой в течение еще 30 минут.
- Выполните стандартных клеточных культур и подготовить концентрированный суспензии клеток в нужную ячейку плотности (например, 6000 клетки см -2). Например, можно использовать 100 мл клеточной суспензии для 22 мм Х 22 мм покровным. Место в инкубаторе в течение 1 часа.
- Добавить необходимое количество средств массовой информации культуре клеток в каждую лунку. Место леса обратно в инкубатор.
- Пятно клеток с использованием коммерчески доступных Live / Мертвые комплект. Примечание: другие типы клеток, окрашивание, например, DAPI (клеточных ядер) и флуоресцентно меченных фаллоидином (волокна актина стресс) может быть применена для визуализации клеток.
- Визуализация клеток и волокон с использованием флуоресцентного микроскопа оснащен фильтрами для TRITC и FITC. См. пример на рисунке 4.
Представитель Результаты:
Рисунок 1. Схема иллюстрирующая устройство установки для неприсоединившихся эшафот образования (вверху) и приведены в соответствие эшафот образование (внизу). Пример растровой электронной микроскопии изображений каждого типа леса представлены. Шкала бар = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.
Рисунок 2. Схема структурирования метод. Шаблоны формируются путем размещения фотошаблона между источником света и леса во время photocrosslinking а затем смывая непрореагировавшего полимера. Photomask и СЭМ изображения строительных лесов после образования пор и лиофилизации. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 2.
Рисунок 3 Схема мульти-полимерный электропрядения установки и необходимые параметры обработки, а также представитель флуоресцентное изображение смесь двух волокна групп населения (например: красный и синий MeHA ПЭО). Которые одновременно electrospun сформировать мульти-полимерные строительные леса . Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенное versioп рисунке 3.
Рисунок 4. Пример Live / Мертвые окрашивания образ мезенхимальных стволовых клеток человека и их взаимодействия с electrospun волокон. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Электропрядения был использован для подготовки волокнистых леса из полимеров. Photocrosslinkable лесов на основе гиалуроновой кислоты были использованы в качестве наглядного примера, где освещенность нужна для сшивания. С помощью реактивного macromers, таких как MeHA, каналы, которые ранее продемонстрировали расширение сотовой распределения были включены в строительные леса с использованием маски во время photocrosslinking для формирования макро-и микро-пористых строительные леса. Более того, два различных полимеров были одновременно electrospun используя наш обычай аппарата. Наличие двух различных популяций волокно было проверено с добавлением флуоресцентного красителя для каждого электропрядения решение, которое позднее было просмотреть с помощью флуоресцентного микроскопа. Multi-полимер строительные леса могут быть использованы для повышения сотовой распределения, а также лучше настраивать механики и деградации лесов для конкретного применения по отношению к одной полимера electrospun лесов. Кроме того, стерилизация и клеточной посев леса была продемонстрирована. Многие из этих методов являются универсальными и могут использоваться для целого ряда различных полимеров для изготовления разнообразных лесов для использования в тканевой инженерии и для культуры клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана американской ассоциации сердца Predoctoral стипендий для JLI и Национального института Хит грант R01AR056624.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Reagent | Invitrogen | D1306 | |
| I2959 | Reagent | Ciba Specialty Chemicals | ||
| PEO 200 kDa | Polysciences, Inc. | 17503 | ||
| PEO 900 kDa | Reagent | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Reagent | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Live/Dead Stain Kit | Reagent | Invitrogen | L3224 | Contains Calcein (stains live cells green) and ethidium homodime (stains red dead cells) |
| Syringe Pump | Equipment | KD Scientific | KDS100 | Two are needed for dual polymer spinning |
| Power Source | Equipment | Gamma High Voltage | ES30P-5W | Two are needed for dual polymer spinning |
| Motor | Equipment | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Equipment | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | Equipment | EXFO | S1000 | |
| Silicone Tubing | Equipment | McMaster-Carr | 51135K151 | |
| Luer Lock Female Adapter | Equipment | McMaster-Carr | 51525K293 | |
| Luer Lock Male Adapter | Equipment | McMaster-Carr | 51525K143 | |
| Needles | Equipment | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Equipment | Corning | 2875-22 |
References
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers. Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).
- Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).
- Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment. J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).
- Mauck, R. L., Baker, B. M., Nerurkar, N. L., Burdick, J. A., Li, W. J., Tuan, R. S., Elliott, D. M., M, D. Engineering on the Straight and Narrow: The Mechanics of Nanofibrous Assemblies for Fiber-Reinforced Tissue Regeneration. Tissue Engineering B. 15, 171-193 (2009).
- Sill, T. J., Von Recum, H. avon Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity. , Forthcoming (2009).
