Summary
En procedure til undersøgelse af dynamikken i mitokondrie-DNA (mtDNA) metabolisme i celler ved hjælp af et multi-well pladeformat og automatiseret immunfluorescensbilleddannelse til påvisning og kvantificering af mtDNA-syntese og distribution er beskrevet. Dette kan yderligere bruges til at undersøge virkningerne af forskellige hæmmere, cellulære spændinger og genhæmning på mtDNA-metabolisme.
Abstract
Langt de fleste cellulære processer kræver en kontinuerlig energiforsyning, hvis mest almindelige bærer er ATP-molekylet. Eukaryote celler producerer det meste af deres ATP i mitokondrierne ved oxidativ phosphorylering. Mitokondrier er unikke organeller, fordi de har deres eget genom, der replikeres og videregives til den næste generation af celler. I modsætning til det nukleare genom er der flere kopier af mitokondriegenomet i cellen. Den detaljerede undersøgelse af de mekanismer, der er ansvarlige for replikation, reparation og vedligeholdelse af mitokondriegenomet, er afgørende for at forstå, at mitokondrier og hele celler fungerer korrekt under både normale og sygdomsforhold. Her præsenteres en metode, der muliggør kvantificering af høj kapacitet af syntese og distribution af mitokondrie-DNA (mtDNA) i humane celler dyrket in vitro . Denne fremgangsmåde er baseret på immunofluorescensdetektion af aktivt syntetiserede DNA-molekyler mærket med 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU) inkorporering og samtidig påvisning af alle mtDNA-molekyler med anti-DNA-antistoffer. Derudover visualiseres mitokondrierne med specifikke farvestoffer eller antistoffer. Dyrkning af celler i et multibrøndformat og brugen af et automatiseret fluorescensmikroskop gør det lettere at studere dynamikken i mtDNA og mitokondriernes morfologi under forskellige eksperimentelle forhold på relativt kort tid.
Introduction
For de fleste eukaryote celler er mitokondrier essentielle organeller, da de spiller en afgørende rolle i mange cellulære processer. Først og fremmest er mitokondrier de vigtigste energileverandører af celler1. Mitokondrier er også involveret i regulering af cellulær homeostase (for eksempel intracellulær redox2 og calciumbalancen3), cellesignalering4,5, apoptose6, syntesen af forskellige biokemiske forbindelser 7,8 og det medfødte immunrespons9. Mitokondriel dysfunktion er forbundet med forskellige patologiske tilstande og menneskelige sygdomme10.
Mitokondriernes funktion afhænger af den genetiske information, der er placeret i to separate genomer: de nukleare og mitokondrie genomer. Mitokondriegenomet koder for et lille antal gener sammenlignet med det nukleare genom, men alle de mtDNA-kodede gener er afgørende for menneskelivet. Mitokondrieproteinmaskineriet, der er nødvendigt for at opretholde mtDNA'et, kodes af nDNA. De grundlæggende komponenter i mitokondrie-replisomet samt nogle mitokondriebiogenesefaktorer er allerede blevet identificeret (gennemgået i tidligere forskning11,12). Imidlertid er mitokondrie-DNA-replikations- og vedligeholdelsesmekanismer stadig langt fra at blive forstået. I modsætning til nDNA findes mitokondriegenomet i flere kopier, hvilket giver et ekstra lag til regulering af mitokondriel genekspression. Meget mindre er i øjeblikket kendt om fordelingen og adskillelsen af mtDNA inden for organeller, i hvilket omfang disse processer er reguleret, og hvis de er, hvilke proteiner der er involveret13. Segregeringsmønsteret er afgørende, når celler indeholder en blandet population af vildtype og muteret mtDNA. Deres ulige fordeling kan føre til generering af celler med en skadelig mængde muteret mtDNA.
