Summary
Der Prozess der Elektrospinnen Polymere für Tissue Engineering und Zellkulturen ist in diesem Artikel behandelt. Insbesondere wird das Elektrospinnen von photoreaktiven Makromere mit zusätzlichen Verarbeitungsmöglichkeiten Photostrukturierungsverfahren und Multi-Polymer-Elektrospinnen beschrieben.
Abstract
Da der Bereich des Tissue Engineering entwickelt, gibt es eine enorme Nachfrage nach mehr geeigneten Materialien und Verarbeitungstechniken zu produzieren, um die Anforderungen (zB Mechanik und Vaskularität) von mehr komplizierte Organe und Gewebe-Adresse. Elektrospinnen ist eine populäre Technik, um faserige Gerüst, dass die Architektur und die Größe zu skalieren der einheimischen extrazellulären Matrix imitieren zu schaffen. Diese faserigen Gerüste sind auch geeignet als Zellkultursubstraten da die Fasern können verwendet werden, um zelluläre Verhalten direkte, einschließlich Stammzell-Differenzierung (siehe ausführliche Bewertungen von Mauck werden
Protocol
A. einzelnes Polymer Elektrospinnen
- Vor Erstellung des Elektrospinnen Lösung, um eine 0,5% ige Lösung des Photoinitiators, Irgacure 2959 (I2959), in deionisiertem Wasser durch Lösen bei 37 ° C für mehrere Tage. Dieser Schritt ist nicht erforderlich, wenn eine photoreaktive Polymer nicht verwendet wird.
- Kombinieren Sie methacrylierte Hyaluronsäure (Meha, siehe Burdick et al. Zur Synthese), Poly (Ethylenoxid) (PEO, 900 kDa) und I2959 in deionisiertem Wasser, um eine Lösung mit einer Endkonzentration von 2 Gew.% Meha, 3 Gew.% herzustellen PEO und 0,05 wt% I2959. Verwenden Sie einen Wirbel um die Lösung zu mischen, bis es klar ist. Das Polymer Art und Konzentration, sowie das verwendete Lösungsmittel kann bei diesem Schritt je nach gewünschter Gerüst Eigenschaften verändert werden.
- Übertragen Sie die Lösung in eine Spritze und fügen Sie eine 18-Gauge-, 6 Zoll lang, stumpfe Ende needle bis zum Ende.
- Programm eine Spritzenpumpe mit einer Rate von 1,2 ml / h auszuwerfen. Legen Sie die Spritze und Nadel in das Gerät.
- Bringen Sie die geerdete Leitung eines Hochspannungsquelle die Auffangvorrichtung. Zu sammeln zufällig verteilten Fasern eine flache Metallplatte, oder verwenden Sie einen Dorn drehenden bei ~ 10 m / s bis ausgerichteten Fasern zu sammeln. Bringen Sie die positiv geladenen führen, um die Nadel. Siehe Abbildung 1 für eine schematische Darstellung des Elektrospinnen Apparat.
- Stellen Sie die Nadel oder Auffangvorrichtung, so dass es eine 15 cm Abstand zwischen den beiden.
- Starten Sie den Fluss auf die Spritzenpumpe. Wenn Flüssigkeit sichtbar an der Spitze der Nadel, an der Stromquelle einschalten und die Spannung bis 22 kV.
- Nach der Sammlung vollständig ist (von einigen Minuten für dünne Folien, um bis zu 24 Stunden für eine dickere Matte), entfernen Sie das Gerüst aus der Sammlung Gerät und speichern Sie es unter Vakuum über Nacht um die vollständige Entfernung des Lösungsmittels zu gewährleisten.
- Visualisieren Sie die Fasermorphologie mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie (SEM) wird eine repräsentative Gerüst in Abbildung 1 für beide ausgerichtet und blockfreien Strukturen dargestellt.
