Summary
Viene descritta una procedura per studiare la dinamica del metabolismo del DNA mitocondriale (mtDNA) nelle cellule utilizzando un formato di piastra multi-pozzetto e l'imaging automatizzato di immunofluorescenza per rilevare e quantificare la sintesi e la distribuzione del mtDNA. Questo può essere ulteriormente utilizzato per studiare gli effetti di vari inibitori, stress cellulari e silenziamento genico sul metabolismo del mtDNA.
Abstract
La stragrande maggioranza dei processi cellulari richiede una fornitura continua di energia, il cui vettore più comune è la molecola di ATP. Le cellule eucariotiche producono la maggior parte del loro ATP nei mitocondri mediante fosforilazione ossidativa. I mitocondri sono organelli unici perché hanno il loro genoma che viene replicato e trasmesso alla prossima generazione di cellule. In contrasto con il genoma nucleare, ci sono più copie del genoma mitocondriale nella cellula. Lo studio dettagliato dei meccanismi responsabili della replicazione, riparazione e mantenimento del genoma mitocondriale è essenziale per comprendere il corretto funzionamento dei mitocondri e delle cellule intere sia in condizioni normali che di malattia. Qui viene presentato un metodo che consente la quantificazione ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale (mtDNA) in cellule umane coltivate in vitro . Questo approccio si basa sulla rilevazione in immunofluorescenza di molecole di DNA sintetizzate attivamente marcate mediante incorporazione di 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU) e sulla rilevazione simultanea di tutte le molecole di mtDNA con anticorpi anti-DNA. Inoltre, i mitocondri sono visualizzati con coloranti o anticorpi specifici. La coltura di cellule in un formato multi-pozzetto e l'utilizzo di un microscopio a fluorescenza automatizzato rendono più facile studiare la dinamica del mtDNA e la morfologia dei mitocondri in una varietà di condizioni sperimentali in un tempo relativamente breve.
Introduction
Per la maggior parte delle cellule eucariotiche i mitocondri sono organelli essenziali, in quanto svolgono un ruolo cruciale in numerosi processi cellulari. Innanzitutto, i mitocondri sono i principali fornitori di energia delle cellule1. I mitocondri sono anche coinvolti nella regolazione dell'omeostasi cellulare (ad esempio, redox intracellulare2 e l'equilibrio del calcio3), segnalazione cellulare4,5, apoptosi6, sintesi di diversi composti biochimici 7,8 e risposta immunitaria innata9. La disfunzione mitocondriale è associata a vari stati patologici e malattie umane10.
Il funzionamento dei mitocondri dipende dall'informazione genetica situata in due genomi separati: il genoma nucleare e mitocondriale. Il genoma mitocondriale codifica per un piccolo numero di geni rispetto al genoma nucleare, ma tutti i geni codificati dal mtDNA sono essenziali per la vita umana. Il meccanismo proteico mitocondriale necessario per mantenere il mtDNA è codificato dall'nDNA. I componenti di base del replisoma mitocondriale, così come alcuni fattori di biogenesi mitocondriale, sono già stati identificati (rivisti nella ricerca precedente11,12). Tuttavia, i meccanismi di replicazione e mantenimento del DNA mitocondriale sono ancora lontani dall'essere compresi. A differenza dell'nDNA, il genoma mitocondriale esiste in più copie, il che fornisce un ulteriore strato per regolare l'espressione genica mitocondriale. Molto meno si sa attualmente sulla distribuzione e la segregazione del mtDNA all'interno degli organelli, in che misura questi processi sono regolati e, se lo sono, quali proteine sono coinvolte13. Il modello di segregazione è cruciale quando le cellule contengono una popolazione mista di mtDNA wild-type e mutato. La loro distribuzione ineguale può portare alla generazione di cellule con una quantità dannosa di mtDNA mutato.
