Summary
Het proces van electrospinning polymeren voor tissue engineering en cel cultuur wordt behandeld in dit artikel. In het bijzonder, is de electrospinning van fotoreactieve macromers met extra verwerkingsmogelijkheden van photopatterning en multi-polymeer electrospinning beschreven.
Abstract
Als op het gebied van tissue engineering ontwikkelt, is er een enorme vraag naar meer geschikte materialen en technieken produceren om aan de eisen (bijvoorbeeld mechanica en vasculariteit) van meer ingewikkelde organen en weefsels te pakken. Electrospinning is een populaire techniek om vezelig scaffolds dat de architectuur en de grootte schaal van de inheemse extracellulaire matrix na te bootsen creëren. Deze vezelachtige steigers zijn ook bruikbaar als celkweek substraten, omdat de vezels kan worden gebruikt om cellulaire gedrag direct, inclusief stamcel differentiatie (zie uitgebreide reviews van Mauck
Protocol
A. Single Polymer Electrospinning
- Voorafgaand aan de voorbereiding van de electrospinning oplossing, maak een 0,5 gew% oplossing van de foto-initiator, Irgacure 2959 (I2959) in gedeïoniseerd water door het oplossen van bij 37 ° C gedurende meerdere dagen. Deze stap is niet nodig als een fotoreactief polymeer niet wordt gebruikt.
- Combineer methacrylated hyaluronzuur (Meha, zie Burdick et al.. Synthese), poly (ethyleenoxide) (PEO, 900 kDa), en I2959 in gedeïoniseerd water om een oplossing te bereiden met een uiteindelijke concentratie van 2 gew% Meha, 3 gew% PEO, en 0,05 gew% I2959. Gebruik een vortex om de oplossing te mengen totdat duidelijk is. Het polymeer type en de concentratie, evenals het gebruikte oplosmiddel kan worden gewijzigd op deze stap, afhankelijk van de gewenste eigenschappen schavot.
- Breng de oplossing in een spuit en bevestig een 18 gauge, 6 cm lang, stompe einde naald tot het einde.
- Programma een spuit pomp uit te werpen met een snelheid van 1,2 ml / uur. Steek de spuit en naald in het apparaat.
- Bevestig de geaarde leiding van een hoge spanning stroombron aan de collectie apparaat. Voor het verzamelen van willekeurig verdeelde vezels een vlakke metalen plaat te gebruiken, of gebruik een doorn draaiende op ~ 10 m / s tot uitgelijnde vezels te verzamelen. Bevestig de positief geladen leiden tot de naald. Zie Figuur 1 voor een schematische weergave van de electrospinning apparaat.
- Pas de naald of het verzamelen van apparaat, zoals dat er een 15 cm afstand tussen de twee.
- Start de doorstroming op de injectiepomp. Wanneer vloeistof wordt gevisualiseerd op het punt van de naald, schakelt u de stroombron en stel de spanning naar 22 kV.
- Nadat de collectie is compleet (van enkele minuten voor dunne films, tot maximaal 24 uur voor een dikkere mat), verwijder de steiger van de collectie apparatuur en bewaar het onder vacuüm 's nachts om volledige verwijdering van het oplosmiddel te verzekeren.
- Visualiseer de vezel morfologie met behulp van scanning elektronen microscopie (SEM), is een representatieve steiger weergegeven in Figuur 1 voor zowel uitgelijnd en niet-gebonden structuren.
Opmerking: Het monster debiet, afstand tot collection device, en de spanning zijn afhankelijk van het polymeer en oplosmiddel combinatie en moet geoptimaliseerd voor elk systeem worden, meestal door het observeren van de steiger morfologie met SEM.
B. Photocrosslinking en Photopatterning
- Knip 5mm X 5mm monsters uit het schavot mat.
- Bereid je voor op vernetting door het plaatsen van elke steiger op een folie bedekt glasplaatje, het plaatsen van de fotomasker direct op het schavot, die met een schone glasplaatje en clipping beide uiteinden met bindmiddel clips. Opmerking: vier monsters kan worden gedaan in een keer, en een transparantie zonder een patroon kan gebruikt worden voor verknoping zijn als een patroon is niet gewenst.
- Purge schavot opgericht in een stikstof-kamer. Het is belangrijk om de constructie vrij van zuurstof, wat kan remmen verknoping.
- Plaats steiger setup in stikstof kamer onder ~ 10 mW / cm 2 365 nm licht met een collimeren adapter voor 5 minuten. Zie schema in figuur 2.
- Verwijder elke steiger en plaats in een 12 wells plaat.
- Voeg 2 mL gedeïoniseerd water in elk putje, parafilm de plaat om verdamping van het water en plaats te voorkomen dat bij 37 ° C gedurende 24 uur. Ververs het water drie keer.