Hinweis: Der Probendurchsatz, Entfernung zum Auffangvorrichtung und Spannung sind abhängig von der Polymer-und Lösungsmittel-Kombination und muss für jedes System optimiert werden, in der Regel durch die Beobachtung des Gerüstes Morphologie mit SEM.
B. Photovernetzung und Photostrukturierungsverfahren
- Schneiden Sie 5mm x 5mm Proben aus dem Gerüst Matte.
- Bereiten Sie für die Vernetzung, indem jedes Gerüst auf einer Folie abgedeckt Glasträger, indem die Photomaske direkt auf dem Schafott, Abdecken mit einem sauberen Objektträger aus Glas und Clipping an beiden Enden mit Bindemittel Clips. Hinweis: vier Proben können auf einmal gemacht werden und eine Transparenz ohne ein Muster für die Vernetzung verwendet werden, wenn ein Muster nicht erwünscht ist.
- Purge Gerüst eingerichtet in einer Stickstoff-Kammer. Es ist wichtig, dass das Konstrukt frei von Sauerstoff, die eine Vernetzung hemmen können.
- Legen Gerüst Setup in Stickstoff Kammer unter ~ 10 mW / cm 2 365 nm Licht mit einer Kollimation Adapter für 5 Minuten. Siehe Schema in Abb. 2.
- Nehmen Sie jedes Gerüst und in einem 12-Well-Platte.
- Add 2 mL entionisiertes Wasser in jedes Well, Parafilm die Platte, um die Verdampfung des Wassers und bei 37 ° C für 24 Stunden zu verhindern. Wechseln Sie das Wasser dreimal.
- Visualisieren Sie Porenbildung unter dem Lichtmikroskop (siehe Beispiel in Abbildung 2). Die Gerüste sind jetzt einsatzbereit.
Hinweis: Photovernetzung ist nicht notwendig, für viele Arten von Polymeren, aber Photostrukturierungsverfahren nur mit photoreaktiven Polymeren eingesetzt werden.
C. Dual-Polymer Elektrospinnen mit Fluorescent Fiber Visualisierung
- Bereiten Sie eine 5% ige Lösung von PEO (200 kDa) in 90% Ethanol. Es wird bei 700 rpm bei 50 ° C für mindestens 2 Stunden vor dem Elektrospinnen.
- Übertragen Sie die PEO-Lösung mit einer Spritze und fügen DAPI für eine endgültige Konzentration von 10 mg / mL Konzentration in der Elektrospinnen Lösung. Wickeln Sie die Spritze in Aluminiumfolie ein, um sie vor Licht zu schützen.
- Bereiten Sie die gleiche Lösung in Schritt A2 beschrieben, mit Ausnahme auch hinzufügen methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamin B (MeRho, 683,24 g / mol) für eine Endkonzentration von 25 uM in der Elektrospinnen Lösung. Wickeln Sie die Spritze in Aluminiumfolie ein, um sie vor Licht zu schützen.
- Vorsichtig verwenden Tesafilm zu methacrylierte Deckgläser (siehe Khademhosseini et al.) Auf die Oberfläche des Dorns zu sichern. Hinweis: Fasern wird angebunden an methacrylierte Deckgläschen.
- Befestigen Sie das eine Ende eines 5 mm langes Stück Silikonschlauch mit Luer-Lock-Anhänge zu einer der Spritzen und befestigen Sie das andere Ende an eine Nadel. Legen Sie die Spritze in die Spritzenpumpe und setzte die Nadel durch das Loch in der Bauer. Wiederholen Sie mit den anderen Spritze und Bauer auf der gegenüberliegenden Seite des Dorns. Die Bauern übersetzen länge des Dorns und werden verwendet, um eine gleichmäßige Verteilung der beiden Polymeren in der resultierenden Gerüst zu gewährleisten. Siehe Schema in Abbildung 3.
- Passen Sie die Parameter in Abschnitt A entsprechend nach Tabelle 1 beschrieben. Stellen Sie sicher, dass die Nadelspitzen auf dem Dorn zentriert sind.