Finora, i fattori proteici necessari per il mantenimento del mtDNA sono stati identificati principalmente con metodi biochimici, analisi bioinformatiche o attraverso studi associati alla malattia. In questo lavoro, al fine di garantire un'alta probabilità di identificare fattori che in precedenza sono sfuggiti all'identificazione, viene descritta una strategia diversa. Il metodo si basa sulla marcatura del mtDNA durante la replicazione o la riparazione con 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU), un analogo nucleosidico della timidina. BrdU è facilmente incorporato nei filamenti di DNA nascente durante la sintesi del DNA e, in generale, viene utilizzato per monitorare la replicazione del DNA nucleare14. Tuttavia, la procedura sviluppata qui è stata ottimizzata per rilevare BrdU incorporato nel mtDNA utilizzando l'immunofluorescenza degli anticorpi anti-BrdU.
L'approccio consente la quantificazione ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del mtDNA in cellule umane coltivate in vitro. È necessaria una strategia ad alto rendimento per condurre test in diverse condizioni sperimentali in un tempo relativamente breve; Pertanto, si propone nel protocollo di utilizzare un formato multi-pozzo per la coltura cellulare e la microscopia a fluorescenza automatizzata per l'imaging. Il protocollo include la trasfezione di cellule HeLa umane con una libreria di siRNA e il successivo monitoraggio della replicazione o riparazione del mtDNA utilizzando la marcatura metabolica del DNA appena sintetizzato con BrdU. Questo approccio è combinato con l'immunocolorazione del DNA con l'aiuto di anticorpi anti-DNA. Entrambi i parametri vengono analizzati utilizzando la microscopia quantitativa a fluorescenza. Inoltre, i mitocondri vengono visualizzati con un colorante specifico. Per dimostrare la specificità del protocollo, la colorazione BrdU è stata testata su cellule prive di mtDNA (cellule rho0), su cellule HeLa dopo il silenziamento di noti fattori di mantenimento del mtDNA e su cellule HeLa dopo trattamento con un inibitore della replicazione del mtDNA. I livelli di mtDNA sono stati misurati anche con un metodo indipendente, vale a dire qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione della miscela di siRNA
- Un giorno prima dell'inizio dell'esperimento, le cellule seme (ad esempio, HeLa) su un piatto di 100 mm in modo che raggiungano il 70% -90% di confluenza il giorno successivo.
NOTA: Tutte le operazioni devono essere eseguite in condizioni sterili in una camera a flusso laminare. - Preparare la quantità appropriata di siRNA diluito ad una concentrazione di 140 nM nel mezzo Opti-MEM (vedere Tabella dei materiali). Una piastra da 96 pozzetti può essere utilizzata come serbatoio.
- Aggiungere 5 μL della soluzione di siRNA (o mezzo Opti-MEM per i campioni di controllo) a ciascun pozzetto di una micropiastra di coltura cellulare nera a 384 pozzetti.
NOTA: A seconda del numero di campioni di siRNA testati, è possibile utilizzare una pipetta elettronica o multicanale. - Preparare la quantità appropriata di soluzione di reagente di trasfezione RNAiMAX (vedere Tabella dei materiali) nel mezzo Opti-MEM. Aggiungere 1 μL di RNAiMAX per ogni 100 μL di terreno.
- Aggiungere 10 μL della soluzione di reagente di trasfezione a ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti. Il modo più conveniente e veloce per farlo è con un distributore di reagenti.
- Incubare il siRNA con il reagente di trasfezione per 30 minuti a temperatura ambiente.
2. Preparazione delle cellule per la trasfezione
- Durante l'incubazione (fase 1.6), aspirare il mezzo utilizzando un dispositivo di aspirazione (vedere Tabella dei materiali) e lavare le celle con 3 ml di PBS.
- Aggiungere 1,5 mL di tripsina diluita 1:2 in PBS e incubare le cellule a 37 °C per 10 minuti.
- Controlla se le celle si sono staccate; in tal caso, aggiungere 3 ml di terreno DMEM con FBS al 10%. Sospendere accuratamente le cellule e trasferirle in un tubo da 15 ml. Prelevare almeno 150 μL della sospensione e contare le celle in una camera per il conteggio delle cellule (vedere Tabella dei materiali).