- Visualiseer poriën formatie onder licht microscoop (zie voorbeeld in figuur 2). De steigers zijn nu klaar voor gebruik.
Let op: Photocrosslinking is niet nodig voor veel soorten polymeren, maar photopatterning alleen kan worden gebruikt met fotoreactief polymeren.
C. Dual Polymer Electrospinning met TL-Fiber Visualization
- Bereid een 5 gew% oplossing van PEO (200 kDa) in 90% ethanol. Roer bij 700 tpm bij 50 ° C gedurende ten minste 2 uur voor electrospinning.
- Breng de PEO oplossing voor een spuit en voeg DAPI voor een uiteindelijke concentratie van 10 mg / ml-concentratie in de electrospinning oplossing. Wikkel de spuit in aluminiumfolie om het te beschermen tegen licht.
- Bereid de dezelfde oplossing beschreven in stap A2, behalve ook toevoegen methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho, 683,24 g / mol) voor een uiteindelijke concentratie van 25 uM in de electrospinning oplossing. Wikkel de spuit in aluminiumfolie om het te beschermen tegen licht.
- Zorgvuldig gebruiken Scotch tape om methacrylated glas dekglaasjes (zie Khademhosseini et al.). Veilig naar het oppervlak van de doorn. Let op: vezels zal worden vastgebonden om te methacrylated glas dekglaasjes.
- Bevestig een uiteinde van een 5 mm lang stuk van siliconen buis met luer lock gehechtheid aan een van de spuiten en bevestig het andere uiteinde aan een naald. Steek de spuit in de spuit pomp en zet de naald door het gat in de boer. Herhaal dit met de andere spuit en boer aan de andere zijde van de doorn. De boeren de vertaling van de length van de doorn en worden gebruikt om een gelijke verdeling van beide polymeren in het resulterende schavot te verzekeren. Zie schema in figuur 3.
- Pas de parameters beschreven in deel A behoren volgens tabel 1. Zorg ervoor dat de naald tips zijn gericht op de doorn.
Tabel 1. Dual Polymer Electrospinning ParametersInjectiespuit Boer naar Needle tip (cm) Naald Tip om doorn (cm) Flow Rate (ml / uur) Aangelegde spanning (kV) Meha 6 15 1.2 +22 PEO 6 10 1.2 +15 - Als alles goed is uitgelijnd, zet de lichten uit en zet de doorn en de spuit pompen. Haal de aluminiumfolie van de spuiten. Wanneer vloeistof zichtbaar is op de uiteinden van beide naalden, tegelijkertijd zet de voedingen en sluit de boeren.
- Wanneer verzameling compleet is, schakelt u de voedingen en doorn en trek de boeren. Verwijder voorzichtig de dekglaasjes en tape met behulp van een scheermesje.
- Visualiseer de vezels met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met filters voor rhodamine en DAPI. Zie voorbeeld in figuur 3. Let op: fluorescerende vezels zijn het meest duidelijk te zien wanneer electrospun voor een korte periode van tijd (<3 minuten) echter, dit proces kan worden verlengd voor onbepaalde tijd, om dikkere concepten te creëren, in het bijzonder zonder het gebruik van het glas dekglaasjes .
D. Seeding Cellen op Steigers
- Plaats elke dekglaasje met electrospun polymeer bevestigd in een individuele welzijn van een juiste maat goed plaat. Let op: cellulaire interacties met de vezels zijn goed zichtbaar door electrospinning op methacrylated dekglaasjes. Ook kunnen MeRho opnieuw worden gebruikt voor vezels visualisatie.
- 'S nachts Incubeer de steigers in PBS om volledige verwijdering van oplosmiddel en eventuele uitloogbare bijproducten te garanderen.
- Haal de PBS uit de putten.
- Voor het steriliseren van de steigers, leg ze onder een kiemdodende lamp in een laminaire stroming kap voor 30 minuten. Als er een hele steiger wordt gezaaid, draai het schavot over en plaats onder een kiemdodende lamp voor nog eens 30 minuten.
- Voer standaard celcultuur en bereiden een geconcentreerde celsuspensie op de gewenste cel-dichtheid (bv, 6000 cellen cm -2). Gebruik bijvoorbeeld een 100 ml celsuspensie voor een 22 mm X 22 mm dekglaasje aan. Plaats in de incubator voor 1 uur.
- Voeg de juiste hoeveelheid van media voor celkweek aan elke well. Plaats de steigers in de couveuse.