Indtil videre er de proteinfaktorer, der er nødvendige for mtDNA-vedligeholdelse, hovedsageligt blevet identificeret ved biokemiske metoder, bioinformatiske analyser eller gennem sygdomsassocierede undersøgelser. I dette arbejde beskrives en anden strategi for at sikre en stor chance for at identificere faktorer, der tidligere har undgået identifikation. Metoden er baseret på mærkning af mtDNA under replikation eller reparation med 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU), en nukleosidanalog af thymidin. BrdU inkorporeres let i spirende DNA-strenge under DNA-syntese og bruges generelt til overvågning af replikationen af nukleært DNA14. Imidlertid er proceduren udviklet her optimeret til påvisning af BrdU inkorporeret i mtDNA ved hjælp af immunofluorescens af anti-BrdU-antistoffer.
Tilgangen giver mulighed for kvantificering af mtDNA-syntese og -distribution med høj kapacitet i humane celler dyrket in vitro. En strategi med høj kapacitet er nødvendig for at gennemføre test under forskellige eksperimentelle betingelser på relativt kort tid; Derfor foreslås det i protokollen at anvende et multibrøndformat til celledyrkning og automatiseret fluorescensmikroskopi til billeddannelse. Protokollen inkluderer transfektion af humane HeLa-celler med et siRNA-bibliotek og den efterfølgende overvågning af mtDNA-replikation eller reparation ved hjælp af metabolisk mærkning af nyligt syntetiseret DNA med BrdU. Denne fremgangsmåde kombineres med immunfarvning af DNA'et ved hjælp af anti-DNA-antistoffer. Begge parametre analyseres ved hjælp af kvantitativ fluorescensmikroskopi. Derudover visualiseres mitokondrier med et specifikt farvestof. For at demonstrere protokollens specificitet blev BrdU-farvning testet på celler uden mtDNA (rho0-celler), på HeLa-celler ved hæmning af velkendte mtDNA-vedligeholdelsesfaktorer og på HeLa-celler efter behandling med en mtDNA-replikationshæmmer. mtDNA-niveauerne blev også målt ved en uafhængig metode, nemlig qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af siRNA-blandingen
- En dag før forsøgets start, frøceller (f.eks. HeLa) på en 100 mm skål, så de når 70% -90% sammenløb den næste dag.
BEMÆRK: Alle operationer skal udføres under sterile forhold i et laminært flowkammer. - Forbered den passende mængde siRNA fortyndet til en koncentration på 140 nM i Opti-MEM-medium (se materialetabel). En 96-brøndplade kan bruges som reservoir.
- Der tilsættes 5 μL af siRNA-opløsningen (eller Opti-MEM-substratet til kontrolprøverne) til hvert hul i en sort 384-brønds cellekulturmikroplade.
BEMÆRK: Afhængigt af antallet af testede siRNA-prøver kan en elektronisk pipette eller multikanalpipette anvendes. - Forbered den passende mængde RNAiMAX-transfektionsreagensopløsning (se materialetabel) i Opti-MEM-medium. Der tilsættes 1 μL RNAiMAX for hver 100 μL medium.
- Der tilsættes 10 μL transfektionsreagensopløsning til hvert hul i 384-brøndpladen. Den mest bekvemme og hurtigste måde at gøre dette på er med en reagensdispenser.
- Inkuber siRNA'et med transfektionsreagenset i 30 minutter ved stuetemperatur.
2. Forberedelse af celler til transfektion
- Under inkubationen (trin 1.6) aspireres mediet ved hjælp af en sugeanordning (se materialetabellen), og cellerne vaskes med 3 ml PBS.
- Tilsæt 1,5 ml trypsin fortyndet 1:2 i PBS, og inkuber cellerne ved 37 °C i 10 minutter.
- Kontroller, om cellerne har løsnet sig; Hvis det er tilfældet, tilsættes 3 ml DMEM-medium med 10% FBS. Suspender cellerne grundigt, og overfør dem til et 15 ml rør. Der udtages mindst 150 μL af suspensionen, og cellerne tælles i et celletællekammer (se Materialetabel).
