Visualisera RNA lokalisering i Xenopus Oocyter

Summary

Visualisering av<em> In vivo</em> RNA transport sker genom mikroinjektion av fluorescerande RNA-transkript i<em> Xenopus</em> Oocyter, följt av konfokalmikroskopiska.

Abstract

RNA lokalisering är en bevarad mekanism upprättandet cellens polaritet. Vg1 mRNA lokaliserar till växt-polen Xenopus laevis ägg och agerar för att rumsligt begränsa genuttryck av Vg1 protein. Noggrann kontroll av Vg1 fördelning på detta sätt krävs för korrekt grodden lagret specifikationen i det växande embryot. RNA-sekvens element i 3 'UTR av mRNA, den Vg1 lokalisering element (VLE) krävs och tillräckliga för direkt transport. Att studera erkännande och transport av Vg1 mRNA in vivo, har vi utvecklat en bildteknik som gör omfattande analys av trans-faktor riktad transportmekanismer via en enkel visuell avläsning.

Att visualisera RNA lokalisering, syntetisera vi fluorescerande VLE RNA och microinject denna utskrift i enskilda oocyter. Efter äggcellen kultur att tillåta transporten av det injicerade RNA, äggceller är fasta och uttorkade innan avbildning av konfokalmikroskopi. Visualisering av mönster mRNA lokalisering ger en avläsning för kontroll hela vägen av RNA transport och för att identifiera roller i regi RNA transport för cis-verkande element i avskriften och trans-verkande faktorer som binder till VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Vi har utvidgat denna teknik genom samarbete lokalisering med ytterligare RNA och proteiner (Gagnon och Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), och i kombination med störningar av motoriska proteiner och cytoskelettet (Messitt et al., 2008) att undersöka mekanismerna bakom mRNA lokalisering.

Protocol

Del 1: Transkribering av fluorescerande mRNA. Linjärisera plasmid-DNA som innehåller RNA lokalisering element eller andra relevanta sekvens och resuspendera vid 1 mikrogram / ​​l med DEPC-behandlade H 2 O. Den DNA-mall måste ha uppströms promotor platser för transkription av T7, SP6, eller T3 RNA-polymeras. Lägg till följande reagenser till en steril 1,5 mL rör: A. 10X Tx buffert (se M & M) 2 l b. 20X keps / NTP mix (se M…

Discussion

Här har vi lagt fram ett protokoll för visualisering av mRNA lokalisering i Xenopus oocyter. Denna metod, med hjälp av fluorescerande RNA-transkript har högre signal-brus-förhållande än vad som tidigare uppnåtts med digoxigenin märkt studieintyg och är enklare och snabbare än in-situ ansatser (Mowry och Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Med denna metod kan vi ingenjör RNA-sekvens mutationer och snabbt testa för in vivo-funktionen. Vidare genom att använda ytterligare Alexa-UTP fluorof…

Materials

10X Tx buffer

• 60 mM MgCl₂
• 400 mM Tris-HCl (pH 7.5)
• 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

• 10 mM CTP
• 10 mM ATP
• 9 mM UTP
• 2 mM GTP
• 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

• Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H₂O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions:
• 0.5 ml 0.2 M EDTA
• 1 ml 1 M Tris pH 8.0
• 0.5 ml 20% SDS
• Store complete G-50 solution at 4° C.
• Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny).
• Swirl complete G-50 solution to resuspend beads.
• Add 2 ml G-50 solution to the empty column.
• Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge.
• Add 200 μl DEPC-treated deionized H₂O to each column. Spin.
• Repeat wash twice more for a total of three washes.
• Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

• 75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich)
• 25 ml 0.1 M KPO₃+ (pH 7.4)

MBSH buffer

• 88 mM NaCl
• 1 mM KCl
• 2.4 mM NaHCO₃
• 0.82 mM MgSO₄ X 7H₂O
• 0.33 mM Ca(NO₃)₂ X 4H₂O
• 0.41 mM CaCl₂ X 6H₂O
• 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

• 50% L15 medium
• 15 mM HEPES (pH 7.6)
• 1 mg/ml insulin
• 100 mg/ml gentamicin
• 50 U/ml nystatin
• 50 U/ml penicillin
• 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

• 0.1 M MOPS (pH 7.4)
• 2 mM EGTA
• 1 mM MgSO₄
• 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

• Determine CPM in “input” and “incorporated” samples using a standard scintillation counter.
• incorporation = (“incorporated”) / (10 x “input”)
• Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10.
• Maximum theoretical yields for different polymerases:
  T7, T3, SP6 – 2.64 μg
• Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation)
• Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10^-8)
• The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.