Summary
mtDNA sentezini ve dağılımını tespit etmek ve ölçmek için çok kuyucuklu bir plaka formatı ve otomatik immünofloresan görüntüleme kullanarak hücrelerdeki mitokondriyal DNA (mtDNA) metabolizmasının dinamiklerini incelemek için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu, çeşitli inhibitörlerin, hücresel streslerin ve gen susturmanın mtDNA metabolizması üzerindeki etkilerini araştırmak için de kullanılabilir.
Abstract
Hücresel süreçlerin büyük çoğunluğu, en yaygın taşıyıcısı ATP molekülü olan sürekli bir enerji kaynağı gerektirir. Ökaryotik hücreler ATP'lerinin çoğunu mitokondride oksidatif fosforilasyon ile üretirler. Mitokondri eşsiz organellerdir, çünkü kopyalanan ve yeni nesil hücrelere aktarılan kendi genomlarına sahiptirler. Nükleer genomun aksine, hücrede mitokondriyal genomun birden fazla kopyası vardır. Mitokondriyal genomun replikasyonu, onarımı ve bakımından sorumlu mekanizmaların ayrıntılı olarak incelenmesi, mitokondri ve tüm hücrelerin hem normal hem de hastalık koşulları altında düzgün çalışmasını anlamak için gereklidir. Burada, in vitro kültürlenmiş insan hücrelerinde mitokondriyal DNA'nın (mtDNA) sentezinin ve dağılımının yüksek verimli nicelleştirilmesine izin veren bir yöntem sunulmaktadır. Bu yaklaşım, 5-bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) katılımı ile etiketlenmiş aktif olarak sentezlenmiş DNA moleküllerinin immünofloresan tespitine ve tüm mtDNA moleküllerinin anti-DNA antikorları ile eşzamanlı olarak tespit edilmesine dayanmaktadır. Ek olarak, mitokondri spesifik boyalar veya antikorlarla görselleştirilir. Hücrelerin çok kuyucuklu bir formatta kültürlenmesi ve otomatik bir floresan mikroskobunun kullanılması, mtDNA'nın dinamiklerini ve mitokondrinin morfolojisini nispeten kısa sürede çeşitli deneysel koşullar altında incelemeyi kolaylaştırır.
Introduction
Çoğu ökaryotik hücre için mitokondri, çok sayıda hücresel süreçte çok önemli bir rol oynadıkları için temel organellerdir. Her şeyden önce, mitokondri, hücre1'in kilit enerji tedarikçileridir. Mitokondri ayrıca hücresel homeostazın (örneğin, hücre içi redoks2 ve kalsiyum dengesi3), hücre sinyalizasyonu 4,5, apoptoz6, farklı biyokimyasal bileşiklerin sentezi 7,8 ve doğuştan gelen bağışıklık tepkisi9'un düzenlenmesinde rol oynar. Mitokondriyal disfonksiyon çeşitli patolojik durumlar ve insan hastalıkları ile ilişkilidir10.
Mitokondrinin işleyişi iki ayrı genomda bulunan genetik bilgiye bağlıdır: nükleer ve mitokondriyal genomlar. Mitokondriyal genom, nükleer genoma kıyasla az sayıda geni kodlar, ancak mtDNA ile kodlanmış tüm genler insan yaşamı için gereklidir. MtDNA'yı korumak için gerekli mitokondriyal protein mekanizması nDNA tarafından kodlanır. Mitokondriyal replisomenin temel bileşenleri ve bazı mitokondriyal biyogenez faktörleri zaten tanımlanmıştır (önceki araştırmalarda gözden geçirilmiştir11,12). Bununla birlikte, mitokondriyal DNA replikasyonu ve bakım mekanizmaları hala anlaşılmaktan uzaktır. nDNA'nın aksine, mitokondriyal genom, mitokondriyal gen ekspresyonunu düzenlemek için ek bir katman sağlayan çoklu kopyalarda bulunur. Şu anda mtDNA'nın organeller içindeki dağılımı ve ayrışması, bu süreçlerin ne ölçüde düzenlendiği ve eğer öyleyse, hangi proteinlerin dahil olduğu hakkında çok daha az şey bilinmektedir13. Ayrışma paterni, hücreler karışık bir vahşi tip ve mutasyona uğramış mtDNA popülasyonu içerdiğinde çok önemlidir. Eşit olmayan dağılımları, zararlı miktarda mutasyona uğramış mtDNA'ya sahip hücrelerin oluşumuna yol açabilir.
