Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten

Summary

Visualisierung von<em> In vivo</em> RNA-Transport ist durch Mikroinjektion von fluoreszenzmarkierten RNA-Transkripte erreicht in<em> Xenopus</em> Oozyten, gefolgt von der konfokalen Mikroskopie.

Abstract

RNA-Lokalisierung ist eine konservierte Mechanismus der Gründung Zellpolarität. Vg1 mRNA lokalisiert den vegetativen Pol des Xenopus laevis Oozyten und wirkt räumlich beschränken Genexpression Vg1 Protein. Eine strenge Kontrolle der Vg1 Verteilung auf diese Weise ist für die ordnungsgemäße Keim-Layer-Spezifikation in den sich entwickelnden Embryo erforderlich. RNA-Sequenz-Elemente in der 3 'UTR der mRNA, die Vg1 Lokalisierungselement (VLE) erforderlich und ausreichend, um auf direktem Wege. Zur Untersuchung der Anerkennung und der Transport von Vg1 mRNA in vivo, haben wir ein bildgebendes Verfahren, die umfassende Analyse der trans-Faktor gerichteten Transport-Mechanismen ermöglicht über eine einfache visuelle Ablesung entwickelt.

Zur Visualisierung RNA-Lokalisierung, synthetisieren wir fluoreszenzmarkierten VLE RNA und microinject dieses Transkript in einzelne Eizellen. Nach Eizelle Kultur, um den Transport der injizierten RNA zu ermöglichen, sind Eizellen fixiert und dehydriert vor Bildgebung durch konfokale Mikroskopie. Visualisierung der mRNA-Lokalisierung Muster bietet eine Anzeige für die Überwachung der kompletten Pfad der RNA-Transport und für die Ermittlung Rollen in Regie RNA-Transport für cis-wirkende Elemente innerhalb der Transkript-und trans-wirkende Faktoren, die zur VLE (Lewis et al., 2008 zu binden, Messitt et al., 2008). Wir haben diese Technik durch Co-Lokalisation erweitert mit zusätzlichen RNAs und Proteinen (Gagnon und Mowry 2009, Messitt et al., 2008) und in Kombination mit Störungen der motorischen und des Zytoskeletts (Messitt et al., 2008) zur Sonde Mechanismen, die mRNA-Lokalisierung.

Protocol

Teil 1: Transkription von fluoreszenzmarkierten mRNA. Linearisieren Plasmid-DNA mit dem RNA-Lokalisierung Element oder anderen relevanten Sequenz-und resuspendieren bei 1 ug / ul mit DEPC-behandeltem H 2 O. Die DNA-Vorlage muss stromaufwärts liegende Promotor Standorte für die Transkription durch T7, SP6 oder T3-RNA-Polymerase. Fügen Sie die folgenden Reagenzien in ein steriles 1,5 ml Tube: a. 10X Tx-Puffer (siehe M & M) 2 ul b. 2…

Discussion

Hier haben wir ein Protokoll für die Visualisierung von mRNA-Lokalisierung in Xenopus Oozyten vorgestellt. Diese Methode, mit fluoreszenzmarkierten RNA-Transkripte hat höheres Signal-Rausch-Verhältnis als bisher mit Digoxigenin-markierten Transkripte erhalten und ist einfacher und schneller als in-situ Ansätze (Mowry und Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Mit dieser Methode können wir Ingenieur-RNA-Sequenz Mutationen und schnell für die in vivo Funktion zu testen. Ferner kann durch die Verwend…

Materials

10X Tx buffer

• 60 mM MgCl₂
• 400 mM Tris-HCl (pH 7.5)
• 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

• 10 mM CTP
• 10 mM ATP
• 9 mM UTP
• 2 mM GTP
• 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

• Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H₂O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions:
• 0.5 ml 0.2 M EDTA
• 1 ml 1 M Tris pH 8.0
• 0.5 ml 20% SDS
• Store complete G-50 solution at 4° C.
• Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny).
• Swirl complete G-50 solution to resuspend beads.
• Add 2 ml G-50 solution to the empty column.
• Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge.
• Add 200 μl DEPC-treated deionized H₂O to each column. Spin.
• Repeat wash twice more for a total of three washes.
• Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

• 75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich)
• 25 ml 0.1 M KPO₃+ (pH 7.4)

MBSH buffer

• 88 mM NaCl
• 1 mM KCl
• 2.4 mM NaHCO₃
• 0.82 mM MgSO₄ X 7H₂O
• 0.33 mM Ca(NO₃)₂ X 4H₂O
• 0.41 mM CaCl₂ X 6H₂O
• 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

• 50% L15 medium
• 15 mM HEPES (pH 7.6)
• 1 mg/ml insulin
• 100 mg/ml gentamicin
• 50 U/ml nystatin
• 50 U/ml penicillin
• 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

• 0.1 M MOPS (pH 7.4)
• 2 mM EGTA
• 1 mM MgSO₄
• 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

• Determine CPM in “input” and “incorporated” samples using a standard scintillation counter.
• incorporation = (“incorporated”) / (10 x “input”)
• Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10.
• Maximum theoretical yields for different polymerases:
  T7, T3, SP6 – 2.64 μg
• Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation)
• Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10^-8)
• The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.