Summary
Sinapsi glutammatergica possibile passare da una modalità attiva di una modalità silenziosa. Abbiamo dimostrato che lo stato presinaptica attività nella cultura dissociata dei neuroni di roditori viene visualizzato per mezzo una forma risolvibile del colorante-43 FM1 per visualizzare sinapsi attiva e immunostaining con vGluT-1 anticorpi per visualizzare tutte le sinapsi glutammato.
Abstract
Alla base di plasticità sinaptica probabilmente la capacità del sistema nervoso per imparare e ricordare, che potrebbero anche rappresentare un adattamento che impedisce in qualche modo danneggiare gli insulti di diventare neurotossici. Abbiamo studiato una forma di plasticità presinaptica che è interessante anche perché è espresso in commutazione digitale on e off della capacità di un terminale presinaptico s per rilasciare vescicole contenenti il neurotrasmettitore glutammato. Qui mostriamo un protocollo per visualizzare lo stato di attività dei terminali presinaptici in colture cellulari dissociato preparati con l'ippocampo roditori. Il metodo si basa sulla rilevazione sinapsi attiva utilizzando colorazione con una forma risolvibile del colorante styryl FM1-43, comunemente usato per etichettare vescicole sinaptiche. Questo profilo colorazione viene confrontato con immunocolorazione dei terminali stessi con un anticorpo diretto contro il trasportatore del glutammato vescicolare 1 (vGluT-1), una macchia progettato per etichettare tutti sinapsi glutammato indipendentemente dallo stato di attivazione. Troviamo che stimoli depolarizzanti indurre silenziamento presinaptica. La popolazione di sinapsi che tace in condizioni basali può essere attivato prolungato silenzio elettrico o attraverso l'attivazione di percorsi di cAMP segnalazione.
Protocol
Cultura preparazione
- Preparare colture di cellule dissociate di cellule dell'ippocampo di ratto o topo dal primo giorno dopo la nascita 0-3 animali 1. I nostri neuroni aderiscono ad un monostrato di fondo astrociti, che a sua volta aderisce a un livello di collagene diffuso su un vetrino numero 0 spessore. Piastra i neuroni ad una densità di circa 500 cellule per centimetro quadrato.
- Lasciare le culture a crescere per 10-14 giorni per consentire lo sviluppo e la maturazione sinaptica. Trattare le culture in vitro al giorno 4 con il AraC antimitotici di arrestare l'ulteriore crescita gliali. Dar loro da mangiare al giorno in vitro 5 con un cambio medio mezza con media Neurobasal più B27 supplemento per migliorare la sopravvivenza neuronale.
- Durante il periodo di cultura, di introdurre trattamenti mirati a modificare il numero di sinapsi funzionalmente a tacere. Troviamo che un modo comodo per mettere a tacere una larga percentuale (~ 80%) delle sinapsi glutammato è di 4 ore di trattamento con 30 mM di potassio. Più incubazioni con deboli stimoli depolarizzanti induca 2 simili a tacere. Stimolazione di 4 ore con mM forskolin 50, un attivatore di adenilato ciclasi, può essere utilizzato per risvegliare la popolazione di terminali in silenzio al basale 3.
Visualizzazione sinapsi silenzioso
- Le cellule devono avere una densità relativamente bassa, con ben separati i processi neuritiche al giorno 10-14 in vitro in modo da facilitare la visualizzazione di discreto terminali sinaptici usando la microscopia a fluorescenza.
- Preparare una soluzione madre di 5 mm FM1-43FX in acqua distillata. Lo stock dovrebbe essere mantenuta al buio a 4 ° C. Tutti gli esperimenti con FM1-43FX dovrebbe essere eseguita anche al buio.
- Sfida le culture per 2 minuti con 45 mM di cloruro di potassio in soluzione HEPES soluzione tampone contenente 100 mM di cloruro di sodio, cloruro di calcio 2 mM, 1 mM cloruro di magnesio, 10 mM di glucosio e 10 mM FM1-43FX. Questa soluzione deve inoltre contenere 1 micron NBQX e 25 mM D-APV di bloccare i recettori postsinaptici e prevenire le recidive di segnalazione. Questa sfida sarà etichetta terminali sinaptici che sono in grado di esocitosi e endocitosi. La Sfida a tempo e la forza sono progettati per provocare almeno un giro di esocitosi di vescicole tutti disponibili in 4 pool di riciclaggio. Tuttavia, la sfida non è sufficiente a causare il silenziamento supplementare di terminali.