- Preparare una sospensione cellulare alla concentrazione appropriata (35.000 / ml per la linea HeLa) in mezzo DMEM con 10% FBS, penicillina e streptomicina.
3. Trasfezione cellulare
- Aggiungere 20 μL della sospensione cellulare a ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti utilizzando il dosatore di reagenti. Ciò si tradurrà in 700 cellule seminate per pozzetto.
- Incubare le cellule per 1 ora a temperatura ambiente, quindi metterle nell'incubatore per 72 ore (37 °C e 5% CO2).
4. Costituzione di BrdU
- Preparare una soluzione da 90 μM di BrdU (vedere Tabella dei materiali) in mezzo DMEM con FBS al 10%.
- A 56 ore dopo la trasfezione di siRNA (16 ore prima della fissazione cellulare), aggiungere 10 μL di soluzione di BrdU a 90 μM a ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti (la concentrazione finale di BrdU è di 20 μM).
NOTA: l'azione deve essere eseguita il più velocemente possibile; Pertanto, è meglio utilizzare un distributore di reagenti, una pipetta elettronica o una pipetta multi-dispenser. Ricordarsi di preparare pozzetti di controllo senza l'aggiunta di BrdU. - Incubare le cellule per 16 ore (37 °C e 5% CO2).
5. Etichettatura dei mitocondri
- Preparare una soluzione da 20 μM di BrdU in DMEM con FBS al 10% e aggiungere ad essa la soluzione di colorante tracciante dei mitocondri (vedi Tabella dei materiali) ad una concentrazione di 1,1 μM.
- A 15 ore dall'inizio dell'incorporazione di BrdU (1 ora prima della fissazione cellulare), aggiungere 10 μL della soluzione di colorante che traccia i mitocondri (vedi Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto della piastra da 384 pozzetti (la concentrazione finale del colorante è 200 nM).
NOTA: utilizzare un distributore di reagenti, una pipetta elettronica o una pipetta multi-dispenser. Ricordarsi di conservare i pozzetti di controllo senza l'aggiunta di BrdU ma con l'aggiunta del colorante di tracciamento dei mitocondri. - Incubare le cellule per 1 ora (37 °C e 5% di CO2).
6. Fissazione cellulare
NOTA: Tutto il lavaggio viene eseguito più comodamente utilizzando una lavatrice a micropiastre, mentre l'aggiunta di reagenti viene eseguita più rapidamente utilizzando un distributore di reagenti.
- Utilizzando la rondella a micropiastre (vedere Tabella dei materiali), sciacquare ogni pozzetto due volte con 100 μL di PBS. Dopo il secondo lavaggio, lasciare 25 μL di PBS nel pozzetto.
NOTA: Lasciare PBS nel pozzetto riduce la probabilità di distacco cellulare durante l'aggiunta di liquido nella fase successiva. Tutti i lavaggi sono completati con il PBS lasciato dentro; pertanto, la soluzione aggiunta nel passaggio successivo deve sempre essere preparata a una concentrazione 2x in quanto verrà aggiunta in un volume uguale al PBS rimanente. - Fissare le cellule aggiungendo 25 μL di una soluzione di formaldeide all'8% in PBS con Triton X-100 allo 0,4% e Hoechst 33342 ad una concentrazione di 4 μg/mL (le concentrazioni finali dei singoli reagenti sono rispettivamente 4%, 0,2% e 2 μg/ml) (vedere Tabella dei materiali).
- Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 30 minuti.
7. Blocco
- Risciacquare ogni pozzetto quattro volte con 100 μL di PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare 25 μL di PBS nel pozzetto.
- Aggiungere 25 μL di BSA al 6% in PBS (la concentrazione finale di BSA è del 3%) a ciascun pozzetto.
- Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 30 minuti.
8. Aggiunta degli anticorpi primari
- Aspirare il BSA utilizzando una rondella a micropiastre e lasciare 10 μL di soluzione nel pozzetto.