- Forbered en cellesuspension i den passende koncentration (35.000/ml for HeLa-slangen) i DMEM-medium med 10% FBS, penicillin og streptomycin.
3. Celletransfektion
- Der tilsættes 20 μL af cellesuspensionen til hvert hul i 384-brøndpladen ved hjælp af reagensdispenseren. Dette vil resultere i 700 celler podet pr. Brønd.
- Inkuber cellerne i 1 time ved stuetemperatur, og anbring dem derefter i inkubatoren i 72 timer (37 ° C og 5% CO2).
4. BrdU-inkorporering
- Forbered en 90 μM opløsning af BrdU (se materialetabel) i DMEM-medium med 10% FBS.
- Ved 56 timer efter siRNA-transfektionen (16 timer før cellefiksering) tilsættes 10 μL 90 μM BrdU-opløsning til hvert hul i 384-brøndpladen (den endelige BrdU-koncentration er 20 μM).
BEMÆRK: Handlingen skal udføres så hurtigt som muligt; Derfor er det bedst at bruge en reagensdispenser, elektronisk pipette eller multidispenserpipette. Husk at forberede kontrolbrønde uden tilsætning af BrdU. - Cellerne inkuberes i 16 timer (37 °C og 5 % CO2).
5. Mærkning af mitokondrier
- Forbered en 20 μM opløsning af BrdU i DMEM med 10% FBS, og tilsæt mitokondrier tracking farvestofopløsning (se tabel over materialer) til en koncentration på 1,1 μM.
- 15 timer efter starten af BrdU-inkorporeringen (1 time før cellefiksering) tilsættes 10 μL mitokondriesporingsfarvestofopløsningen (se materialetabellen) til hvert hul i 384-brøndpladen (den endelige farvestofkoncentration er 200 nM).
BEMÆRK: Brug en reagensdispenser, elektronisk pipette eller multidispenserpipette. Husk at bevare kontrolbrønde uden tilsætning af BrdU, men med tilsætning af mitokondriesporingsfarvestoffet. - Inkuber cellerne i 1 time (37 °C og 5% CO2).
6. Cellefiksering
BEMÆRK: Al vask udføres mest bekvemt ved hjælp af en mikropladeskive, mens tilsætning af reagenser hurtigst udføres ved hjælp af en reagensdispenser.
- Brug mikropladevaskeren (se materialetabellen) til at skylle hvert hul to gange med 100 μL PBS. Efter den anden vask efterlades 25 μL PBS i brønden.
BEMÆRK: At forlade PBS i brønden reducerer sandsynligheden for cellefrigørelse under tilsætning af væske i næste trin. Alle vaske er færdige med PBS tilbage i; derfor skal opløsningen, der tilsættes i næste trin, altid fremstilles i en koncentration på 2x, da den tilsættes i et lige så stort volumen til den resterende PBS. - Cellerne fikseres ved at tilsætte 25 μL af en 8% formaldehydopløsning i PBS med 0,4% Triton X-100 og Hoechst 33342 i en koncentration på 4 μg/ml (de endelige koncentrationer af individuelle reagenser er henholdsvis 4%, 0,2% og 2 μg/ml) (se materialetabel).
- Inkuber pladen i mørke ved stuetemperatur i 30 min.
7. Blokering
- Hvert hul skylles fire gange med 100 μL PBS. Efter den sidste vask efterlades 25 μL PBS i brønden.
- Der tilsættes 25 μL 6% BSA i PBS (den endelige BSA-koncentration er 3%) til hvert hul.
- Inkuber pladen i mørke ved stuetemperatur i 30 min.
8. Tilsætning af de primære antistoffer
- Opsug BSA ved hjælp af en mikropladeskive, og lad 10 μL opløsning stå i brønden.