Tabelle 1. Dual-Polymer Elektrospinnen ParameterSpritze Fanner zu Nadelspitze (cm) Nadelspitze Dorn (cm) Fließrate (ml / hr) Angelegten Spannung (kV) Meha 6 15 1,2 22 PEO 6 10 1,2 15 - Wenn alles richtig ausgerichtet ist, schalten Sie das Licht an und schalten Sie den Dorn und die Spritzenpumpen. Entfernen Sie die Alufolie aus dem Spritzen. Wenn Flüssigkeit sichtbar an den Spitzen der beiden Nadeln ist, gleichzeitig auf die Netzteile und Stecker wieder in die Farmer.
- Als Sammlung abgeschlossen ist, schalten Sie die Stromversorgung und Dorn und ziehen Sie den Farmer. Entfernen Sie vorsichtig das Deckgläschen und Band mit einer Rasierklinge.
- Visualisieren Sie die Fasern mit einem Fluoreszenz-Mikroskop mit Filtern für Rhodamin und DAPI ausgestattet. Siehe Beispiel in Abbildung 3. Hinweis: fluoreszierende Fasern sind die meisten klar sehen, wenn elektrogesponnenen für kurze Zeit (<3 Minuten), aber dieser Prozess für einen unbegrenzten Zeitraum verlängert werden kann, um dickere Konstrukte zu schaffen, vor allem ohne den Einsatz der Deckgläser .
D. Seeding Cells auf Gerüsten
- Platzieren Sie jede Deckglas mit elektrogesponnenen Polymer in einer individuellen und einer entsprechend dimensionierten Well-Platte befestigt. Hinweis: zellulären Interaktionen mit den Fasern sind gut sichtbar durch Elektrospinnen auf methacrylierte Deckgläschen. Außerdem können MeRho wieder für Faser-Visualisierung verwendet werden.
- Inkubieren Sie die Gerüste in PBS über Nacht um die vollständige Entfernung des Lösungsmittels und etwaige auslaugbaren Nebenprodukte sicherzustellen.
- Entfernen Sie das PBS aus den Vertiefungen.
- Zu sterilisieren die Gerüste, legen Sie sie unter einem Entkeimungslampe in einer Sterilbank für 30 Minuten. Wenn eine vollständige Gerüst wird ausgesät wird, Flip das Gerüst um und legen Sie unter einem Entkeimungslampe für weitere 30 Minuten.
- Führen Sie Standard-Zellkultur und bereiten eine konzentrierte Zellsuspension auf die gewünschte Zelldichte (zB, 6.000 Zellen cm -2). Verwenden Sie beispielsweise eine 100 ml Zellsuspension für eine 22 mm X 22 mm Deckglas. Legen Sie in den Inkubator für 1 Stunde.
- Fügen Sie den entsprechenden Betrag von Zellkulturmedien in jede Vertiefung. Legen Sie die Gerüste wieder in den Inkubator.
- Stain die Zellen mit einem kommerziell erhältlichen Live / Dead-Kit. Hinweis: andere Zelltypen Färbung, wie DAPI (Zellkerne) und fluoreszenzmarkierte Phalloidin (Aktin-Stress-Fasern) angewendet, um die Zellen zu visualisieren.
- Visualisieren Sie die Zellen und Fasern mit einem Fluoreszenz-Mikroskop mit Filtern für TRITC und FITC ausgestattet. Siehe Beispiel in Abbildung 4.
Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Geräte-Setup für blockfreien Gerüst Bildung (oben) und ausgerichtet Gerüst Bildung (unten). Beispiel Rasterelektronenmikroskopie Bilder jeder Art von Gerüst dargestellt. Balken = 5 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Strukturierung Methode. Patterns sind, indem eine Fotomaske zwischen der Lichtquelle und Gerüst während Photovernetzung und dann abgewaschen umgesetzte Polymer gebildet. Fotomasken-und SEM-Bild von Gerüsten nach Porenbildung und Gefriertrocknung. Maßstab = 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen.
