Summary
תהליך electrospinning פולימרים של הנדסת רקמות והתרבות תא מופנית במאמר זה. באופן ספציפי, electrospinning של macromers photoreactive עם יכולות עיבוד נוסף של photopatterning ורב פולימר electrospinning מתואר.
Abstract
כמו בתחום הנדסת רקמות מתפתחת, יש ביקוש עצום כדי לייצר חומרים מתאימים יותר וטכניקות עיבוד על מנת לענות על הדרישות (למשל, מכניקת כלי הדם) של איברים ורקמות יותר מורכב. Electrospinning היא טכניקה פופולרית כדי ליצור פיגומים סיבי המחקות את הארכיטקטורה ואת קנה המידה של גודל המטריצה תאיים הילידים. אלה פיגומים סיבי מועילות גם מצעים תרבית תאים מאז הסיבים ניתן להשתמש כדי לכוון התנהגות הסלולר, כולל התמיינות בתאי גזע (ראה סקירות נרחבות על ידי Mauck
Protocol
א יחיד פולימר Electrospinning
- לפני הכנת פתרון electrospinning, להפוך 0.5% wt פתרון של photoinitiator, Irgacure 2959 (I2959), במים deionized ידי המסת על 37 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים. שלב זה אינו הכרחי אם פולימר photoreactive לא נמצא בשימוש.
- מערבבים חומצה היאלורונית methacrylated (MeHA, ראה Burdick et al. לסינתזה), פולי (אתילן אוקסיד) (PEO, 900 KDA), ו - I2959 במים deionized להכין פתרון סופי עם ריכוז של 2% wt MeHA, 3% wt PEO, ו 0.05% wt I2959. השתמש מערבולת לערבב עד הפתרון ברור. סוג הפולימר וריכוז, כמו גם בשימוש ממס ניתן לשנות בשלב זה תלוי התכונות הרצויות הפיגום.
- העבר את התמיסה לתוך מזרק וצרף מד 18, 6 אינץ' ארוכה, סוף מחט קהה עד הסוף.
- תוכנית מזרק משאבה להוציא בשיעור של 1.2 מ"ל / שעה. הכנס את מחט המזרק לתוך המכשיר.
- צרף את ההובלה מקורקע של מקור מתח גבוה חשמל מנגנון האיסוף. כדי לאסוף באופן אקראי סיבים מופץ להשתמש לוחית מתכת שטוחה, או להשתמש mandrel מסתובב ב ~ 10 m / s לאסוף סיבים מיושר. צרף להוביל מטען חשמלי חיובי אל המחט. ראה איור 1 עבור סכמטי של המנגנון electrospinning.
- כוון את המחט או מכשיר לאיסוף, כזה שיש מרחק 15 ס"מ בין השניים.
- הפעל את זרימת על משאבת מזרק. כאשר נוזל הוא מדמיין על קצה המחט, להפעיל את מקור הכוח לקבוע את מתח kV 22.
- לאחר איסוף תושלם (מתוך מספר דקות עבור שכבות דקות, עד עד 24 שעות על מחצלת עבה), להסיר את הפיגום מן המנגנון אוסף ולאחסן אותו תחת ואקום לילה על מנת להבטיח הסרה מלאה של הממס.
- דמיינו את המורפולוגיה סיבים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), פיגום נציג מוצג באיור 1 עבור שני מבנים בציר הבלתי מזדהות.
הערה: זרימת קצב דגימה, מרחק למכשיר אוסף, מתח תלויים בשילוב פולימר ממס חייב להיות מותאם עבור כל מערכת, בדרך כלל על ידי התבוננות מורפולוגיה פיגום עם SEM.
ב Photocrosslinking ו Photopatterning
- לגזור 5mm דגימות X 5 מ"מ מהמזרן הפיגום.
- היכונו crosslinking ידי הצבת כל פיגום על נייר מכוסה שקופיות הזכוכית, הצבת photomask ישירות על הפיגום, עם מכסה זכוכית שקופית נקי גזיר בשני הקצוות עם קליפים קלסר. הערה: ארבעה דוגמאות ניתן לעשות זאת בבת אחת, ללא שקיפות דפוס יכול לשמש crosslinking אם דפוס לא רצוי.
- טהר פיגום להגדיר בתא חנקן. חשוב לשמור לבנות ללא חמצן, אשר יכול לעכב crosslinking.
- מקום הפיגום ההתקנה בחדר חנקן תחת ~ 10 mW / cm 2 365 ננומטר אור עם מתאם collimating במשך 5 דקות. ראה סכמטי באיור 2.
- הסר כל פיגום ומניחים צלחת 12 באר.
- הוסף 2 מ"ל של מים לתוך הבאר deionized כל parafilm את הצלחת על מנת למנוע אידוי של המים מקום 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. להחליף את המים שלוש פעמים.