- Aggiungere 10 μL della soluzione anticorpale primaria preparata in BSA al 3% in PBS. Utilizzare anti-BrdU a 0,8 μg/mL e anti-DNA a 0,4 μg/mL (le concentrazioni finali di anticorpi sono rispettivamente 0,4 μg/mL e 0,2 μg/mL) (vedere Tabella dei materiali).
- Incubare la piastra al buio a 4 °C durante la notte.
9. Aggiunta degli anticorpi secondari
- Risciacquare ogni pozzetto quattro volte con 100 μL di PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare 10 μL di PBS nel pozzetto.
- Aggiungere 10 μL della soluzione anticorpale secondaria da 4 μg/mL preparata in BSA al 6% in PBS (la concentrazione finale è 2 μg/ml). Utilizzare anticorpi isotipo-specifici (IgG1 anti-topo e IgM anti-topo) coniugati a fluorocromi come Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 555 (vedi Tabella dei materiali).
- Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 1 ora.
- Risciacquare ogni pozzetto quattro volte con 100 μL di PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare 50 μL di PBS nel pozzetto.
- Sigillare la piastra con una pellicola sigillante adesiva (vedi Tabella dei materiali) e conservarla al buio a 4 °C. L'imaging deve essere eseguito entro 2 settimane.
10. Imaging
NOTA: l'imaging deve essere eseguito con un microscopio a campo largo automatizzato; Il microscopio deve essere dotato di uno stadio motore fornito con comandi per visualizzare automaticamente le singole aree della lastra.
- Controllare le impostazioni di messa a fuoco automatica nelle aree angolari della piastra (pozzetti A1, A24, P24, P1) e al centro.
NOTA: per l'imaging, si consiglia di utilizzare un obiettivo a breve distanza di lavoro 20x (vedere Tabella dei materiali) con la massima apertura numerica possibile. - In base all'intensità degli istogrammi generati dal software di imaging in modalità live view, selezionare un tempo di esposizione sufficientemente lungo per i singoli canali di fluorescenza in modo che l'immagine risultante non sia sovrasatura.
- Impostare il numero appropriato di piani per l'imaging sull'asse z.
NOTA: il campo visivo con ingrandimento 20x è abbastanza grande da non consentire a tutte le celle di trovarsi sullo stesso piano di messa a fuoco, è necessario eseguire la sezione Z per visualizzare tutte le celle nel piano di messa a fuoco corretto. Di solito, cinque aerei sono sufficienti. A seconda della disponibilità di spazio su disco, è possibile salvare singoli z-stack o solo proiezioni di intensità massima. L'analisi delle immagini mostrata nella sezione dei risultati rappresentativi si basa su proiezioni di massima intensità. - Selezionare il numero appropriato di campi visivi da visualizzare per ogni riotto.
NOTA: A seconda della confluenza, è possibile visualizzare circa 60-300 celle in un campo visivo. Tipicamente, per le cellule HeLa con una confluenza del 60% -90%, l'imaging di cinque campi visivi consentirà di analizzare da 500 cellule a oltre 1.000 cellule. - Seleziona i pozzi da fotografare e inizia l'imaging.
11. Analisi quantitativa delle immagini
NOTA: L'analisi quantitativa delle immagini acquisite può essere eseguita utilizzando un software open source come Cell Profiler15. Per il presente studio, l'analisi è stata eseguita utilizzando il software ScanR 3.0.0 (vedere la tabella dei materiali).
- Avviare l'analisi eseguendo la correzione dello sfondo per tutte le immagini provenienti da tutti i canali di fluorescenza. A seconda delle dimensioni degli oggetti analizzati, selezionare la dimensione del filtro appropriata: 80 pixel per i nuclei cellulari e 4 pixel per le macchie di BrdU e mtDNA.
- Inizia a segmentare l'immagine creando una maschera dell'oggetto principale in base al rapporto tra l'intensità del segnale di fluorescenza e lo sfondo per il canale corrispondente ai nuclei cellulari.