Şimdiye kadar, mtDNA'nın korunması için gerekli protein faktörleri esas olarak biyokimyasal yöntemler, biyoinformatik analizler veya hastalıkla ilişkili çalışmalar yoluyla tanımlanmıştır. Bu çalışmada, daha önce tanımlamadan kaçan faktörleri belirleme şansının yüksek olmasını sağlamak için farklı bir strateji tanımlanmıştır. Yöntem, timidinin bir nükleozid analoğu olan 5-bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) ile replikasyon veya onarım sırasında mtDNA'nın etiketlenmesine dayanır. BrdU, DNA sentezi sırasında ortaya çıkan DNA iplikçiklerine kolayca dahil edilir ve genel olarak nükleer DNA14'ün replikasyonunu izlemek için kullanılır. Bununla birlikte, burada geliştirilen prosedür, anti-BrdU antikorlarının immünofloresansını kullanarak mtDNA'ya dahil edilen BrdU'yu tespit etmek için optimize edilmiştir.
Bu yaklaşım, in vitro kültürlenmiş insan hücrelerinde mtDNA sentezinin ve dağılımının yüksek verimli nicelleştirilmesine izin verir. Farklı deney koşulları altında testleri nispeten kısa sürede yapmak için yüksek verimli bir strateji gereklidir; Bu nedenle, protokolde hücre kültürü için çok kuyucuklu bir format ve görüntüleme için otomatik floresan mikroskobu kullanılması önerilmektedir. Protokol, insan HeLa hücrelerinin bir siRNA kütüphanesi ile transfeksiyonunu ve daha sonra BrdU ile yeni sentezlenen DNA'nın metabolik etiketlenmesini kullanarak mtDNA replikasyonunun veya onarımının izlenmesini içerir. Bu yaklaşım, anti-DNA antikorlarının yardımıyla DNA'nın immün boyanması ile birleştirilir. Her iki parametre de kantitatif floresan mikroskobu kullanılarak analiz edilir. Ek olarak, mitokondri belirli bir boya ile görselleştirilir. Protokolün özgüllüğünü göstermek için, BrdU boyaması, mtDNA'dan (rho0 hücreleri) yoksun hücrelerde, iyi bilinen mtDNA bakım faktörlerinin susturulması üzerine HeLa hücrelerinde ve bir mtDNA replikasyon inhibitörü ile tedaviden sonra HeLa hücrelerinde test edildi. MtDNA seviyeleri ayrıca bağımsız bir yöntemle, yani qPCR ile ölçüldü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SiRNA karışımının hazırlanması
- Deneyin başlamasından bir gün önce, tohum hücreleri (örneğin, HeLa) 100 mm'lik bir tabakta ertesi gün% 70 -% 90 birleşime ulaşacak şekilde toplanır.
NOT: Tüm işlemler laminer akış odasında steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir. - Opti-MEM ortamında 140 nM'lik bir konsantrasyona seyreltilmiş uygun miktarda siRNA hazırlayın ( bkz. 96 delikli bir plaka rezervuar olarak kullanılabilir.
- Siyah 384 delikli hücre kültürü mikroplakasının her bir kuyucuğuna 5 μL siRNA çözeltisi (veya kontrol numuneleri için Opti-MEM ortamı) ekleyin.
NOT: Test edilen siRNA numunelerinin sayısına bağlı olarak, elektronik veya çok kanallı pipet kullanılabilir. - Opti-MEM ortamında uygun miktarda RNAiMAX transfeksiyon reaktif çözeltisi hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Her 100 μL ortam için 1 μL RNAiMAX ekleyin.
- 384 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 10 μL transfeksiyon reaktif çözeltisi ekleyin. Bunu yapmanın en uygun ve en hızlı yolu bir reaktif dağıtıcısıdır.
- SiRNA'yı transfeksiyon reaktifi ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
2. Transfeksiyon için hücrelerin hazırlanması
- Kuluçka sırasında (adım 1.6), bir emme cihazı kullanarak ortamı aspire edin (bakınız Malzeme Tablosu) ve hücreleri 3 mL PBS ile yıkayın.
- PBS'de 1:2 oranında seyreltilmiş 1.5 mL tripsin ekleyin ve hücreleri 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin; eğer öyleyse,% 10 FBS ile 3 mL DMEM ortamı ekleyin. Hücreleri iyice askıya alın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Süspansiyonun en az 150 μL'sini alın ve bir hücre sayma odasındaki hücreleri sayın (bkz.