- Der tilsættes 10 μL af den primære antistofopløsning fremstillet i 3% BSA i PBS. Brug anti-BrdU ved 0,8 μg/ml og anti-DNA ved 0,4 μg/ml (de endelige koncentrationer af antistoffer er henholdsvis 0,4 μg/ml og 0,2 μg/ml) (se materialetabel).
- Pladen inkuberes mørkt ved 4 °C natten over.
9. Tilsætning af sekundære antistoffer
- Hvert hul skylles fire gange med 100 μL PBS. Efter den sidste vask efterlades 10 μL PBS i brønden.
- Der tilsættes 10 μL af den sekundære 4 μg/ml antistofopløsning fremstillet i 6 % BSA i PBS (slutkoncentrationen er 2 μg/ml). Brug isotypespecifikke antistoffer (anti-mus IgG1 og anti-mus IgM) konjugeret til fluorochromer såsom Alexa Fluor 488 og Alexa Fluor 555 (se materialetabel).
- Inkuber pladen i mørke ved stuetemperatur i 1 time.
- Hvert hul skylles fire gange med 100 μL PBS. Efter den sidste vask efterlades 50 μL PBS i brønden.
- Pladen forsegles med en klæbende forseglingsfilm (se materialetabellen), og opbevar den mørkt ved 4 °C. Billeddannelse skal udføres inden for 2 uger.
10. Billedbehandling
BEMÆRK: Billeddannelse skal udføres med et automatiseret bredfeltmikroskop; Mikroskopet skal være udstyret med et motortrin, der er forsynet med betjeningsanordninger til automatisk at afbilde de enkelte områder af pladen.
- Kontroller autofokusindstillingerne i pladens hjørneområder (hul A1, A24, P24, P1) og i midten.
BEMÆRK: Til billeddannelse anbefales det at bruge et mål på 20x kort arbejdsafstand (se materialetabellen) med den højest mulige numeriske blænde. - Baseret på intensitetshistogrammerne, der genereres af billedbehandlingssoftwaren i Live View-tilstand, skal du vælge en tilstrækkelig lang eksponeringstid for de enkelte fluorescenskanaler, så det resulterende billede ikke overmættes.
- Indstil det passende antal planer til billeddannelse på z-aksen.
BEMÆRK: Synsfeltet ved 20x forstørrelse er stort nok til, at ikke alle celler er i samme fokusplan, så z-snit skal udføres for at se alle cellerne i deres korrekte fokusplan. Normalt er fem fly nok. Afhængigt af tilgængeligheden af diskplads kan individuelle z-stakke eller kun maksimale intensitetsfremskrivninger gemmes. Billedanalysen vist i afsnittet om repræsentative resultater er baseret på maksimale intensitetsfremskrivninger. - Vælg det passende antal visningsfelter, der skal vises pr. felt.
BEMÆRK: Afhængigt af sammenløbet kan ca. 60-300 celler afbildes i et synsfelt. For HeLa-celler med en sammenløb på 60% -90% vil billeddannelse af fem synsfelter typisk gøre det muligt at analysere fra 500 celler til over 1,000 celler. - Vælg de felter, der skal afbildes, og start billeddannelsen.
11. Kvantitativ billedanalyse
BEMÆRK: Den kvantitative analyse af erhvervede billeder kan udføres ved hjælp af en open source-software som Cell Profiler15. I denne undersøgelse blev analysen udført ved hjælp af ScanR 3.0.0-softwaren (se materialetabellen).
- Start analysen ved at udføre baggrundskorrektion for alle billederne fra alle fluorescenskanalerne. Afhængigt af størrelsen på de analyserede objekter skal du vælge den passende filterstørrelse: 80 pixels for cellekerner og 4 pixels for BrdU- og mtDNA-pletter.
- Start segmentering af billedet ved at oprette en maske af hovedobjektet baseret på forholdet mellem intensiteten af fluorescenssignalet og baggrunden for kanalen svarende til cellekernerne.