- Creare maschere per i sotto-oggetti che rappresentano rispettivamente le macchie di BrdU e mtDNA, utilizzando i canali di fluorescenza appropriati per le strutture date.
NOTA: Ogni oggetto secondario è assegnato all'oggetto principale più vicino (nucleo cellulare). - Impostare i parametri da misurare durante l'analisi e misurare l'intensità dei singoli pixel all'interno di ciascuna maschera per tutti i canali di fluorescenza.
NOTA: È anche necessario calcolare il numero di sotto-oggetti assegnati a un dato nucleo cellulare e l'area di ciascun sotto-oggetto. - Definire i parametri derivati da calcolare in base ai dati ottenuti. Per ottenere le intensità totali di fluorescenza per il canale BrdU o mtDNA, sommare le intensità di tutti i sotto-oggetti assegnati a un dato nucleo cellulare. Per ottenere l'intensità media di fluorescenza, dividere l'intensità totale della fluorescenza per la somma dell'area dei sotto-oggetti assegnati a un dato nucleo cellulare.
NOTA: Per garantire che il sotto-oggetto creato (BrdU o macchia di mtDNA) si trovi effettivamente nei mitocondri, è necessario controllarli in base all'intensità della fluorescenza del colorante di tracciamento dei mitocondri. - Eseguire ulteriori analisi dei dati ottenuti con il software ScanR utilizzando il software statistico R 4.2.216 insieme ai seguenti pacchetti: dplyr 17, data.table 18, ggplot219 e ggpubr 20. Questo passaggio è facoltativo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uno schema della procedura per lo studio ad alto rendimento della dinamica della sintesi e della distribuzione del mtDNA è mostrato nella Figura 1. L'uso di un formato di piastra multi-pozzetto consente l'analisi simultanea di molte condizioni sperimentali diverse, come il silenziamento di diversi geni utilizzando una libreria di siRNA. Le condizioni utilizzate per la marcatura di molecole di DNA di nuova sintesi con BrdU consentono la rilevazione di DNA marcato con BrdU nei mitocondri delle cellule HeLa (Figura 2A), ma possono anche essere utilizzate come condizioni di partenza per impostare il test per altri tipi di cellule. Il tempo di incubazione con BrdU deve essere selezionato per le singole linee cellulari sulla base di un esperimento nel tempo (figura supplementare 1). Nel presente studio sono state utilizzate cellule HeLa, poiché lo screening dei siRNA richiede cellule che possono essere trasfettate con alta efficienza. È importante sottolineare che il segnale ottenuto con anticorpi anti-BrdU è specifico, in quanto può essere osservato solo nelle cellule trattate con BrdU (Figura 2). Le specificità della marcatura anti-BrdU e anti-DNA sono state ulteriormente confermate utilizzando cellule rho0 prive di DNA mitocondriale21 (Figura supplementare 2). Come previsto, in queste cellule, indipendentemente dal trattamento con BrdU, non è stato rilevato alcun segnale nei mitocondri sia per gli anticorpi anti-BrdU che per gli anticorpi anti-DNA (Figura 2B). La quantificazione del segnale fluorescente degli anticorpi anti-BrdU ha indicato che le cellule rho0 trattate con BrdU mostravano lo stesso basso livello di fluorescenza delle cellule BrdU-non trattate, mentre il segnale per le linee parentali A549 e HeLa era, in media, 50 volte superiore (Figura 2C).