- DMEM ortamında% 10 FBS, penisilin ve streptomisin ile uygun konsantrasyonda (HeLa hattı için 35.000 / mL) bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
3. Hücre transfeksiyonu
- Reaktif dağıtıcıyı kullanarak 384 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 20 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Bu, kuyu başına tohumlanan 700 hücre ile sonuçlanacaktır.
- Hücreleri oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin ve ardından inkübatöre 72 saat (37 ° C ve% 5 CO2) yerleştirin.
4. BrdU kuruluşu
- DMEM ortamında% 10 FBS ile 90 μM'lik bir BrdU çözeltisi hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- SiRNA transfeksiyonundan 56 saat sonra (hücre fiksasyonundan 16 saat önce), 384 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 10 μL 90 μM BrdU çözeltisi ekleyin (nihai BrdU konsantrasyonu 20 μM'dir).
NOT: Eylem mümkün olduğunca hızlı gerçekleştirilmelidir; Bu nedenle, bir reaktif dağıtıcı, elektronik pipet veya çok dağıtıcılı pipet kullanmak en iyisidir. BrdU eklemeden kontrol kuyuları hazırlamayı unutmayın. - Hücreleri 16 saat boyunca inkübe edin (37 ° C ve% 5 CO2).
5. Mitokondrinin etiketlenmesi
- DMEM'de% 10 FBS ile 20 μM'lik bir BrdU çözeltisi hazırlayın ve buna mitokondri izleme boya çözeltisini ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1.1 μM'lik bir konsantrasyona ekleyin.
- BrdU birleşmesinin başlamasından 15 saat sonra (hücre fiksasyonundan 1 saat önce), 384 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 10 μL mitokondri izleme boya çözeltisi ekleyin (bkz.
NOT: Bir reaktif dağıtıcısı, elektronik pipet veya çok dağıtıcılı pipet kullanın. BrdU ilavesi olmadan ancak mitokondri izleme boyasının eklenmesiyle kontrol kuyularını korumayı unutmayın. - Hücreleri 1 saat boyunca inkübe edin (37 ° C ve% 5 CO2).
6. Hücre fiksasyonu
NOT: Tüm yıkama en uygun şekilde bir mikroplaka yıkayıcı kullanılarak gerçekleştirilirken, reaktiflerin eklenmesi en hızlı şekilde bir reaktif dağıtıcısı kullanılarak gerçekleştirilir.
- Mikroplaka yıkayıcıyı kullanarak ( bkz. Malzeme Tablosu), her bir kuyucuğu 100 μL PBS ile iki kez durulayın. İkinci yıkamadan sonra, kuyuda 25 μL PBS bırakın.
NOT: PBS'yi kuyuda bırakmak, bir sonraki adımda sıvı ilavesi sırasında hücre ayrılma olasılığını azaltır. Tüm yıkamalar PBS bırakılarak tamamlanır; bu nedenle, bir sonraki adımda eklenen çözelti, kalan PBS'ye eşit hacimde ekleneceği için her zaman 2x konsantrasyonda hazırlanmalıdır. - PBS'de %0,4 Triton X-100 ve Hoechst 33342 ile 4 μg/mL konsantrasyonda 25 μL% 8'lik bir formaldehit çözeltisi ekleyerek hücreleri sabitleyin (bireysel reaktiflerin nihai konsantrasyonları sırasıyla% 4,% 0,2 ve 2 μg / mL'dir ) (bkz.
- Plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
7. Engelleme
- Her bir kuyucuğu 100 μL PBS ile dört kez durulayın. Son yıkamadan sonra, kuyuda 25 μL PBS bırakın.
- Her bir oyuğa PBS'de 25 μL% 6 BSA ekleyin (nihai BSA konsantrasyonu% 3'tür).
- Plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
8. Primer antikorların eklenmesi
- BSA'yı bir mikroplaka yıkayıcı kullanarak aspire edin ve kuyuda 10 μL çözelti bırakın.
- PBS'de% 3 BSA'da hazırlanan primer antikor çözeltisinden 10 μL ekleyin. 0.8 μg / mL'de anti-BrdU ve 0.4 μg / mL'de anti-DNA kullanın (antikorların nihai konsantrasyonları sırasıyla 0.4 μg / mL ve 0.2 μg / mL'dir) ( bkz.