- Opret masker til underobjekterne, der repræsenterer henholdsvis BrdU- og mtDNA-pletterne ved hjælp af fluorescenskanalerne, der passer til de givne strukturer.
BEMÆRK: Hvert underobjekt tildeles det nærmeste hovedobjekt (cellekerne). - Indstil de parametre, der skal måles under analysen, og mål intensiteten af de enkelte pixels inden for hver maske for alle fluorescenskanalerne.
BEMÆRK: Det er også nødvendigt at beregne antallet af underobjekter, der er tildelt en given cellekerne og arealet af hvert underobjekt. - Definer de afledte parametre, der skal beregnes ud fra de opnåede data. For at opnå de samlede fluorescensintensiteter for BrdU- eller mtDNA-kanalen opsummeres intensiteterne af alle de underobjekter, der er tildelt en given cellekerne. For at opnå den gennemsnitlige fluorescensintensitet divideres den samlede fluorescensintensitet med summen af arealet af de underobjekter, der er tildelt en given cellekerne.
BEMÆRK: For at sikre, at det oprettede underobjekt (BrdU eller mtDNA-plet) faktisk er placeret i mitokondrierne, er det nødvendigt at gate dem baseret på fluorescensintensiteten fra mitokondriesporingsfarvestoffet. - Udfør yderligere analyse af de data, der er opnået med ScanR-softwaren ved hjælp af R 4.2.2 statistisk software 16 sammen med følgende pakker: dplyr 17, data.table18, ggplot219 og ggpubr20. Dette trin er valgfrit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et skema over proceduren for high-throughput undersøgelse af dynamikken i mtDNA-syntese og distribution er vist i figur 1. Brugen af et pladeformat med flere brønde muliggør samtidig analyse af mange forskellige eksperimentelle tilstande, såsom hæmning af forskellige gener ved hjælp af et siRNA-bibliotek. Betingelserne for mærkning af nyligt syntetiserede DNA-molekyler med BrdU muliggør påvisning af BrdU-mærket DNA i mitokondrier af HeLa-celler (figur 2A), men kan også bruges som startbetingelser for opsætning af analysen for andre celletyper. Inkubationstiden med BrdU bør vælges for individuelle cellelinjer på grundlag af et tidsforløbseksperiment (supplerende figur 1). I denne undersøgelse blev HeLa-celler brugt, da screening af siRNA'er kræver celler, der kan transfekteres med høj effektivitet. Det er vigtigt, at signalet opnået med anti-BrdU-antistoffer er specifikt, da det kun kan observeres i celler behandlet med BrdU (figur 2). Specificiteterne ved anti-BrdU- og anti-DNA-mærkning blev yderligere bekræftet ved hjælp af rho0-celler, der manglede mitokondrie-DNA21 (supplerende figur 2). Som forventet blev der i disse celler, uanset BrdU-behandling, ikke påvist noget signal i mitokondrierne for både anti-BrdU- eller anti-DNA-antistoffer (figur 2B). Kvantificering af fluorescerende signal fra anti-BrdU-antistofferne indikerede, at rho0-celler behandlet med BrdU viste det samme lave fluorescensniveau som de BrdU-ubehandlede celler, mens signalet for forældrelinjerne A549 og HeLa i gennemsnit var 50 gange højere (figur 2C).
