Summary
وصفنا بروتوكول لالكمي السريع والحساسة من شدة المرض في نماذج من الماوس رنح مخيخي. وتشمل التدابير أطرافهم هند الشبك ، الحافة اختبار ، والمشية والحدب. يميز هذا البروتوكول على نحو فعال بين الأفراد المتضررة وغير المتضررة ، ويكشف تطور الأفراد المتضررين على مر الزمن.
Abstract
وصفنا بروتوكول لالكمي السريع والحساسة من شدة المرض في نماذج الماوس من ترنح مخيخات. وهو مستمد من التقييمات النمط الظاهري المنشورة سابقا في نماذج عدة أمراض ، بما في ذلك الترنحات السبيل النخاعي ، ومرض هنتنغتون ليالي وضمور العضلات نخاعي بصلي. وتشمل التدابير أطرافهم هند الشبك ، الحافة اختبار ، والمشية والحدب. يتم تسجيل كل قياس على مقياس من 0-3 ، مع ما مجموعه 0-12 لجميع التدابير الأربعة. نتائج تميز بين الأفراد بشكل فعال المتضررة وغير المتضررة ، بينما أيضا قياس التقدم الزمني للالظواهر مرض الاعصاب. ويمكن تحليل تدابير منفردة أو مجتمعة إلى درجة النمط الظاهري المركبة لقوة أكبر الإحصائية. سيكون مزيجا مثاليا من التدابير الأربعة المذكورة تعتمد على الفوضى في السؤال. نقدم مثالا على بروتوكول المستخدمة لتقييم شدة المرض في نموذج الفأر المعدلة وراثيا من نوع رنح نخاعي مخيخي 7 (SCA7).
ساهم البرت R. لا سبادا وGwenn الحديقة ألف لهذه المخطوطة على حد سواء.
Protocol
للحيلولة دون تحيز ، وينبغي المجرب أداء التقييمات لم يكن لديك معرفة التركيب الوراثي للحيوان. وسجل التدابير الفردية على مقياس من 0-3 ، مع 0 يمثل غياب النمط الظاهري و 3 ذات الصلة التي تمثل مظهرا أشد. يتم تنفيذ كل اختبار عدة مرات للتأكد من أن النتيجة هي استنساخه. وسوف يعقد السمنة تفسير جميع التدابير وصفها. قد يرغب المحقق لوزن الفئران التالية التهديف النمط الظاهري لتقييم دور محتمل للسمنة في النتائج.
اختبار الحافة
الاختبار هو قياس الحافة مباشرة من التنسيق ، وهو ضعف في الترنحات المخيخ والعديد من الاضطرابات العصبية الأخرى. هذا الإجراء هو الأكثر مقارنة مباشرة الى علامات الإنسان للرنح مخيخي.
- رفع الماوس من القفص ووضعه على الرف في القفص. سوف الفئران عادة المشي على طول الحافة ومحاولة لينزل مرة أخرى إلى القفص.
- مراقبة الماوس كما يمشي على طول الحافة القفص ويخفض نفسه في قفصه. وفأر من النوع البري عادة المشي على طول الحافة دون أن تفقد توازنها ، وسوف يخفض نفسه مرة أخرى في قفص بأمان ، وذلك باستخدام الكفوف. يتم تعيين هذه النتيجة 0. إذا كان الماوس يفقد مكانته في حين أن المشي على طول الحافة ، ولكن من ناحية أخرى يبدو منسقة ، فإنه يحصل على درجة من 1. إذا كان لا يستخدم فعليا رجليه الخلفيتين ، أو الأراضي على رأسه بدلا من الكفوف عند النزول الى داخل القفص ، فإنه يحصل على النتيجة من 2. إذا كان يقع قبالة الحافة ، أو يكاد ، في حين أن المشي أو محاولة لخفض نفسه ، أو يهز وترفض التحرك على كافة على الرغم من التشجيع ، ويتلقى على 3 نقاط. وسوف تتطلب بعض الفئران دفع لطيف لتشجيعهم على السير على طول الحافة أو النزول الى داخل القفص.