- Plakayı karanlıkta gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
9. İkincil antikorların eklenmesi
- Her bir kuyucuğu 100 μL PBS ile dört kez durulayın. Son yıkamadan sonra, kuyuda 10 μL PBS bırakın.
- PBS'de% 6 BSA'da hazırlanan 4 μg / mL ikincil antikor çözeltisinden 10 μL ekleyin (nihai konsantrasyon 2 μg / mL'dir). Alexa Fluor 488 ve Alexa Fluor 555 gibi florokromlara konjuge edilmiş izotipe özgü antikorlar (anti-fare IgG1 ve anti-fare IgM) kullanın (bkz.
- Plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Her bir kuyucuğu 100 μL PBS ile dört kez durulayın. Son yıkamadan sonra, kuyuda 50 μL PBS bırakın.
- Plakayı yapışkan bir sızdırmazlık filmi ile kapatın (bakınız Malzeme Tablosu) ve karanlıkta 4 ° C'de saklayın. Görüntüleme 2 hafta içinde yapılmalıdır.
10. Görüntüleme
NOT: Görüntüleme otomatik geniş alan mikroskobu ile yapılmalıdır; Mikroskop, plakanın tek tek alanlarını otomatik olarak görüntülemek için kontrollerle donatılmış bir motor aşaması ile donatılmalıdır.
- Plakanın köşe alanlarındaki (A1, A24, P24, P1 kuyuları) ve ortadaki otomatik netleme ayarlarını kontrol edin.
NOT: Görüntüleme için, mümkün olan en yüksek sayısal açıklığa sahip 20x kısa çalışma mesafesi hedefi (bkz. Malzeme Tablosu) kullanılması önerilir. - Canlı görüntü modunda görüntüleme yazılımı tarafından oluşturulan yoğunluk histogramlarına bağlı olarak, elde edilen görüntünün aşırı doygun olmaması için her bir floresan kanalı için yeterince uzun bir pozlama süresi seçin.
- Z ekseninde görüntüleme için uygun düzlem sayısını ayarlayın.
NOT: 20x büyütmedeki görüş alanı, tüm hücrelerin aynı odak düzleminde olmayacağı kadar büyüktür, bu nedenle tüm hücreleri doğru odak düzleminde görüntülemek için z kesiti yapılmalıdır. Genellikle beş uçak yeterlidir. Disk alanının kullanılabilirliğine bağlı olarak, tek tek z yığınları veya yalnızca maksimum yoğunluk projeksiyonları kaydedilebilir. Temsili sonuçlar bölümünde gösterilen görüntü analizi, maksimum yoğunluk projeksiyonlarına dayanmaktadır. - Kuyu başına görüntülenecek uygun sayıda görüş alanı seçin.
NOT: Birleşime bağlı olarak, bir görüş alanında yaklaşık 60-300 hücre görüntülenebilir. Tipik olarak,% 60 -% 90'lık bir birleşime sahip HeLa hücreleri için, beş görüş alanını görüntülemek, birinin 500 hücreden 1.000'den fazla hücreye analiz etmesine izin verecektir. - Görüntülenecek kuyucukları seçin ve görüntülemeye başlayın.
11. Kantitatif görüntü analizi
NOT: Elde edilen görüntülerin nicel analizi, Cell Profiler15 gibi açık kaynaklı bir yazılım kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu çalışma için analiz ScanR 3.0.0 yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bkz.
- Tüm floresan kanallarından gelen tüm görüntüler için arka plan düzeltmesi yaparak analize başlayın. Analiz edilen nesnelerin boyutuna bağlı olarak, uygun filtre boyutunu seçin: hücre çekirdekleri için 80 piksel ve BrdU ve mtDNA lekeleri için 4 piksel.
- Floresan sinyalinin yoğunluğunun hücre çekirdeğine karşılık gelen kanalın arka planına oranına bağlı olarak ana nesnenin bir maskesini oluşturarak görüntüyü bölümlere ayırmaya başlayın.
- Verilen yapılara uygun floresan kanallarını kullanarak sırasıyla BrdU ve mtDNA lekelerini temsil eden alt nesneler için maskeler oluşturun.
NOT: Her alt nesne en yakın ana nesneye (hücre çekirdeği) atanır. - Analiz sırasında ölçülecek parametreleri ayarlayın ve tüm floresan kanalları için her maskedeki ayrı piksellerin yoğunluğunu ölçün.