Al fine di mostrare l'utilità del metodo qui presentato nello studio della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale, è stato condotto un esperimento in cui le cellule HeLa sono state trattate con 2′,3′-dideossicitidina (ddC), un inibitore della sintesi del mtDNA22, e l'espressione di geni noti per essere essenziali per la replicazione del mtDNA è stata silenziata con siRNA (Figura 3). Il trattamento delle cellule con ddC ha portato alla completa inibizione dell'incorporazione di BrdU, mentre i siRNA utilizzati hanno avuto effetti vari. La downregulation dell'elicasi Twinkle (TWNK)23 ha portato alla più potente inibizione dell'incorporazione di BrdU; un effetto più debole è stato osservato per la proteina TFAM24, mentre il silenziamento della DNA polimerasi mitocondriale gamma (POLG)25 ha portato ad una moderata diminuzione dell'incorporazione di BrdU rispetto alle cellule trattate con siRNA di controllo negativo (Figura 3A,B). L'uso di anticorpi anti-DNA nella procedura consente il monitoraggio della distribuzione del mtDNA nella cellula nelle condizioni sperimentali date. La downregulation del TFAM ha portato a drastici cambiamenti nella distribuzione del mtDNA; sono state rilevate meno macchie di mtDNA rispetto alle cellule di controllo, ma quelle che sono rimaste avevano un'intensità di fluorescenza molto elevata (Figura 3A). La quantificazione del segnale di fluorescenza medio dall'anticorpo anti-DNA ha mostrato un aumento di diverse volte dopo il silenziamento TFAM rispetto alle altre condizioni testate (Figura 3C).
La specificità dei risultati dell'imaging è stata verificata misurando il mtDNA e i livelli di espressione genica con l'aiuto della PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) (Figura 4). Il metodo è stato descritto dettagliatamente altrove26. Il trattamento con ddC ha comportato una forte diminuzione dei livelli di mtDNA; un effetto più debole è stato osservato nel caso del silenziamento TFAM e TWNK, mentre la trasfezione delle cellule con POLG siRNA ha avuto un effetto molto modesto sul numero di copie del mtDNA (Figura 4A). La quantificazione dell'espressione di TFAM e TWNK ha confermato un'efficiente riduzione della loro espressione a ~ 15% -20% dei livelli di controllo, in contrasto con POLG, la cui espressione a livello di mRNA è stata ridotta al 30% (Figura 4B).
Figura 1: Rappresentazione schematica dei passaggi del protocollo. Le barre della scala per le immagini microscopiche sono 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rilevazione specifica dell'incorporazione di BrdU nel mtDNA da parte di anticorpi anti-BrdU. Immagini campione di cellule (A) HeLa e (B) A549 e A549 rho0 sottoposte a colorazione immunofluorescenza con anticorpi anti-BrdU (verde) e anti-DNA (rosso). Le cellule sono state trattate o non trattate con la soluzione di BrdU. Il DNA nucleare (blu) è stato etichettato con Hoechst e i mitocondri (ciano) sono stati visualizzati con un colorante di tracciamento dei mitocondri. Viene mostrata un'immagine unita di tutti e quattro i canali di fluorescenza. La barra della scala rappresenta 10 μm. (C) Il risultato della quantificazione del segnale dagli anticorpi anti-BrdU. L'analisi è stata effettuata per quattro repliche biologiche indipendenti; ogni volta, 100 cellule selezionate casualmente sono state analizzate per ogni condizione sperimentale (N = 400 cellule). In media, sono stati rilevati 18 focolai di BrdU per cellula. Le caselle rappresentano il primo e il terzo quartile dell'intervallo interquartile (IQR), la mediana è rappresentata da una linea orizzontale, i baffi definiscono il minimo e il massimo e i valori anomali sono definiti come 1,5 x IQR. È stato eseguito un test statistico Kruskal-Wallis. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Risultati dell'inibizione della sintesi del mtDNA, compresa la riduzione dell'efficienza dell'incorporazione di BrdU e l'influenza sulla distribuzione dei nucleoidi. (A) Immagini di fluorescenza campione di cellule HeLa trattate per 72 ore con ddC o siRNA, che sottoregolano le proteine coinvolte nella replicazione del mtDNA. Le cellule sono state trattate con BrdU per 16 ore prima della fissazione. Il DNA nucleare (blu) è stato colorato con Hoechst, sono stati utilizzati anticorpi anti-BrdU (verde) e anti-DNA (rosso) e i mitocondri sono stati etichettati con un colorante di tracciamento dei mitocondri. Viene mostrata un'immagine unita di tutti e quattro i canali di fluorescenza. La barra della scala rappresenta 10 μm. (B,C) Quantificazione dei segnali di fluorescenza da (B) anticorpi anti-BrdU e (C) anti-DNA. L'analisi è stata effettuata per quattro repliche biologiche indipendenti; ogni volta, 650 cellule selezionate casualmente sono state analizzate per ogni condizione sperimentale (N = 2.600 cellule). In media, sono stati rilevati 18 focolai di BrdU e 46 focolai di mtDNA per cellula. Le caselle rappresentano il primo e il terzo quartile dell'intervallo interquartile (IQR), la mediana è rappresentata da una linea orizzontale, i baffi definiscono il minimo e il massimo e i valori anomali sono definiti come 1,5 x IQR. È stato eseguito un test statistico Kruskal-Wallis. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Validazione dell'efficienza dell'inibizione della sintesi del mtDNA e dell'efficacia dei siRNA testati. Le cellule HeLa sono state trattate per 72 ore con ddC o i siRNA indicati e quindi sottoposte all'isolamento di DNA e RNA. (A) Risultati dell'analisi del livello di mtDNA mediante qPCR. (B) analisi qPCR delle variazioni di espressione genica nelle condizioni indicate. Le barre rappresentano i valori medi di quattro repliche biologiche indipendenti; le barre di errore rappresentano il SEM; è stato eseguito un test statistico ANOVA; è stato eseguito un t-test per il confronto a coppie con campioni Untr (non trattati). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Dinamica dell'incorporazione di BrdU nel mtDNA delle cellule HeLa. Vengono mostrati i risultati di un esperimento a tempo in cui le cellule sono state incubate con 20 μM BrdU per un dato tempo. Vengono mostrate le medie di quattro repliche indipendenti per ogni punto temporale; 900 cellule selezionate casualmente sono state analizzate in ogni replica. Le barre rappresentano il mezzo di quattro repliche; è stato eseguito un test statistico ANOVA. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Convalida delle celle A549 rho0. (A) Analisi elettroforetica dei prodotti qPCR da frammenti di DNA amplificatori dei geni ND1 codificati dal mtDNA e B2M codificati dal DNA nucleare. Il DNA totale delle cellule A549 o A549 rho0 è stato utilizzato come modello nella reazione. (B) Risultati dell'analisi del livello di mtDNA mediante qPCR. Le barre rappresentano i valori medi di quattro repliche biologiche indipendenti; le barre di errore rappresentano il SEM; È stato eseguito un T-test. Clicca qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Storicamente, l'etichettatura del DNA mediante incorporazione BrdU e rilevamento di anticorpi è stata utilizzata nella replicazione del DNA nucleare e nella ricerca sul ciclo cellulare 14,27,28. Finora, tutti i protocolli per rilevare il DNA marcato con BrdU hanno incluso una fase di denaturazione del DNA (acida o termica) o digestione enzimatica (DNasi o proteinasi) per consentire l'esposizione all'epitopo e facilitare la penetrazione degli anticorpi. Questi protocolli sono stati sviluppati per il DNA nucleare strettamente imballato. Tuttavia, la diversa organizzazione del mtDNA ha permesso lo sviluppo di una procedura senza la fase di denaturazione; Ciò ha semplificato la procedura e l'ha resa più adatta per applicazioni ad alto rendimento. Questo approccio ha portato risultati eccellenti perché omettendo la fase di denaturazione si ottiene la rilevazione di DNA marcato con BrdU solo al di fuori del nucleo (Figura 2 e Figura 3). Di conseguenza, il forte segnale del DNA nucleare, che è sempre presente quando è inclusa una fase di denaturazione e che può causare un grave problema mascherando il segnale dal mtDNA29 marcato con BrdU, può essere evitato con questo protocollo. Inoltre, la mancanza di una denaturazione dura garantisce una migliore conservazione delle strutture cellulari e non influisce sull'efficienza della colorazione da colorazioni fluorescenti come Hoechst o colorante tracciante mitocondriale (Figura 2 e Figura 3).