- سجل نتيجة اختبار الحافة.
Hindlimb الشبك
Hindlimb الشبك هي علامة على تطور المرض في عدد من نماذج الماوس من التنكس العصبي ، بما في ذلك بعض الترنحات المخيخ [1].
- فهم بالقرب من قاعدة الذيل ورفع الماوس واضح للجميع الأجسام المحيطة بها.
- مراقبة الموقف hindlimb لمدة 10 ثانية. إذا كنت على الدوام hindlimbs مفلطحة الخارج ، بعيدا عن البطن ، ويتم تعيينه على درجة من 0. إذا تم سحب one hindlimb نحو البطن لأكثر من 50 ٪ من الوقت مع وقف التنفيذ ، فإنه يتلقى بنتيجة 1. إذا تراجع جزئيا على حد سواء hindlimbs نحو البطن لأكثر من 50 ٪ من الوقت مع وقف التنفيذ ، فإنه يحصل على النتيجة من 2. إذا تراجعوا بالكامل hindlimbs ولمس البطن لأكثر من 50 ٪ من الوقت مع وقف التنفيذ ، فإنه يتلقى على 3 نقاط.
- مكان الماوس مرة أخرى في قفص وسجلها hindlimb درجة الشبك.
مشية
مشية هو قدر من التنسيق وظيفة العضلات.
- إزالة الماوس من قفصه ووضعه على سطح مستو مع رئيسها تواجه بعيدا عن التحقيق.
- مراقبة الماوس من وراء لأنه يمشي. إذا كان الماوس يتحرك بشكل طبيعي ، بكل ثقلها الجسم معتمدة على جميع الأطراف ، مع البطن على عدم ملامسة للأرض ، والمشاركة مع كل من hindlimbs بالتساوي ، فإنه يحصل على درجة من 0. إذا كان يظهر الهزة أو يبدو يعرج أثناء المشي ، فإنه يحصل على درجة من 1. إذا كان يظهر هزة شديدة ، عرج شديد ، خفضت الحوض ، أو القدمين نقطة بعيدا عن الجسم أثناء تحرك ("قدم البطة") ، فإنه يحصل على النتيجة من 2. إذا كان الماوس لديه صعوبة في التحرك إلى الأمام والبطن تستمر على طول الأرض ، فإنه يحصل على درجة 3.
- مكان الماوس مرة أخرى في قفص وسجل رصيده المشية.
حداب
حداب هو انحناء المميزة الظهرية من العمود الفقري الذي هو مظهر شائع من مرض الاعصاب في نماذج الماوس [2]. وهو ناتج عن فقدان قوة العضلات في العضلات الشوكي الثانوية لتنكس عصبي.
- إزالة الماوس من قفصه ووضعه على سطح مستو.
- كما نلاحظ أنه يمشي. إذا كان الماوس قادرة على تقويم العمود الفقري لها بسهولة لأنه يمشي ، وليس لديها حداب الثابتة ، فإنه يحصل على درجة من 0. إذا كان الماوس المعارض حداب معتدل ولكن قادرة على تقويم العمود الفقري ، فإنه يحصل على درجة من 1. إذا كان غير قادر على تقويم العمود الفقري لها تماما ويحافظ على حداب الثابتة ولكنه معتدل ، فإنه يحصل على النتيجة من 2. إذا كان الماوس يحتفظ حداب وضوحا كما يمشي أو يجلس في حين أنه ، يتم تعيينه على 3 نقاط.
- مكان الماوس مرة أخرى في قفص وسجل رصيده حداب.
ممثل النتائج
مع وجود عدد كاف من الحيوانات ، وهذا الإجراء هو قادر على الكشف عن الاختلافات بين سلالات النمط الظاهري ، وضمن نفس السلالة على مر الزمن. لتحليل البيانات ، وحساب النقاط لكل تدبير من خلال اتخاذيعني من القياسات الثلاثة في كل فرد. ويمكن تحليل تدابير منفردة أو مجتمعة في مركب على درجة النمط الظاهري لكل فرد.