NOT: Belirli bir hücre çekirdeğine atanan alt nesnelerin sayısını ve her bir alt nesnenin alanını hesaplamak da gereklidir. - Elde edilen verilere dayanarak hesaplanacak türetilmiş parametreleri tanımlayın. BrdU veya mtDNA kanalı için toplam floresan yoğunluklarını elde etmek için, belirli bir hücre çekirdeğine atanan tüm alt nesnelerin yoğunluklarını toplayın. Ortalama floresan yoğunluğunu elde etmek için, toplam floresan yoğunluğunu, belirli bir hücre çekirdeğine atanan alt nesnelerin alanının toplamına bölün.
NOT: Oluşturulan alt nesnenin (BrdU veya mtDNA noktası) aslında mitokondride bulunduğundan emin olmak için, mitokondri izleme boyasından gelen floresan yoğunluğuna göre bunları geçmek gerekir. - Aşağıdaki paketlerle birlikte R 4.2.2 istatistik Yazılımı16'yı kullanarak ScanR yazılımı ile elde edilen verilerin daha fazla analizini yapın: dplyr 17, data.table 18, ggplot2 19 ve ggpubr20. Bu adım isteğe bağlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
mtDNA sentezi ve dağılımının dinamiklerinin yüksek verimli çalışması için prosedürün bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Çok kuyucuklu plaka formatının kullanılması, bir siRNA kütüphanesi kullanılarak farklı genlerin susturulması gibi birçok farklı deneysel koşulun eşzamanlı analizini sağlar. Yeni sentezlenen DNA moleküllerinin BrdU ile etiketlenmesi için kullanılan koşullar, HeLa hücrelerinin mitokondrilerinde BrdU etiketli DNA'nın tespit edilmesine izin verir (Şekil 2A), ancak diğer hücre tipleri için tahlilin kurulmasında başlangıç koşulları olarak da kullanılabilir. BrdU ile inkübasyon süresi, bir zaman rotası deneyi temelinde bireysel hücre hatları için seçilmelidir (Ek Şekil 1). Bu çalışmada, siRNA'ların taranması yüksek verimlilikle transfekte edilebilen hücreler gerektirdiğinden, HeLa hücreleri kullanılmıştır. Önemli olarak, anti-BrdU antikorları ile elde edilen sinyal spesifiktir, çünkü sadece BrdU ile tedavi edilen hücrelerde gözlenebilir (Şekil 2). Anti-BrdU ve anti-DNA etiketlemesinin özgüllükleri, mitokondriyal DNA21'den yoksun rho0 hücreleri kullanılarak daha da doğrulanmıştır (Ek Şekil 2). Beklendiği gibi, bu hücrelerde, BrdU tedavisinden bağımsız olarak, mitokondride hem anti-BrdU hem de anti-DNA antikorları için sinyal tespit edilmedi (Şekil 2B). Anti-BrdU antikorlarından gelen floresan sinyalinin ölçülmesi, BrdU ile tedavi edilen rho0 hücrelerinin, BrdU-işlenmemiş hücrelerle aynı düşük floresan seviyesini gösterdiğini, ebeveyn hatları A549 ve HeLa için sinyalin ise ortalama 50 kat daha yüksek olduğunu göstermiştir (Şekil 2C).
Burada sunulan yöntemin mitokondriyal DNA sentezi ve dağılımı çalışmasında yararlılığını göstermek için, HeLa hücrelerinin mtDNA sentezi22'nin bir inhibitörü olan 2′,3′-dideoksisitidin (ddC) ile muamele edildiği ve mtDNA replikasyonu için gerekli olduğu bilinen genlerin ekspresyonunun siRNA ile susturulduğu bir deney yapılmıştır (Şekil 3). Hücrelerin ddC ile tedavisi, BrdU birleşmesinin tamamen inhibisyonuna yol açarken, kullanılan siRNA'ların çeşitli etkileri vardı. Twinkle helikazın (TWNK)23 aşağı regülasyonu, BrdU kuruluşunun en güçlü inhibisyonuna yol açtı; TFAM proteini24 için daha zayıf bir etki gözlenirken, mitokondriyal DNA polimeraz gamasının (POLG)25 susturulması, negatif kontrol siRNA ile tedavi edilen hücrelere kıyasla BrdU katılımında ılımlı bir azalmaya yol açmıştır (Şekil 3A, B). Prosedürde anti-DNA antikorlarının kullanılması, verilen deneysel koşullar altında hücredeki mtDNA dağılımının izlenmesine izin verir. TFAM'ın aşağı regülasyonu, mtDNA dağılımında ciddi değişikliklere yol açtı; Kontrol hücrelerine kıyasla daha az mtDNA lekesi tespit edildi, ancak kalanlar çok yüksek floresan yoğunluğuna sahipti (Şekil 3A). Anti-DNA antikorundan gelen ortalama floresan sinyalinin ölçülmesi, test edilen diğer koşullara kıyasla TFAM susturulması üzerine birkaç kat artış göstermiştir (Şekil 3C).