Abbildung 3 Schematische Darstellung des Multi-Polymer Elektrospinnen Setup und notwendige Prozessparameter sowie eine repräsentative Fluoreszenzbild einer Mischung von zwei Glasfaser Populationen (zB: rot und blau Meha PEO). Die gleichzeitig elektrogesponnenen wurden zu einem Multi-Polymer-Gerüst bilden . Maßstab = 100 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere versio sehenn der Abbildung 3 dargestellt.
Abbildung 4. Ein Beispiel Live / Dead Färbung Bild von humanen mesenchymalen Stammzellen und ihre Wechselwirkungen mit der elektrogesponnenen Fasern. Maßstab = 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 4 zu sehen.
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Discussion
Elektrospinnen wurde verwendet, um faserige Gerüst aus Polymeren herzustellen. Photovernetzbaren Gerüste basieren auf Hyaluronsäure wurden als ein anschauliches Beispiel, wo Belichtung zur Vernetzung benötigt wird. Mit dem Einsatz von reaktiven Makromeren, wie Meha, wurden Kanäle, die zuvor verbesserte zelluläre Verteilung haben gezeigt, in die Gerüste mit der Verwendung einer Maske während Photovernetzung zu Makro-und Mikro-poröse Gerüste Form eingearbeitet. Darüber hinaus wurden zwei verschiedene Polymere gleichzeitig elektrogesponnenen mit unseren Kunden Apparat. Die Anwesenheit der zwei unterschiedliche Faser-Populationen wurde mit der Zugabe von einem fluoreszierenden Farbstoff zu jedem Elektrospinnen Lösung, die später angesehen wurde mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroskops nachgewiesen. Multi-Polymer-Gerüste können verwendet werden, um zelluläre Verteilung sowie eine bessere Melodie der Mechanik und Abbau eines Gerüstes für eine bestimmte Anwendung bezogen auf einzelnes Polymer elektrogesponnenen Gerüste zu verbessern. Darüber hinaus hat der Sterilisation und Zell-Aussaat von den Gerüsten nachgewiesen. Viele dieser Techniken sind vielseitig und können für eine Reihe von unterschiedlichen Polymeren verwendet werden, um diverse Gerüste für Anwendungen im Tissue Engineering und für die Kultur von Zellen herzustellen.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von einem American Heart Association Promotionsstipendium an JLI und National Institutes of Heath gewähren R01AR056624 unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Reagent | Invitrogen | D1306 | |
| I2959 | Reagent | Ciba Specialty Chemicals | ||
| PEO 200 kDa | Polysciences, Inc. | 17503 | ||
| PEO 900 kDa | Reagent | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Reagent | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Live/Dead Stain Kit | Reagent | Invitrogen | L3224 | Contains Calcein (stains live cells green) and ethidium homodime (stains red dead cells) |
| Syringe Pump | Equipment | KD Scientific | KDS100 | Two are needed for dual polymer spinning |
| Power Source | Equipment | Gamma High Voltage | ES30P-5W | Two are needed for dual polymer spinning |
| Motor | Equipment | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Equipment | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | Equipment | EXFO | S1000 | |
| Silicone Tubing | Equipment | McMaster-Carr | 51135K151 | |
| Luer Lock Female Adapter | Equipment | McMaster-Carr | 51525K293 | |
| Luer Lock Male Adapter | Equipment | McMaster-Carr | 51525K143 | |
| Needles | Equipment | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Equipment | Corning | 2875-22 |
References
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers. Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).
- Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).
- Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment. J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).
- Mauck, R. L., Baker, B. M., Nerurkar, N. L., Burdick, J. A., Li, W. J., Tuan, R. S., Elliott, D. M., M, D. Engineering on the Straight and Narrow: The Mechanics of Nanofibrous Assemblies for Fiber-Reinforced Tissue Regeneration. Tissue Engineering B. 15, 171-193 (2009).
- Sill, T. J., Von Recum, H. avon Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity. , Forthcoming (2009).
