Summary
조직 공학 및 세포 배양을위한 폴리머를 electrospinning의 과정은이 문서에서 해결되었습니다. 특히 photopatterning 멀티 고분자 electrospinning의 추가 처리 능력과 photoreactive macromers의 electrospinning이 설명되어 있습니다.
Abstract
조직 공학 분야는 진화로 더 복잡한 장기와 조직의 요구 사항 (예, 기계 부품과 vascularity) 주소 위해 더 적합한 소재 및 가공 기술을 생산하기 위해 엄청난 수요가있다. Electrospinning는 원래 세포외 기질의 구조 및 크기의 규모를 모방 섬유 공사장 공중 발판을 만드는 인기있는 기술입니다. 섬유 줄기 세포 분화 (Mauck하여 광범위한 리뷰보기 포함한 세포 동작을 직접하는 데 사용될 수 있기 때문에 이러한 섬유 공사장 공중 발판은 또한 세포 배양 기판으로 유용합니다
Protocol
A. 단일 폴리머 Electrospinning
- 전에 electrospinning 솔루션을 준비하기 위해 몇 일 동안 37 ° C를 용해하여 탈이온수에 photoinitiator의 0.5 % WT의 솔루션, Irgacure 2959 (I2959)를 확인하십시오. photoreactive 폴리머가 사용되고 있지 않으면이 단계는 필요하지 않습니다.
- 이 WT % MeHA 3 WT %의 최종 농도와 솔루션을 준비하는 methacrylated hyaluronic 산 (MeHA, 버딕 외를 참조하십시오. 합성), 폴리 (에틸렌 옥사이드) (PEO, 900 KDA), 그리고 탈이온수에 I2959을 결합 PEO, 그리고 0.05 % WT의 I2959. 그것이 명확 때까지 솔루션을 혼합하는 소용돌이를 사용합니다. 폴리머 종류와 농도뿐만 아니라 용제 사용은 원하는 발판 특성에 따라이 단계에서 수정할 수 있습니다.
- 주사기로 솔루션을 전송하고 끝까지 18 게이지, 길이 6 인치, 뭉툭한 끝 바늘을 첨부합니다.
- 1.2 ML / HR의 속도로 추출 프로그램에 주사기 펌프. 장치에 주사기와 바늘을 삽입합니다.
- 수집 장치에 높은 전압 전원의 접지 리드를 연결합니다. 무작위로 배포 섬유가 평면 금속 접시를 사용하여 수집하거나, 정렬 섬유를 수집하는 ~ 10m / s의 회전 심봉를 사용할 수 있습니다. 바늘에 긍정적으로 부과 리드를 연결합니다. electrospinning 장치의 구조도 1 그림을 참조하십시오.
- 둘 사이에 15cm 거리가되는 등 바늘이나 수집 장치를 조정합니다.
- 주사기 펌프의 흐름을 시작합니다. 액체가 바늘 끝 시각 경우, 전원 켜고 22 KV로 전압을 설정합니다.
- 컬렉션 (박막 몇 분 거리에 두꺼운 매트를 위해 최대 24 시간) 완료 후 수집 장치에서 비계를 제거하고 그것은 용매의 완전한 제거를 위해 밤새 진공 아래에 저장합니다.
- 스캐닝 전자 현미경 (SEM)를 사용하여 섬유 형태를 시각화, 대표 발판 양쪽 정렬이 아닌 정렬된 구조에 대한 그림 1에 표시됩니다.
참고 : 샘플 유량, 수집 장치로 거리와 전압이 폴리머와 용매 조합에 의존하고 있으며 일반적으로 SEM과 발판의 형태를 관찰하여 각 시스템에 최적화된해야합니다.
B.의 Photocrosslinking 및 Photopatterning
- 발판 매트에서 5mm X 5mm 샘플을 잘라 버릴거야.
- 유리 슬라이드를 덮고 호일에있는 각 발판을 놓는 발판에서 직접 photomask를 삽입, 깨끗한 유리 슬라이드로 덮개와 바인더 클립 양쪽을 클리핑하여 crosslinking 준비. 참고 : 네 샘플을 한번에 할 수 있으며, 패턴이 원하는되지 않은 경우 패턴이없는 투명성이 crosslinking 사용할 수 있습니다.
- 정리 발판은 질소 챔버에 설정할 수 있습니다. crosslinking을 억제 할 수 산소에서 만들 무료 유지하는 것이 중요합니다.
- ~ 10 MW / cm 5 분 collimating 어댑터 2 365 NM 조명 아래에서 질소 챔버에 넣어 비계 설치. 그림 2에서 설계도를 참조하십시오.
- 각각의 발판과 12 잘 접시에 장소를 제거합니다.
- 각 음, parafilm 37 24 시간 동안 ° C의 물 장소 증발을 방지하기 위해 접시에 탈이온수 2 ML을 추가합니다. 물이 세 번 변경합니다.