Görüntüleme sonuçlarının özgüllüğü, kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) yardımıyla mtDNA ve gen ekspresyon düzeyleri ölçülerek doğrulandı (Şekil 4). Yöntem,26. maddenin başka bir yerinde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. ddC ile tedavi, mtDNA seviyelerinde çok güçlü bir düşüşe neden oldu; TFAM ve TWNK susturma durumunda daha zayıf bir etki gözlenirken, POLG siRNA içeren hücrelerin transfeksiyonu mtDNA kopya sayısı üzerinde çok mütevazı bir etkiye sahipti (Şekil 4A). TFAM ve TWNK ekspresyonunun ölçülmesi, mRNA seviyesindeki ekspresyonu %30'a düşürülen POLG'nin aksine, ekspresyonlarında kontrol seviyelerinin ~%15-%20'sine etkili bir azalma olduğunu doğruladı (Şekil 4B).
Şekil 1: Protokol adımlarının şematik gösterimi. Mikroskobik görüntüler için ölçek çubukları 10 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Anti-BrdU antikorları ile mtDNA'ya BrdU katılımının spesifik tespiti. Anti-BrdU (yeşil) ve anti-DNA (kırmızı) antikorları ile immünofloresan boyamaya tabi tutulan (A) HeLa ve (B) A549 ve A549 rho0 hücrelerinin örnek görüntüleri. Hücreler BrdU çözeltisi ile tedavi edildi veya tedavi edilmedi. Nükleer DNA (mavi) Hoechst ile etiketlendi ve mitokondri (camgöbeği) bir mitokondri izleme boyası ile görselleştirildi. Dört floresan kanalının tümünün birleştirilmiş bir görüntüsü gösterilir. Ölçek çubuğu 10 μm'yi temsil eder. (C) Anti-BrdU antikorlarından gelen sinyalin nicelleştirilmesinin sonucu. Analiz dört bağımsız biyolojik kopya için gerçekleştirildi; Her seferinde rastgele seçilmiş 100 hücre her deneysel koşul için analiz edilmiştir (N = 400 hücre). Ortalama olarak, hücre başına 18 BrdU odağı tespit edildi. Kutular çeyrekler arası aralığın (IQR) birinci ve üçüncü çeyreğini temsil eder, medyan yatay bir çizgiyle temsil edilir, bıyıklar minimum ve maksimumu tanımlar ve aykırı değerler 1,5 x IQR olarak tanımlanır. Kruskal-Wallis istatistiksel testi yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: BrdU katılımının verimliliğini azaltmak ve nükleoidlerin dağılımını etkilemek de dahil olmak üzere mtDNA sentezinin inhibisyonunun sonuçları. (A) mtDNA replikasyonunda yer alan proteinleri aşağı regüle eden ddC veya siRNA ile 72 saat boyunca tedavi edilen HeLa hücrelerinin örnek floresan görüntüleri. Hücreler fiksasyondan önce 16 saat boyunca BrdU ile tedavi edildi. Nükleer DNA (mavi) Hoechst ile boyandı, anti-BrdU (yeşil) ve anti-DNA (kırmızı) antikorları kullanıldı ve mitokondri mitokondri izleme boyası ile etiketlendi. Dört floresan kanalının tümünün birleştirilmiş bir görüntüsü gösterilir. Ölçek çubuğu 10 μm. (B,C) (B) anti-BrdU ve (C) anti-DNA antikorlarından gelen floresan sinyallerinin nicelleştirilmesini temsil eder. Analiz dört bağımsız biyolojik kopya için gerçekleştirildi; Her seferinde rastgele seçilmiş 650 hücre analiz edildi her deneysel koşul için (N = 2.600 hücre). Ortalama olarak, hücre başına 18 BrdU odağı ve 46 mtDNA odağı tespit edildi. Kutular çeyrekler arası aralığın (IQR) birinci ve üçüncü çeyreğini temsil eder, medyan yatay bir çizgiyle temsil edilir, bıyıklar