La dinamica dell'incorporazione di BrdU nel mtDNA dipende dalla linea cellulare. Si consiglia di fare un esperimento a tempo sull'incorporazione di BrdU ogni volta che si utilizza una nuova linea cellulare. Questo studio ha stabilito 16 ore come tempo di incubazione BrdU ottimale per le linee cellulari HeLa. Tuttavia, a causa della variazione biologica nelle linee HeLa di diversi laboratori30, si suggerisce di eseguire un esperimento di tempo BrdU sulla particolare variante HeLa con cui si prevede di lavorare.
La combinazione di marcatura anti-BrdU e anti-DNA in questo protocollo consente il monitoraggio della sintesi del mtDNA e lo studio simultaneo della distribuzione del mtDNA nella cellula. Questo può essere visto molto bene nelle cellule silenziate da TFAM (Figura 3). La diminuzione del livello di TFAM porta ad una riduzione della sintesi del mtDNA (una diminuzione del segnale totale anti-BrdU) e al clustering dei nucleoidi mitocondriali, che si manifesta con un sostanziale aumento del segnale medio di fluorescenza del mtDNA (Figura 3). Va notato che, in questo caso, l'aumento dell'intensità media della fluorescenza del mtDNA è causato dalla mutata distribuzione dei nucleoidi mitocondriali e non riflette la sovraregolazione dei livelli di mtDNA; infatti, i livelli di mtDNA sono ridotti, come rivelato dall'analisi quantitativa PCR (Figura 4A). Risultati sorprendenti sono stati ottenuti per le cellule trasfettate con siRNA POLG (Figura 3). Ci si potrebbe aspettare che la trasfezione di cellule con POLG mirato a siRNA, che è la DNA polimerasi replicativa nei mitocondri, ridurrebbe significativamente l'incorporazione di BrdU nel mtDNA. Tuttavia, in questo studio, l'effetto sull'incorporazione di BrdU è stato trascurabile (Figura 3), come ulteriormente confermato misurando i livelli di mtDNA utilizzando qPCR (Figura 4A). La scarsa downregulation dell'espressione di POLG può spiegare questo risultato apparentemente contraddittorio sulla trasfezione delle cellule con il siRNA applicato (Figura 4B). Ciò evidenzia un potenziale svantaggio dell'uso di siRNA per studi funzionali e suggerisce che è necessaria la convalida del silenziamento genico.
Nel complesso, è stato sviluppato un saggio per studiare le dinamiche del metabolismo del mtDNA nelle cellule in coltura che utilizza un formato di piastra multi-pozzetto e l'imaging a immunofluorescenza per rilevare e quantificare la replicazione, la riparazione e la distribuzione del mtDNA. Il metodo consente lo studio simultaneo di molte condizioni sperimentali diverse. Può essere usato per studiare gli effetti di vari inibitori, stress cellulari e silenziamento genico sul metabolismo del mtDNA. Mentre il test ha un alto potenziale per l'uso nello studio del metabolismo del mtDNA in vari contesti fisiologici e patologici, va notato che il test non consente di distinguere la replicazione e la sintesi del mtDNA legata alla riparazione. Questo dovrebbe essere considerato quando si interpretano i risultati e si pianificano i successivi esperimenti funzionali. In particolare, il test ha un ulteriore potenziale di sviluppo. Ad esempio, i nucleoidi mitocondriali inattivi in replicazione (o inattivi in riparazione) non vengono rilevati con anticorpi anti-BrdU. Pertanto, l'applicazione di anticorpi anti-DNA consente la quantificazione dei livelli di stato del mtDNA, il numero di nucleoidi silenziosi di replicazione e la distribuzione dei nucleoidi nella cellula.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Centre, Polonia (numero di sovvenzione / premio: 2018/31 / D / NZ2/03901).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284 (2019).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102 (2020).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
- Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579 (2020).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S.
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
- Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
- Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2021).
- Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021).
- Dowle, M., Srinivasan, A. data.table: Extension of `data.frame. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016).
- Kassambara, A. ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020).
- Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
- Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
- Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
- Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
- Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
- Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
- Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).