- Lavare la cultura per 3 a 5 secondi solo, utilizzando lo stesso HEPES soluzione tampone senza cloruro di potassio, ma con 500 mM Advasep-7 per rimuovere colorante non specifico 5. Si noti che i tempi di questo passaggio è critico come l'applicazione prolungata di Advasep-7 comporta la perdita di tutti i FM1-43FX etichettatura. Lavaggio successivo a HEPES soluzione tampone senza Advasep-7 per cinque intervalli di 2 minuti.
- Fissare le cellule con paraformaldeide 4% e 0,2% glutaraldeide in PBS, pH 7,4 per 10 minuti. Lavare le cellule una volta brevemente con PBS, poi incubare per 15 minuti in una soluzione bloccante contenente 4% di siero normale di capra e di 0,04% Triton X-100 in PBS. Si noti che FM1-43FX è anche molto sensibile alla quantità di Triton X-100 usato qui e nei passaggi successivi. In generale, FM1-43FX etichettatura è meglio in assenza di Triton X-100, ma alcuni detergenti è necessario permeabilize cellule per immunocolorazione successive. Abbiamo stabilito empiricamente che 0,04% Triton X-100 è ottimale per l'esame delle sinapsi presynaptically silenzio.
- Diluire il primario vGluT-1 anticorpi nel bloccare soluzione ad una concentrazione di 1:2500. Incubare le cellule agitando delicatamente / rotazione nel diluita vGluT-1 anticorpi per 3 ore a temperatura ambiente. Assicurati di coprire i vostri piatti della cultura con un foglio di evitare l'imbiancamento della FM1-43FX colorante.
- Lavare le cellule due volte in PBS e incubare le cellule con un anticorpo anti-guinea maiale coniugato con un fluoroforo con differenti caratteristiche spettrali da FM1-43FX di distinguere le due macchie. Per il nostro esperimento, useremo Alexa 555-coniugato anti-India anticorpi maiale a 1:500 nel bloccare soluzione. Incubare le cellule con l'anticorpo secondario agitando per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule quattro volte in PBS e poi montare il vetrino su un vetrino con una piccola goccia di Fluoromount-G. Assicurarsi di orientare il coprioggetto in modo che le cellule faccia della diapositiva. Lasciare che il vetrini si asciughino durante la notte.
- Siamo ora pronti ad acquisire le immagini delle sinapsi attive e inattive. Preparare un obiettivo olio 60 x 1,4 con un'apertura numerica di un microscopio confocale a scansione laser. Posizionare un vetrino sul tavolo, assicurandosi che il lato coprioggetto sia rivolto verso l'obiettivo. Dopo aver focalizzato la diapositiva, trovare un campo di neuriti, che non è eccessivamente denso. Si raccomanda anche di evitare di imaging in prossimità del soma cellulare, come residuo FM1-43FX colorante può rimanere lì anche dopo il lavaggio estesa. Per le nostre immagini sperimentali, di solito lo zoom per una dimensione di 51 51 micron.
- Acquisireun z-stack di un determinato campo che copre una profondità di 7,8 micron con 27 0,3 micron passi. Questa gamma è sufficiente a coprire lo spessore dei neuriti nella nostra cultura. Per ogni passo nella Z-Stack, prima scansione con la luce laser che eccita immunofluorescenza del vGluT-1 anticorpi per identificare tutte le sinapsi glutammatergica in un campo microscopio. Lo stesso campo viene ri-scansione ad ogni passo per FM1-43FX fluorescenza. Impostare filtri a densità neutra e guadagni fotomoltiplicatore costantemente tra tutti lamelle per un dato esperimento, evitando la saturazione del segnale. Noi di solito acquistano ≥ 5 campi per condizione per ogni esperimento.