minimum ve maksimumu tanımlar ve aykırı değerler 1,5 x IQR olarak tanımlanır. Kruskal-Wallis istatistiksel testi yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: mtDNA sentezinin inhibisyonunun etkinliğinin ve test edilen siRNA'ların etkinliğinin doğrulanması. HeLa hücreleri ddC veya belirtilen siRNA'larla 72 saat boyunca tedavi edildi ve daha sonra DNA ve RNA izolasyonuna tabi tutuldu. (A) qPCR kullanılarak mtDNA düzeyi analizinin sonuçları. (B) Belirtilen koşullar altında gen ekspresyonu değişikliklerinin qPCR analizi. Çubuklar, dört bağımsız biyolojik kopyanın ortalama değerlerini temsil eder; hata çubukları SEM'i temsil eder; ANOVA istatistiksel testi yapıldı; Untr (işlenmemiş) örneklerle ikili karşılaştırma için bir t-testi yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: BrdU'nun HeLa hücrelerinin mtDNA'sına dahil edilmesinin dinamikleri. Hücrelerin belirli bir süre için 20 μM BrdU ile inkübe edildiği bir zaman kursu deneyinin sonuçları gösterilmiştir. Her zaman noktası için dört bağımsız çoğaltmanın araçları gösterilir; Her replikada rastgele seçilmiş 900 hücre analiz edildi. Çubuklar dört kopyanın araçlarını temsil eder; ANOVA istatistiksel testi yapıldı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: A549 rho0 hücrelerinin doğrulanması. (A) mtDNA ile kodlanmış ND1 ve nükleer DNA ile kodlanmış B2M genlerinin DNA fragmanlarının çoğaltılmasından qPCR ürünlerinin elektroforetik analizi. A549 veya A549 rho0 hücrelerinden elde edilen toplam DNA, reaksiyonda şablon olarak kullanıldı. (B) qPCR kullanılarak mtDNA düzeyi analizinin sonuçları. Çubuklar, dört bağımsız biyolojik kopyanın ortalama değerlerini temsil eder; hata çubukları SEM'i temsil eder; T-testi yapıldı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tarihsel olarak, BrdU birleştirme ve antikor tespiti ile DNA etiketleme, nükleer DNA replikasyonu ve hücre döngüsü araştırmalarında kullanılmıştır 14,27,28. Şimdiye kadar, BrdU etiketli DNA'yı tespit etmek için tüm protokoller, epitop maruziyetini sağlamak ve antikor penetrasyonunu kolaylaştırmak için bir DNA denatürasyon adımı (asidik veya termal) veya enzim sindirimi (DNaz veya proteinaz) içermektedir. Bu protokoller sıkıca paketlenmiş nükleer DNA için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, mtDNA'nın farklı organizasyonu, denatürasyon adımı olmadan bir prosedürün geliştirilmesini sağlamıştır; Bu, prosedürü basitleştirdi ve yüksek verimli uygulamalar için daha uygun hale getirdi. Bu yaklaşım mükemmel sonuçlar getirmiştir, çünkü denatürasyon adımının atlanması, BrdU etiketli DNA'nın sadece çekirdeğin dışında tespit edilmesine neden olur (Şekil 2 ve Şekil 3). Sonuç olarak, bir denatürasyon adımı dahil edildiğinde her zaman mevcut olan ve BrdU etiketli mtDNA29'dan gelen sinyali maskeleyerek ciddi bir soruna neden olabilecek nükleer DNA'dan gelen güçlü sinyal, bu protokolle önlenebilir. Ek olarak, sert denatürasyon eksikliği, hücresel yapıların daha iyi korunmasını sağlar ve Hoechst veya mitokondri izleme boyası gibi floresan lekelerle boyama verimliliğini etkilemez (Şekil 2 ve Şekil 3).