- 가벼운 현미경 기공 형성 (그림 2의 예제를 참조) 시각화. 공사장 공중 발판을 이제 사용할 준비가되어 있습니다.
참고 : Photocrosslinking는 고분자의 여러 유형, 그러나 photopatterning에만 photoreactive 폴리머와 함께 사용할 수있는 필요하지 않습니다.
형광 광섬유 시각화와 C. 듀얼 폴리머 Electrospinning
- 90 % 에탄올에 PEO (200 KDA)의 5 % WT의 솔루션을 준비합니다. 50 ° C 이전 electrospinning 최소한 2 시간 동안 700 rpm으로 저어.
- 주사기로 PEO 솔루션을 전송하고 electrospinning 솔루션 10 MG / ML 농도의 최종 농도에 대한 DAPI를 추가합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일에 주사기를 넣어.
- electrospinning 솔루션에 25 μm의의 최종 농도에 대한 methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B을 (MeRho, 683.24 g / 몰) 추가는 제외하고, 단계 A2에서 설명하는 동일한 솔루션을 준비합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일에 주사기를 넣어.
- 조심스럽게 심봉의 표면에 methacrylated 유리 coverslips을 (Khademhosseini 외를 참조하십시오.) 보안에 스카치 테이프를 사용합니다. 참고 : 섬유 methacrylated 유리 coverslips에 닿는 될 것입니다.
- luer 잠금 첨부 파일이있는 주사기 중 하나에 실리콘 튜브의 5mm 긴 조각의 한쪽 끝을 연결하고 바늘로 다른 쪽 끝을 연결합니다. 주사기 펌프에 주사기를 삽입하고 부채질하는 사람에있는 구멍을 통해 바늘을 넣어. 심봉 반대 사이트에서 다른 주사기와 부채질하는 사람과 함께 반복합니다. fanners는 리터 번역심봉의 ength하며 결과 발판 두 고분자의 평등한 분배를 보장하기 위해 사용됩니다. 그림 3에 회로도를 참조하십시오.
- 적절한 표 1에 따라 섹션에 설명된 매개 변수를 조정합니다. 바늘 팁이 심봉 중심 있는지 확인합니다.
표 1. 듀얼 폴리머 Electrospinning 매개 변수주사기 부채질하는 사람으로 니들 팁 (cm) 심봉 (CM)에 니들 팁 유량 (ML / HR) 적용 전압 (KV) MeHA 6 15 1.2 22 PEO 6 10 1.2 15 - 모든이 제대로 정렬되면 불을 끄고 심봉과 주사기 펌프를 켭니다. 주사기에서 알루미늄 호일을 제거합니다. 유체는 두 바늘의 끝부분에 볼 때, 동시에 fanners의 전원 공급 및 플러그 전원을 켜십시오.
- 수집이 완료되면 전원 공급 장치 및 심봉을 해제하고 fanners를 뽑습니다. 조심스럽게 면도날을 사용하여 coverslips와 테이프를 제거합니다.
- rhodamine 및 DAPI에 대한 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 섬유를 시각화. 그림 3의 예제를 참조하십시오. 참고 : 시간 (<3 분)의 짧은 기간 동안 electrospun는하지만,이 과정은 특히 유리 coverslips를 사용하지 않고, 두꺼운 구조를 만들려면 시간의 무제한 연장 수있을 때 볼 수있는 형광 섬유는 대부분 명확하다 .
공사장 공중 발판 D.의 심는 셀
- 개별로 잘 적절하게 크기 잘 접시의 첨부 electrospun 폴리머 각 coverslip를 놓습니다. 참고 : 섬유와 세포 상호 작용이 methacrylated 유리 coverslips에 electrospinning로 쉽게 볼 수 있습니다. 또한, MeRho 다시 섬유 시각화에 사용할 수 있습니다.
- 용매의 완전한 제거 및 부산물 가능한 모든 leachable을 보장하기 위해 하룻밤 PBS에서 공사장 공중 발판을 품어.
- 우물에서 PBS를 제거합니다.
- 공사장 공중 발판을 소독하기 위해 30 분 동안 층류 후드에 살균 램프 하에서 그들을 놓으십시오. 전체 발판이 씨앗을하는 경우, 또 다른 30 분 동안 살균 램프 아래 위에 발판과 장소를 플립.
- 표준 세포 배양을 수행하고 (예 : 6000 전지 cm -2) 원하는 세포 밀도에 집중 세포 현탁액을 준비합니다. 예를 들어, 22mm X 22mm의 coverslip에 대한 세포 현탁액의 100 ML을 사용합니다. 1 시간 동안 인큐베이터에 놓습니다.
- 각 잘하기 위해 세포 배양 매체의 적절한 금액을 추가합니다. 인큐베이터에 다시 공사장 공중 발판을 놓으십시오.