- דמיינו היווצרות נקבוביות תחת מיקרוסקופ אור (ראה לדוגמה איור 2). פיגומים כעת מוכן לשימוש.
הערה: Photocrosslinking אינו הכרחי עבור סוגים רבים של פולימרים, אולם photopatterning ניתן להשתמש רק עם פולימרים photoreactive.
ג Dual פולימר Electrospinning עם ויזואליזציה פלורסנט Fiber
- הכינו 5% wt פתרון של PEO (200 KDA) באתנול 90%. מערבבים בסל"ד 700 ב 50 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות לפני electrospinning.
- מעבירים את הפתרון PEO כדי מזרק ולהוסיף DAPI ריכוז סופי של ריכוז מ"ג / מ"ל 10 בפתרון electrospinning. לעטוף את המזרק בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני האור.
- הכן את הפתרון אותו תיאר A2 צעד, אלא גם להוסיף methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho, 683.24 g / mol) לצורך ריכוז סופי של 25 מיקרומטר בפתרון electrospinning. לעטוף את המזרק בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני האור.
- בזהירות להשתמש נייר דבק כדי לאבטח coverslips זכוכית methacrylated (ראה Khademhosseini et al.) אל פני השטח של mandrel. הערה: סיבים יהיה קשור coverslips זכוכית methacrylated.
- חבר קצה אחד של פיסת זמן של 5 מ"מ צינורות סיליקון עם קבצים מצורפים luer מנעול אחד מזרקים וחבר את הקצה השני מחט. הכנס את המזרק לתוך משאבת מזרק ולשים את המחט דרך החור האיכר. חזור עם המזרק איכר אחרים באתר ההפך mandrel. האברים לתרגם את length של mandrel ו משמשים כדי להבטיח חלוקה שווה של פולימרים הן הפיגום וכתוצאה מכך. ראה סכמטי באיור 3.
- כוונו את הפרמטרים שתוארו בסעיף כראוי לפי טבלה 1. ודא טיפים מחט הם התרכזו mandrel.
טבלה 1. Dual פולימר Electrospinning פרמטריםמזרק האיכר אל המחט עצה (ס"מ) מחט עצה כדי mandrel (ס"מ) קצב הזרימה (מ"ל / שעה) יישומי מתח (kV) MeHA 6 15 1.2 22 PEO 6 10 1.2 15 - פעם הכל מיושר כמו שצריך, לכבות את האורות ולהדליק mandrel לבין משאבות מזרק. הסר את רדיד אלומיניום מן המזרקים. כאשר נוזל גלוי על קצות המחטים שניהם, בו זמנית להפעיל את ספקי כוח לחבר האברים.
- כאשר אוסף שלם, לכבות את ספקי כוח mandrel ונתק את האברים. הסר בזהירות את coverslips קלטת באמצעות סכין גילוח.
- דמיינו את הסיבים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד מסננים עבור rhodamine ו DAPI. ראו דוגמה באיור 3. הערה: סיבים פלורסנט ברורים ביותר כדי להציג כאשר electrospun לתקופות קצרות של זמן (<3 דקות), לעומת זאת, תהליך זה יכול להתארך למשך פרק זמן בלתי מוגבל כדי ליצור מבנים עבה יותר, במיוחד ללא שימוש coverslips זכוכית .
ד מתזמן תאים על פיגומים
- המקום כל coverslip עם electrospun מצורף לתוך פולימר יחיד היטב צלחת בגודל מתאים היטב. הערה: אינטראקציות הסלולר עם הסיבים גלויים בקלות על ידי electrospinning על coverslips זכוכית methacrylated. כמו כן, MeRho יכול שוב לשמש ראיה סיבים.
- דגירה פיגומים ב PBS לילה על מנת להבטיח הסרה מלאה של ממס וכל leachable אפשרי לפי מוצרים.
- הסר את PBS מהבארות.
- כדי לעקר את הפיגומים, למקם אותם מתחת לפנס קוטל חידקים במנדף זרימה למינרית במשך 30 דקות. אם פיגום מלא הוא להיות seeded, להעיף את הפיגום על מקום מתחת לפנס קוטל חידקים לעוד 30 דקות.
- ביצוע תרבית תאים סטנדרטיים להכין ההשעיה תא מרוכזים בצפיפות התא הרצוי (לדוגמא: 6000 תאים -2 ס"מ). לדוגמה, השתמש ב 100 מ"ל של השעיה התא 22 מ"מ X 22 מ"מ coverslip. מקום בחממה במשך שעה 1.
- הוסף את הכמות המתאימה של התקשורת בתרבות התא היטב כל אחד. מניחים את הפיגומים בחזרה לתוך החממה.