- Vlekken op de cellen met behulp van een commercieel verkrijgbare Live / Dead kit. Let op: andere soorten cellen vlekken, zoals DAPI (celkernen) en fluorescent gelabelde phalloidin (actine stress-vezels) kan worden toegepast op de cellen te visualiseren.
- Visualiseer de cellen en vezels met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met filters voor TRITC en FITC. Zie voorbeeld in figuur 4.
Representatieve resultaten:
Figuur 1. Schematische illustratie van het apparaat setup voor niet-gebonden steiger vorming van (boven) en lijn steiger vorming van (onder). Voorbeeld scanning elektronenmicroscopie foto's van elk type van steigerbuizen worden weergegeven. Schaalbalk = 5 urn. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1 te zien.
Figuur 2. Schematische voorstelling van patronen methode. Patronen worden gevormd door het plaatsen van een masker tussen de lichtbron en de steiger tijdens photocrosslinking en daarna te wassen weg ongereageerd polymeer. Masker en SEM beeld van de steigers na poriën vorming en vriesdrogen. Schaalbalk = 100 micrometer. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 2 te zien.
Figuur 3 Schematische voorstelling van de multi-polymeer electrospinning setup en de noodzakelijke verwerking van parameters, evenals een vertegenwoordiger fluorescerende beeld van een mengsel van twee vezels populaties (bijvoorbeeld: rood en blauw Meha PEO)., Die werden gelijktijdig electrospun om een multi-polymeer steiger vorm . Schaalbalk = 100 micrometer. Gelieve Klik hier om een grotere versio te zienn van figuur 3.
Figuur 4. Een voorbeeld Live / Dead kleuring beeld van de menselijke mesenchymale stamcellen en hun interacties met de electrospun vezels. Schaalbalk = 100 micrometer. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 4 te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Electrospinning werd gebruikt om vezelig steigers te bereiden van polymeren. Fotoverknoopbare steigers op basis van hyaluronzuur werden gebruikt als een illustratief voorbeeld, waar de blootstelling aan licht nodig is voor verknoping. Met het gebruik van reactieve macromers, zoals Meha, waren kanalen die eerder hebben aangetoond dat verbeterde cellulaire distributie opgenomen in de steigers met het gebruik van een masker tijdens photocrosslinking aan macro-en micro-poreuze steigers te vormen. Bovendien werden twee verschillende polymeren gelijktijdig electrospun met behulp van onze eigen apparatuur. De aanwezigheid van de twee verschillende populaties vezel werd gecontroleerd met de toevoeging van een fluorescente kleurstof aan elke electrospinning oplossing, die later werd bekeken met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Multi-polymeer steigers kan worden gebruikt om cellulaire distributie, maar ook beter af te stemmen de mechanica en de afbraak van een steiger voor een bepaalde toepassing met betrekking tot enkele polymeer electrospun steigers te verbeteren. Bovendien heeft sterilisatie en cel zaaien van de steigers is aangetoond. Veel van deze technieken zijn veelzijdig en kan gebruikt worden voor een scala van verschillende polymeren aan diverse steigers fabriceren voor toepassingen in de tissue engineering en voor de cultuur van cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een American Heart Association Predoctorale Fellowship te JLI en National Institutes of Heath verlenen R01AR056624.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Reagent | Invitrogen | D1306 | |
| I2959 | Reagent | Ciba Specialty Chemicals | ||
| PEO 200 kDa | Polysciences, Inc. | 17503 | ||
| PEO 900 kDa | Reagent | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Reagent | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Live/Dead Stain Kit | Reagent | Invitrogen | L3224 | Contains Calcein (stains live cells green) and ethidium homodime (stains red dead cells) |
| Syringe Pump | Equipment | KD Scientific | KDS100 | Two are needed for dual polymer spinning |
| Power Source | Equipment | Gamma High Voltage | ES30P-5W | Two are needed for dual polymer spinning |
| Motor | Equipment | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Equipment | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | Equipment | EXFO | S1000 | |
| Silicone Tubing | Equipment | McMaster-Carr | 51135K151 | |
| Luer Lock Female Adapter | Equipment | McMaster-Carr | 51525K293 | |
| Luer Lock Male Adapter | Equipment | McMaster-Carr | 51525K143 | |
| Needles | Equipment | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Equipment | Corning | 2875-22 |
References
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers. Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).
- Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).
- Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment. J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).
- Mauck, R. L., Baker, B. M., Nerurkar, N. L., Burdick, J. A., Li, W. J., Tuan, R. S., Elliott, D. M., M, D. Engineering on the Straight and Narrow: The Mechanics of Nanofibrous Assemblies for Fiber-Reinforced Tissue Regeneration. Tissue Engineering B. 15, 171-193 (2009).
- Sill, T. J., Von Recum, H. avon Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity. , Forthcoming (2009).