BrdU'nun mtDNA'ya dahil edilmesinin dinamikleri hücre hattına bağımlıdır. BrdU birleştirme üzerinde bir zaman kursu deneyi yapmak, yeni bir hücre hattı kullanıldığında önerilir. Bu çalışma, HeLa hücre hatları için optimal bir BrdU inkübasyon süresi olarak 16 saat belirlemiştir. Bununla birlikte, farklı laboratuvarlardan HeLa hatlarındaki biyolojik varyasyon nedeniyle,30, birlikte çalışmayı planladığı belirli HeLa varyantı üzerinde bir BrdU zaman kursu deneyi yapılması önerilmektedir.
Bu protokoldeki anti-BrdU ve anti-DNA etiketlemesinin kombinasyonu, mtDNA sentezinin izlenmesine ve hücredeki mtDNA dağılımının eşzamanlı çalışmasına izin verir. Bu, TFAM ile susturulmuş hücrelerde çok iyi görülebilir (Şekil 3). TFAM seviyesinin azaltılması, mtDNA sentezinde bir azalmaya (azalmış toplam anti-BrdU sinyali) ve ortalama mtDNA floresan sinyalinde önemli bir artışla kendini gösteren mitokondriyal nükleoidlerin kümelenmesine yol açar (Şekil 3). Bu durumda, ortalama mtDNA floresan yoğunluğundaki artışın, mitokondriyal nükleoidlerin değişen dağılımından kaynaklandığı ve mtDNA seviyelerinin yukarı regülasyonunu yansıtmadığı belirtilmelidir; Aslında, ktitatif PCR analizi ile ortaya konduğu gibi, mtDNA seviyeleri azalır (Şekil 4A). POLG siRNA ile transfekte edilen hücreler için şaşırtıcı sonuçlar elde edildi (Şekil 3). Mitokondrideki replikatif DNA polimeraz olan siRNA hedefli POLG ile hücrelerin transfeksiyonunun, BrdU'nun mtDNA'ya dahil edilmesini önemli ölçüde azaltacağı beklenebilir. Bununla birlikte, bu çalışmada, BrdU birleşmesi üzerindeki etki ihmal edilebilir düzeydeydi (Şekil 3), qPCR kullanılarak mtDNA seviyelerinin ölçülmesiyle daha da doğrulandı (Şekil 4A). POLG ekspresyonunun zayıf downregülasyonu, uygulanan siRNA ile hücrelerin transfeksiyonu üzerine görünüşte çelişkili olan bu sonucu açıklayabilir (Şekil 4B). Bu, fonksiyonel çalışmalar için siRNA kullanmanın potansiyel bir dezavantajını vurgulamakta ve gen susturma doğrulamasına ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir.
Genel olarak, kültürlü hücrelerde mtDNA metabolizmasının dinamiklerini incelemek için, mtDNA replikasyonunu, onarımını ve dağıtımını tespit etmek ve ölçmek için çok kuyucuklu bir plaka formatı ve immünofloresan görüntüleme kullanan bir tahlil geliştirilmiştir. Yöntem, birçok farklı deneysel koşulun aynı anda incelenmesine izin verir. Çeşitli inhibitörlerin, hücresel streslerin ve gen susturmanın mtDNA metabolizması üzerindeki etkilerini araştırmak için kullanılabilir. Tahlil, mtDNA metabolizmasını çeşitli fizyolojik ve patolojik bağlamlarda incelemede kullanım için yüksek bir potansiyele sahip olsa da, tahlilin replikasyon ve onarıma bağlı mtDNA sentezinin ayırt edilmesine izin vermediği belirtilmelidir. Sonuçları yorumlarken ve sonraki fonksiyonel deneyleri planlarken bu dikkate alınmalıdır. Özellikle, tahlil geliştirme için daha fazla potansiyele sahiptir. Örneğin, replikasyon inaktif (veya onarım inaktif) mitokondriyal nükleoidler anti-BrdU antikorları ile tespit edilmez. Bu nedenle, anti-DNA antikorlarının uygulanması, mtDNA durum seviyelerinin, replikasyon sessiz nükleoidlerin sayısının ve nükleoidlerin hücre içindeki dağılımının kantitasyonunu sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Polonya Ulusal Bilim Merkezi tarafından desteklenmiştir (Hibe/Ödül Numarası: 2018/31/D/NZ2/03901).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284 (2019).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102 (2020).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
- Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579 (2020).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S.
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
- Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
- Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2021).
- Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021).
- Dowle, M., Srinivasan, A. data.table: Extension of `data.frame. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016).
- Kassambara, A. ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020).
- Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
- Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
- Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
- Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
- Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
- Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
- Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).