For at vise nytten af den metode, der præsenteres her i undersøgelsen af mitokondriel DNA-syntese og distribution, blev der udført et eksperiment, hvor HeLa-celler blev behandlet med 2′,3′-dideoxycytidin (ddC), en hæmmer af mtDNA-syntese22, og ekspressionen af gener, der vides at være afgørende for mtDNA-replikation, blev tavs med siRNA (figur 3). Behandlingen af celler med ddC førte til fuldstændig hæmning af BrdU-inkorporering, mens de anvendte siRNA'er havde forskellige virkninger. Nedreguleringen af Twinkle helicase (TWNK)23 førte til den mest potente hæmning af BrdU-inkorporering; en svagere effekt blev observeret for TFAM-proteinet24, mens hæmningen af mitokondrie-DNA-polymerasegamma (POLG)25 førte til et moderat fald i BrdU-inkorporering sammenlignet med celler behandlet med negativt kontrolsiRNA (figur 3A,B). Anvendelsen af anti-DNA-antistoffer i proceduren muliggør overvågning af mtDNA-fordelingen i cellen under de givne eksperimentelle betingelser. Nedreguleringen af TFAM førte til drastiske ændringer i mtDNA-fordelingen; færre mtDNA-pletter blev påvist sammenlignet med kontrolceller, men de, der var tilbage, havde en meget høj fluorescensintensitet (figur 3A). Kvantificering af det gennemsnitlige fluorescenssignal fra anti-DNA-antistoffet viste en flere gange stigning ved TFAM-hæmning sammenlignet med de andre testede tilstande (figur 3C).
Specificiteten af billeddannelsesresultaterne blev verificeret ved at måle mtDNA- og genekspressionsniveauerne ved hjælp af kvantitativ realtids-PCR (qPCR) (figur 4). Metoden er beskrevet udførligt andetsteds26. Behandling med ddC resulterede i et meget kraftigt fald i niveauerne af mtDNA; en svagere effekt blev observeret i tilfælde af TFAM og TWNK hæmning, mens transfektionen af celler med POLG siRNA havde en meget beskeden effekt på mtDNA-kopinummeret (figur 4A). Kvantificering af TFAM- og TWNK-ekspressionen bekræftede en effektiv reduktion i deres ekspression til ~ 15% -20% af kontrolniveauerne i modsætning til POLG, hvis ekspression på mRNA-niveau blev reduceret til 30% (figur 4B).
Figur 1: Skematisk gengivelse af protokoltrinnene. Skalabjælkerne for de mikroskopiske billeder er 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Specifik påvisning af BrdU-inkorporering i mtDNA af anti-BrdU-antistoffer. Prøvebilleder af (A) HeLa og (B) A549 og A549 rho0-celler udsat for immunofluorescensfarvning med anti-BrdU (grøn) og anti-DNA (rød) antistoffer. Cellerne blev behandlet eller ikke behandlet med BrdU-opløsningen. Nukleært DNA (blåt) blev mærket med Hoechst, og mitokondrierne (cyan) blev visualiseret med et mitokondriesporingsfarvestof. Der vises et flettet billede af alle fire fluorescenskanaler. Skalabjælken repræsenterer 10 μm. (C) Resultatet af kvantificeringen af signalet fra anti-BrdU-antistofferne. Analysen blev udført for fire uafhængige biologiske replikater; hver gang blev 100 tilfældigt udvalgte celler analyseret for hver eksperimentel tilstand (N = 400 celler). I gennemsnit blev der påvist 18 BrdU-foci pr. Celle. Boksene repræsenterer den første og tredje kvartil i interkvartilområdet (IQR), medianen er repræsenteret af en vandret linje, whiskers definerer minimum og maksimum, og outliers defineres som 1,5 x IQR. En Kruskal-Wallis statistisk test blev udført. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Resultater af hæmning af mtDNA-syntese, herunder reduktion af effektiviteten af BrdU-inkorporering og påvirkning af fordelingen af nukleoider. (A) Prøve fluorescensbilleder af HeLa-celler behandlet i 72 timer med ddC eller siRNA, som nedregulerer proteinerne involveret i mtDNA-replikation. Cellerne blev behandlet med BrdU i 16 timer før fiksering. Det nukleare DNA (blå) blev farvet med Hoechst, anti-BrdU (grøn) og anti-DNA (rød) antistoffer blev brugt, og mitokondrierne blev mærket med et mitokondriesporingsfarvestof. Der vises et flettet billede af alle fire fluorescenskanaler. Skalabjælken repræsenterer 10 μm. (B,C) Kvantificering af fluorescenssignalerne fra (B) anti-BrdU og (C) anti-DNA-antistoffer. Analysen blev udført for fire uafhængige biologiske replikater; hver gang blev 650 tilfældigt udvalgte celler analyseret for hver eksperimentel tilstand (N = 2.600 celler). I gennemsnit blev der påvist 18 BrdU-foci og 46 mtDNA-foci pr. Celle. Boksene repræsenterer den første og tredje kvartil i interkvartilområdet (IQR), medianen er repræsenteret af en vandret linje, whiskers definerer minimum og maksimum, og outliers defineres som 1,5 x IQR. En Kruskal-Wallis statistisk test blev udført. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Validering af effektiviteten af hæmningen af mtDNA-syntese og af effektiviteten af de testede siRNA'er. HeLa-celler blev behandlet i 72 timer med ddC eller de angivne siRNA'er og derefter udsat for DNA- og RNA-isolering. (A) Resultater af mtDNA-niveauanalysen ved hjælp af qPCR. B) qPCR-analyse af genekspressionsændringer under de anførte betingelser. Søjlerne repræsenterer middelværdierne for fire uafhængige biologiske replikater; fejlbjælkerne repræsenterer SEM; der blev udført en statistisk ANOVA-test en t-test blev udført til parvis sammenligning med Untr (ubehandlet) prøver. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Dynamik af BrdU-inkorporering i HeLa-cellernes mtDNA. Resultaterne af et tidsforløbseksperiment, hvor cellerne blev inkuberet med 20 μM BrdU i et givet tidsrum, vises. Midlerne til fire uafhængige replikater for hvert tidspunkt vises; 900 tilfældigt udvalgte celler blev analyseret i hver replikat. Søjlerne repræsenterer midlerne til fire replikater; der blev udført en statistisk ANOVA-test. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Validering af A549 rho0-cellerne. A) Elektroforetisk analyse af qPCR-produkterne fra amplificerende DNA-fragmenter af mtDNA-kodede ND1- og nukleare DNA-kodede B2M-gener. Total DNA fra A549 eller A549 rho0 celler blev brugt som skabeloner i reaktionen. (B) Resultater af mtDNA-niveauanalysen ved hjælp af qPCR. Søjlerne repræsenterer middelværdierne for fire uafhængige biologiske replikater; fejlbjælkerne repræsenterer SEM; En T-test blev udført. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Historisk set er DNA-mærkning ved BrdU-inkorporering og antistofdetektion blevet brugt i nuklear DNA-replikation og cellecyklusforskning 14,27,28. Indtil videre har alle protokoller til påvisning af BrdU-mærket DNA inkluderet et DNA-denatureringstrin (surt eller termisk) eller enzymfordøjelse (DNase eller proteinase) for at muliggøre epitopeksponering og lette antistofpenetration. Disse protokoller blev udviklet til tæt pakket nukleart DNA. Den forskellige organisering af mtDNA muliggjorde imidlertid udviklingen af en procedure uden denatureringstrinnet; Dette har forenklet proceduren og gjort den mere velegnet til applikationer med høj kapacitet. Denne tilgang har givet fremragende resultater, fordi udeladelse af denatureringstrinnet resulterer i påvisning af BrdU-mærket DNA kun uden for kernen (figur 2 og figur 3). Derfor kan det stærke signal fra nukleært DNA, som altid er til stede, når et denatureringstrin er inkluderet, og som kan forårsage et alvorligt problem ved at maskere signalet fra BrdU-mærket mtDNA29, undgås med denne protokol. Desuden sikrer manglen på hård denaturering bedre bevarelse af cellestrukturerne og påvirker ikke effektiviteten af farvning med fluorescerende pletter såsom Hoechst- eller mitokondriersporingsfarvestof (figur 2 og figur 3).