- Utilizzando il software di analisi, di convertire lo z-stack in un composto unico piano dell'immagine. Il processo che usiamo per questa conversione produce un'immagine basata sulla massima intensità da qualsiasi piano di ogni pixel. L'immagine composita è thresholded e vGluT-1 terminali sono identificate per l'analisi, senza riferimento alla FM1-43FX macchia. Aree colorate, denominato puncta, sono contrassegnati come regioni di interesse. Noi di solito selezionare 10 puncta per campo. Poi il FM1-43FX canale è thresholded e le regioni di interesse sono sovrapposti. Il software di analisi viene utilizzato per quantificare l'intensità di fluorescenza di ciascun segnale così come l'area di ogni punctum. Un criterio assoluto di pixel o di un criterio percentuale dei pixel può essere utilizzato per distinguere attivo da sinapsi inattive.
Rappresentante Risultati
- Nella nostra cultura, troviamo che il 70-80% delle sinapsi glutammato, definita da vGluT-1 colorazione, mostra rilevabili FM1-43 colorazione 2, 6-8. Nelle immagini sovrapposte di verde FM1-43 e fluorescenza rossa vGluT-1 colorazione si riflette questo come l'abbondanza di giallo puncta: sinapsi con il co-localizzate marcatori. Questi sono indicati dalle frecce.
- Circa il 20-30% di (rosso) vGluT-1 puncta positivo mancherà di avere (verde) FM1-43 fluorescenza di sopra del basale. Questi sono i terminali presinaptici inattivi, e un esempio è indicato dalla freccia.
- Una terza popolazione di sinapsi sarà anche osservato. Questi sono positivi per (verde) FM1-43 fluorescenza, ma privo di (rosso) vGluT-1 colorazione. Queste sinapsi sono attivi GABAergici e un esempio è indicato con l'asterisco. Sono esclusi dalla maggior parte delle nostre analisi, ma può essere esplicitamente studiato utilizzando un anticorpo trasportatore vescicolare del GABA al posto del vGluT-1 anticorpi.
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Discussion
Significato
- Tipicamente le sinapsi sono pensati per operare attraverso il rilascio di trasmettitore con una probabilità misurabile. Lavoro da noi stessi e gli altri rende evidente che alcune sinapsi sono refrattari al rilascio di neurotrasmettitore, nonostante una serie completa di trasportatore vescicolare dei neurotrasmettitori e altri indicatori chiave presinaptico 2, 6-8. Abbiamo dimostrato in precedenza che l'attività di rete basale nei neuroni è essenziale per mantenere questa popolazione di sinapsi inattive.
Passaggi critici
- L'inclusione di un lavaggio breve con 500 mM Advasep-7 migliora significativamente la qualità della FM1-43FX colorazione. Tuttavia, anche un leggero aumento i tempi di questa lavare più di 5 secondi comporta la perdita della FM1-43FX etichettatura.
- FM1-43FX è molto sensibile alla quantità di Triton X-100 utilizzato nella parte immunocolorazione del protocollo. FM1-43FX etichettatura è meglio in assenza di Triton X-100, ma alcuni detergenti è necessario permeabilize cellule per vGluT-1 immunocolorazione. Abbiamo stabilito empiricamente che lo 0,4% Triton X-100 è ottimale per l'esame delle sinapsi presynaptically silenzio.
Modifiche
- Si può utilizzare un marcatore postsinaptici come 3 ° macchia per assicurare vGluT-1 colorazione sinapsi rappresenta in buona fede: punti di contatto tra vescicole cariche di grappoli terminali e dei recettori post-sinaptici.
- Si può anche scegliere di usare altri marcatori anticorpali presinaptico come il pan-sinaptica marcatore, SV2, o vGAT.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH DA018109 e MH78823, e NIH Neuroscienze Blueprint Nucleo di Grant P30NS057105 alla Washington University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM1-43FX | Invitrogen | F-35355 | A red-shifted FM4-64FX is also available, but has not proven as amenable to assays of presynaptic silencing. |
| Advasep-7 | CyDex | AR-0A7-001 | |
| vGluT-1 | EMD Millipore | AB5905 | |
| Alexa 647-conjugated anti-GP | Invitrogen | A-21450 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
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