رسم البيانات وتطبيق الأساليب الإحصائية المناسبة لتحديد الأهمية. الشكل 1 يبين نتائج التقييم من النمط الظاهري مركب نموذج الفئران المعدلة وراثيا SCA7. في هذا النموذج ، floxed SCA7 - 92Q المعدلة وراثيا ، ويحيط الإنسان ataxin - 7 الجين مع 92 من المواقع يكرر CAG loxP وأعرب من كروموسوم اصطناعية البكتيرية. النتيجة النمط الظاهري مركب يشمل الشبك ، والمشي الحافة ، والتقييمات حداب مشية ليسجل أكبر قدر ممكن من 12. ويتجلى النمط الظاهري SCA7 التدريجي في الفئران floxed - SCA7 - 92Q المعدلة وراثيا عن طريق زيادة درجة النمط الظاهري مركب ، وهو ما يتسق مع طبيعة تقدمية من الأمراض التي تصيب البشر.
. الشكل 1 - Floxed SCA7 - 92Q الفئران يحمل التدريجي SCA7 النمط الظاهري الذي يختلف كثيرا عن غير المعدلة وراثيا في بداية تتزاحم 20 أسبوعا (2 - طريقة ANOVA : Bonferroni بعد المخصصة ؛ *** P <0.001). قيمت الفئران على نطاق و0-3 لكل اختبار الحافة ، الشبك ، مشية ، والحدب. تم احتساب درجة عن كل مركب متوسط التركيب الوراثي في كل سن. تمثل الأشرطة SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويهدف هذا البروتوكول أن يكون التقييم الحساسة وأداؤها بسهولة من شدة المرض في نماذج من الماوس رنح مخيخي. سوف المكونات الفردية للنظام التهديف يكون أكثر أو أقل فعالية في نماذج مختلفة من الماوس تنكس عصبي.
وقد عناصر هذا النظام التهديف استخدامها بفعالية لتقييم مجموعة متنوعة من نماذج الماوس من مرض الاعصاب الإنسان ، بما في ذلك الترنحات المخيخ ، ومرض هنتنغتون ق ضمور العضلات نخاعي بصلي [1-3]. سيكون مزيجا مثاليا من التجارب تعتمد على الفوضى في السؤال. كان مصمما أصلا هذا البروتوكول من قبل المؤلفين لتقييم نماذج الماوس المعدلة وراثيا من نوع رنح نخاعي مخيخي 7 (SCA7).
في نموذج SAC7 المستخدمة لتوليد البيانات المقدمة هنا ، تمت التضحية الحيوانات في سن 40-43 أسابيع أو قبل ذلك إذا كانت الانحرافات السلوكية تقدم إلى المرحلة التي حيوان لم يعد كافيا للحفاظ على المحمول بشكل مستقل التغذية أو الماء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تمت الموافقة على هذه الدراسات من قبل جامعة واشنطن لرعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل عن طريق منح المعاهد الوطنية للصحة لNS052535 شكيمة وEY014061 وEY014997 لARL ، فضلا عن جائزة UL1DE019583 - 02 الكونسورتيوم.
References
- Chou, A. H. Polyglutamine-expanded ataxin-3 causes cerebellar dysfunction of SCA3 transgenic mice by inducing transcriptional dysregulation. Neurobiol Dis. 31 (1), 89-101 (2008).
- Thomas, P. S. Jr Loss of endogenous androgen receptor protein accelerates motor neuron degeneration and accentuates androgen insensitivity in a mouse model of X-linked spinal and bulbar muscular atrophy. Hum Mol Genet. 15 (14), 2225-2238 (2006).
- Ditzler, S., Stoeck, J., LeBlanc, M., Kooperberg, C., Hansen, S., Coppin, L., Olson, J. M. A Rapid Neurobehavioral Assessment Reveals that FK506 Delays Symptom Onset in R6/2 Huntington's Disease Mice. Preclinica Research Articles. 1 (3), 115-126 (2003).