- 상업적으로 사용 가능한 라이브 / 데드 키트를 사용하여 세포를 얼룩. 참고 사항 : DAPI (세포 핵)과 찬란 라벨 phalloidin (굴지 스트레스 섬유)와 같은 세포 얼룩의 다른 유형의 세포를 시각화하기 위해 적용할 수 있습니다.
- 세포 TRITC 및 FITC에 대한 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 섬유를 시각화. 그림 4의 예제를 참조하십시오.
대표 결과 :
그림 1. 비 - 정렬 발판 형성 (상단)과 정렬 발판 형성 (아래)의 장치 설정을 보여주는 도식. 발판의 각 유형의 예 스캐닝 전자 현미경 이미지는 표시됩니다. 스케일 바 = 5μm. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 2. patterning 방식의 도식. 패턴은 photocrosslinking 동안 광원과 발판 사이 photomask을 배치하고 멀리 unreacted 폴리머를 세척하여 형성됩니다. 기공 형성과 lyophilization 후 공사장 공중 발판의 Photomask 및 SEM 이미지. 스케일 바 = 100 μm의. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 3 여러 고분자 electrospinning 설정하고 필요한 처리 매개 변수의 도식뿐만 아니라,이 섬유 집단 (예 : 빨간색 MeHA 및 파랑 PEO)의 혼합의 대표적인 형광 이미지. 멀티 폴리머 비계를 형성하는 동시에 electrospun되었습니다 . 스케일 바 = 100 μm의. 하시기 바랍니다 여기를 클릭하십시오 큰 versio를보고그림 3 N.
그림 4. 인간 mesenchymal 줄기 세포와 electrospun 섬유와의 상호 작용의 예를 들어 데드 / 라이브 얼룩 이미지. 스케일 바 = 100 μm의. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 4의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
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Discussion
Electrospinning는 고분자의 섬유 공사장 공중 발판을 준비하는 데 사용되었다. Photocrosslinkable 빛의 노출이 crosslinking에 대해 필요한 설명의 예제로 사용되었던 hyaluronic 산성에 기반 공사장 공중 발판. 같은 MeHA 같은 반응 macromers의 사용으로 이전에 향상된 세포 분포를 보여준 채널은 매크로와 마이크로 다공성 공사장 공중 발판을 형성 photocrosslinking 동안 마스크를 사용하여 공사장 공중 발판에 통합되었습니다. 또한, 두 개의 폴리머 동시에 우리의 사용자 정의 장치를 사용하여 electrospun되었습니다. 두 개의 섬유 집단의 존재는 나중에 형광 현미경을 사용하여 조회되었습니다 각 electrospinning 솔루션에 형광 염료의 추가와 함께 확인했다. 멀티 고분자 공사장 공중 발판은 셀룰러 유통뿐만 아니라, 단일 중합체 electrospun의 공사장 공중 발판에 비해 특정 응용 프로그램에 더 나은 조정 역학 및 발판의 저하를 개선하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 살균 및 공사장 공중 발판의 세포 시딩이 증명되었습니다. 이러한 기술의 대부분은 다목적하고 조직 공학에 응용 프로그램 및 세포의 문화에 대한 다양한 공사장 공중 발판을 조작하는 다양한 폴리머의 범위에 사용될 수 있습니다.
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Acknowledgments
이 작품은 JLI과 국립 연구소 히스 부여 R01AR056624의에 미국 심장 협회 Predoctoral 원정대에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Reagent | Invitrogen | D1306 | |
| I2959 | Reagent | Ciba Specialty Chemicals | ||
| PEO 200 kDa | Polysciences, Inc. | 17503 | ||
| PEO 900 kDa | Reagent | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Reagent | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Live/Dead Stain Kit | Reagent | Invitrogen | L3224 | Contains Calcein (stains live cells green) and ethidium homodime (stains red dead cells) |
| Syringe Pump | Equipment | KD Scientific | KDS100 | Two are needed for dual polymer spinning |
| Power Source | Equipment | Gamma High Voltage | ES30P-5W | Two are needed for dual polymer spinning |
| Motor | Equipment | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Equipment | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | Equipment | EXFO | S1000 | |
| Silicone Tubing | Equipment | McMaster-Carr | 51135K151 | |
| Luer Lock Female Adapter | Equipment | McMaster-Carr | 51525K293 | |
| Luer Lock Male Adapter | Equipment | McMaster-Carr | 51525K143 | |
| Needles | Equipment | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Equipment | Corning | 2875-22 |
References
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers. Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).
- Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).
- Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment. J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).
- Mauck, R. L., Baker, B. M., Nerurkar, N. L., Burdick, J. A., Li, W. J., Tuan, R. S., Elliott, D. M., M, D. Engineering on the Straight and Narrow: The Mechanics of Nanofibrous Assemblies for Fiber-Reinforced Tissue Regeneration. Tissue Engineering B. 15, 171-193 (2009).
- Sill, T. J., Von Recum, H. avon Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity. , Forthcoming (2009).