Dynamikken i BrdU-inkorporering i mtDNA er cellelinjeafhængig. Det anbefales at udføre et tidskursuseksperiment på BrdU-inkorporering, når du bruger en ny cellelinje. Denne undersøgelse har etableret 16 timer som en optimal BrdU-inkubationstid for HeLa-cellelinjer. På grund af den biologiske variation i HeLa-linjer fra forskellige laboratorier30 foreslås det imidlertid at udføre et BrdU-tidsforløbseksperiment på den særlige HeLa-variant, man planlægger at arbejde med.
Kombinationen af anti-BrdU og anti-DNA-mærkning i denne protokol muliggør overvågning af mtDNA-syntese og samtidig undersøgelse af mtDNA-fordelingen i cellen. Dette kan ses meget godt i TFAM-tavse celler (figur 3). Faldende niveau af TFAM fører til en reduktion i mtDNA-syntese (et nedsat totalt anti-BrdU-signal) og til klyngedannelse af mitokondrienukleoider, hvilket manifesteres ved en betydelig stigning i det gennemsnitlige mtDNA-fluorescenssignal (figur 3). Det skal bemærkes, at stigningen i den gennemsnitlige mtDNA-fluorescensintensitet i dette tilfælde skyldes den ændrede fordeling af mitokondrienukleoiderne og ikke afspejler opreguleringen af mtDNA-niveauer; faktisk reduceres mtDNA-niveauerne, som afsløret ved kvantitativ PCR-analyse (figur 4A). Overraskende resultater blev opnået for cellerne transfekteret med POLG siRNA (figur 3). Man kunne forvente, at transfektion af celler med siRNA-målrettet POLG, som er den replikative DNA-polymerase i mitokondrier, ville reducere BrdU-inkorporering i mtDNA'et betydeligt. I denne undersøgelse var effekten på BrdU-inkorporering imidlertid ubetydelig (figur 3), hvilket yderligere bekræftes ved at måle mtDNA-niveauerne ved hjælp af qPCR (figur 4A). Den dårlige nedregulering af POLG-ekspression kan forklare dette tilsyneladende modstridende resultat ved transfektion af celler med det påførte siRNA (figur 4B). Dette fremhæver en potentiel ulempe ved at bruge siRNA til funktionelle undersøgelser og antyder, at der er behov for validering af genhæmning.
Samlet set er der udviklet et assay til undersøgelse af dynamikken i mtDNA-metabolisme i dyrkede celler, der bruger et multi-well-pladeformat og immunofluorescensbilleddannelse til at detektere og kvantificere mtDNA-replikation, reparation og distribution. Metoden giver mulighed for samtidig undersøgelse af mange forskellige eksperimentelle forhold. Det kan bruges til at undersøge virkningerne af forskellige hæmmere, cellulære belastninger og genhæmning på mtDNA-metabolisme. Mens analysen har et stort potentiale til brug ved undersøgelse af mtDNA-metabolisme i forskellige fysiologiske og patologiske sammenhænge, skal det bemærkes, at analysen ikke tillader replikation og reparationsbundet mtDNA-syntese at blive skelnet. Dette bør overvejes ved fortolkning af resultaterne og planlægning af efterfølgende funktionelle eksperimenter. Især har analysen yderligere potentiale for udvikling. For eksempel påvises replikationsinaktive (eller reparationsinaktive) mitokondrienukleoider ikke med anti-BrdU-antistoffer. Derfor muliggør anvendelsen af anti-DNA-antistoffer kvantificering af mtDNA-tilstandsniveauerne, antallet af replikationstavse nukleoider og fordelingen af nukleoider i cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af det nationale videnskabscenter, Polen (tilskuds-/tildelingsnummer: 2018/31/D/NZ2/03901).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284 (2019).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102 (2020).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
- Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579 (2020).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S.
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
- Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
- Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2021).
- Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021).
- Dowle, M., Srinivasan, A. data.table: Extension of `data.frame. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016).
- Kassambara, A. ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020).
- Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
- Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
- Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
- Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
- Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
- Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
- Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).