- הכתם התאים באמצעות ערכת Live / Dead זמינים מסחרית. הערה: סוגים אחרים של מכתים התא, כגון DAPI (גרעין התא) ו phalloidin שכותרתו fluorescently (סיבי אקטין מתח) יכול להיות מיושם כדי להמחיש את התאים.
- דמיינו את התאים סיבים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד מסננים עבור TRITC ו FITC. ראו דוגמה באיור 4.
נציג תוצאות:
באיור 1. סכמטי המדגים את ההתקנה למכשיר ליצירת פיגום הבלתי מזדהות (למעלה) ו מיושר היווצרות הפיגום (התחתון). סריקה דוגמה אלקטרונים מיקרוסקופית תמונות של כל סוג של פיגום מוצגים. בר סולם = 5μm. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.
איור 2. סכמטי של שיטת דפוסים. דפוסי נוצרות על ידי הצבת photomask בין מקור האור לבין הפיגום במהלך photocrosslinking ואז שטיפת פולימר unreacted. Photomask ו SEM התמונה של פיגומים לאחר היווצרות lyophilization הנקבוביות. בר סולם = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.
איור 3 סכמטי של ההתקנה electrospinning רב פולימר פרמטרים עיבוד הכרחי, כמו גם תמונת פלורסנט נציג מתערובת של שתי האוכלוסיות סיבים (לדוגמה: אדום וכחול MeHA PEO). Electrospun שהיו בעת ובעונה אחת כדי ליצור רב פיגום פולימרי . בר סולם = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לראות versio גדולn של הדמות 3.
איור 4. דוגמה חיה / המלח מכתים תמונה של אדם בתאי גזע mesenchymal ויחסי הגומלין שלהם עם סיבים electrospun. בר סולם = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Electrospinning שימש להכין פיגומים סיבי פולימרים. Photocrosslinkable פיגומים מבוסס על חומצה היאלורונית שימשו דוגמה להמחשה, שבו חשיפה לאור דרוש crosslinking. עם השימוש macromers תגובתי, כגון MeHA, ערוצים הוכיחו בעבר הפצה סלולרית משופרת שולבו פיגומים עם השימוש במסכה במהלך photocrosslinking כדי ליצור פיגומים מאקרו ומיקרו נקבובי. יתר על כן, שני פולימרים שונים היו בו זמנית electrospun באמצעות מנגנון אישית שלנו. הנוכחות של שתי האוכלוסיות סיבים שונים אומתה עם תוספת של פלורסנט לצבוע לפתרון כל electrospinning, אשר נתפסה מאוחר יותר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. Multi-פולימר פיגומים יכול לשמש כדי לשפר את חלוקת התא, וכן לכוון טוב יותר את המכניקה והשפלות של פיגום עבור יישום מסוים ביחס פיגומים פולימר יחיד electrospun. יתר על כן, העיקור זריעת תאים של הפיגומים הוכח. רבים של טכניקות אלה צדדי והוא יכול לשמש עבור מגוון רחב של פולימרים שונים לפברק פיגומים מגוונים עבור יישומים בהנדסת רקמות ועל התרבות של תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי עמיתי American Heart Association Predoctoral כדי JLI ו National Institutes of הית מענק R01AR056624.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Reagent | Invitrogen | D1306 | |
| I2959 | Reagent | Ciba Specialty Chemicals | ||
| PEO 200 kDa | Polysciences, Inc. | 17503 | ||
| PEO 900 kDa | Reagent | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Reagent | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Live/Dead Stain Kit | Reagent | Invitrogen | L3224 | Contains Calcein (stains live cells green) and ethidium homodime (stains red dead cells) |
| Syringe Pump | Equipment | KD Scientific | KDS100 | Two are needed for dual polymer spinning |
| Power Source | Equipment | Gamma High Voltage | ES30P-5W | Two are needed for dual polymer spinning |
| Motor | Equipment | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Equipment | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | Equipment | EXFO | S1000 | |
| Silicone Tubing | Equipment | McMaster-Carr | 51135K151 | |
| Luer Lock Female Adapter | Equipment | McMaster-Carr | 51525K293 | |
| Luer Lock Male Adapter | Equipment | McMaster-Carr | 51525K143 | |
| Needles | Equipment | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Equipment | Corning | 2875-22 |
References
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers. Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).
- Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).
- Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment. J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).
- Mauck, R. L., Baker, B. M., Nerurkar, N. L., Burdick, J. A., Li, W. J., Tuan, R. S., Elliott, D. M., M, D. Engineering on the Straight and Narrow: The Mechanics of Nanofibrous Assemblies for Fiber-Reinforced Tissue Regeneration. Tissue Engineering B. 15, 171-193 (2009).
- Sill, T. J., Von Recum, H. avon Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity. , Forthcoming (2009).
