Visualisation de localisation de l'ARN Xenopus Les ovocytes

Summary

Visualisation des<em> In vivo</em> ARN de transport se fait par micro-injection d'ARN transcrits marqués par fluorescence dans<em> Xenopus</em> Ovocytes, suivi par microscopie confocale.

Abstract

La localisation d'ARN est un mécanisme conservé d'établir la polarité cellulaire. Vg1 ARNm se localise dans le pôle végétal des ovocytes de Xenopus laevis et agit pour restreindre l'espace d'expression génique des protéines Vg1. Un contrôle strict de la distribution Vg1 de cette manière est requise pour la spécification de la couche germe de bon dans l'embryon en développement. Des éléments de séquence d'ARN en 3 'UTR de l'ARNm, l'élément Vg1 localisation (VLE) sont nécessaires et suffisantes pour le transport direct. Pour étudier la reconnaissance et de transport de Vg1 ARNm in vivo, nous avons développé une technique d'imagerie qui permet une analyse approfondie des facteurs de trans-mécanismes de transport dirigé via une lecture visuelle simple.

Pour visualiser la localisation d'ARN, nous synthétisons marqué par fluorescence ARN VLE et microinject cette transcription dans des ovocytes individuels. Après la culture des ovocytes pour permettre le transport de l'ARN injecté, les ovocytes sont fixes et déshydratés avant d'imagerie par microscopie confocale. Visualisation des schémas de localisation d'ARNm fournit une lecture de surveillance de la voie complète de l'ARN de transport et d'identification des rôles dans la direction de l'ARN de transport pour les éléments agissant en cis au sein de la transcription et facteurs agissant en trans qui se lient à l'VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Nous avons étendu cette technique à travers la co-localisation avec des ARN et des protéines supplémentaires (Gagnon et Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), et en combinaison avec perturbation des protéines motrices et le cytosquelette (Messitt et al., 2008) à la sonde mécanismes sous-jacents de localisation d'ARNm.

Protocol

Partie 1: La transcription de l'ARNm marqué par fluorescence. Linéariser l'ADN plasmidique contenant l'élément de localisation ou d'autres séquences d'ARN pertinentes et remettre à 1 ug / ul avec DEPC traitées H 2 O. La matrice d'ADN doit avoir des sites promoteur en amont de la transcription par T7, SP6 ou T3 ARN polymérase. Ajouter les réactifs suivants dans un tube stérile de 1,5 ml: a. Tx 10X tampon (voir M & M) 2 …

Discussion

Ici, nous avons présenté un protocole pour la visualisation de la localisation d'ARNm dans les ovocytes de Xénope. Cette méthode, en utilisant des ARN transcrits marqués par fluorescence a plus de signal sur bruit que précédemment obtenus avec marquées à la digoxigénine transcriptions et est plus simple et plus rapide que in situ des approches fondées (Mowry et Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). En utilisant cette méthode, nous pouvons concevoir l'ARN mutations séquence et tester rapidem…

Materials

10X Tx buffer

• 60 mM MgCl₂
• 400 mM Tris-HCl (pH 7.5)
• 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

• 10 mM CTP
• 10 mM ATP
• 9 mM UTP
• 2 mM GTP
• 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

• Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H₂O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions:
• 0.5 ml 0.2 M EDTA
• 1 ml 1 M Tris pH 8.0
• 0.5 ml 20% SDS
• Store complete G-50 solution at 4° C.
• Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny).
• Swirl complete G-50 solution to resuspend beads.
• Add 2 ml G-50 solution to the empty column.
• Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge.
• Add 200 μl DEPC-treated deionized H₂O to each column. Spin.
• Repeat wash twice more for a total of three washes.
• Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

• 75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich)
• 25 ml 0.1 M KPO₃+ (pH 7.4)

MBSH buffer

• 88 mM NaCl
• 1 mM KCl
• 2.4 mM NaHCO₃
• 0.82 mM MgSO₄ X 7H₂O
• 0.33 mM Ca(NO₃)₂ X 4H₂O
• 0.41 mM CaCl₂ X 6H₂O
• 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

• 50% L15 medium
• 15 mM HEPES (pH 7.6)
• 1 mg/ml insulin
• 100 mg/ml gentamicin
• 50 U/ml nystatin
• 50 U/ml penicillin
• 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

• 0.1 M MOPS (pH 7.4)
• 2 mM EGTA
• 1 mM MgSO₄
• 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

• Determine CPM in “input” and “incorporated” samples using a standard scintillation counter.
• incorporation = (“incorporated”) / (10 x “input”)
• Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10.
• Maximum theoretical yields for different polymerases:
  T7, T3, SP6 – 2.64 μg
• Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation)
• Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10^-8)
• The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.