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Biochemistry

माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए संश्लेषण और वितरण की उच्च-थ्रूपुट छवि-आधारित परिमाणीकरण

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/65236
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2, 2
1Faculty of Biology, Institute of Genetics and Biotechnology, University of Warsaw, 2Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, 3International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

Summary

एमटीडीएनए संश्लेषण और वितरण का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मल्टी-वेल प्लेट प्रारूप और स्वचालित इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (एमटीडीएनए) चयापचय की गतिशीलता का अध्ययन करने की एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। इसका उपयोग एमटीडीएनए चयापचय पर विभिन्न अवरोधकों, सेलुलर तनाव और जीन साइलेंसिंग के प्रभावों की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

सेलुलर प्रक्रियाओं के विशाल बहुमत को ऊर्जा की निरंतर आपूर्ति की आवश्यकता होती है, जिनमें से सबसे आम वाहक एटीपी अणु है। यूकेरियोटिक कोशिकाएं ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन द्वारा माइटोकॉन्ड्रिया में अपने अधिकांश एटीपी का उत्पादन करती हैं। माइटोकॉन्ड्रिया अद्वितीय अंग हैं क्योंकि उनके पास अपना जीनोम है जिसे अगली पीढ़ी की कोशिकाओं में दोहराया और पारित किया जाता है। परमाणु जीनोम के विपरीत, कोशिका में माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम की कई प्रतियां होती हैं। माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम की प्रतिकृति, मरम्मत और रखरखाव के लिए जिम्मेदार तंत्र का विस्तृत अध्ययन सामान्य और रोग दोनों स्थितियों के तहत माइटोकॉन्ड्रिया और पूरी कोशिकाओं के उचित कामकाज को समझने के लिए आवश्यक है। यहां, एक विधि जो विट्रो में सुसंस्कृत मानव कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (एमटीडीएनए) के संश्लेषण और वितरण के उच्च-थ्रूपुट परिमाणीकरण की अनुमति देती है, प्रस्तुत की गई है। यह दृष्टिकोण 5-ब्रोमो-2'-डीऑक्सीयूरिडीन (बीआरडीयू) निगमन द्वारा लेबल सक्रिय रूप से संश्लेषित डीएनए अणुओं के इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने और एंटी-डीएनए एंटीबॉडी के साथ सभी एमटीडीएनए अणुओं की समवर्ती पहचान पर आधारित है। इसके अतिरिक्त, माइटोकॉन्ड्रिया को विशिष्ट रंगों या एंटीबॉडी के साथ देखा जाता है। एक बहु-अच्छी तरह से प्रारूप में कोशिकाओं का संवर्धन और एक स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग अपेक्षाकृत कम समय में विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत एमटीडीएनए की गतिशीलता और माइटोकॉन्ड्रिया की आकृति विज्ञान का अध्ययन करना आसान बनाता है।

Introduction

अधिकांश यूकेरियोटिक कोशिकाओं के लिए माइटोकॉन्ड्रिया आवश्यक अंग हैं, क्योंकि वे कई सेलुलर प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। सबसे पहले और सबसे महत्वपूर्ण, माइटोकॉन्ड्रिया कोशिकाओं के प्रमुख ऊर्जा आपूर्तिकर्ता हैं1. माइटोकॉन्ड्रिया सेलुलर होमियोस्टैसिस (उदाहरण के लिए, इंट्रासेल्युलर रेडॉक्स2 और कैल्शियम बैलेंस3), सेल सिग्नलिंग4,5, एपोप्टोसिस6, विभिन्न जैव रासायनिक यौगिकों के संश्लेषण7,8, और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया9 को विनियमित करने में भी शामिल हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन विभिन्न पैथोलॉजिकल राज्यों औरमानव रोगों से जुड़ा हुआ है।

माइटोकॉन्ड्रिया का कामकाज दो अलग-अलग जीनोम में स्थित आनुवंशिक जानकारी पर निर्भर करता है: परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम। माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम परमाणु जीनोम की तुलना में जीन की एक छोटी संख्या को एन्कोड करता है, लेकिन सभी एमटीडीएनए-एन्कोडेड जीन मानव जीवन के लिए आवश्यक हैं। एमटीडीएनए को बनाए रखने के लिए आवश्यक माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन मशीनरी एनडीएनए द्वारा एन्कोड की गई है। माइटोकॉन्ड्रियल रिप्लिसोम के मूल घटकों, साथ ही कुछ माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस कारकों की पहले ही पहचान की जा चुकी है (पिछले शोध 11,12 में समीक्षा की गई)। हालांकि, माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए प्रतिकृति और रखरखाव तंत्र अभी भी समझने से बहुत दूर हैं। एनडीएनए के विपरीत, माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम कई प्रतियों में मौजूद है, जो माइटोकॉन्ड्रियल जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए एक अतिरिक्त परत प्रदान करता है। वर्तमान में ऑर्गेनेल के भीतर एमटीडीएनए के वितरण और पृथक्करण के बारे में बहुत कम जाना जाता है, इन प्रक्रियाओं को किस हद तक विनियमित किया जाता है, और यदि वे हैं, तो कौन सेप्रोटीन शामिल हैं। अलगाव पैटर्न महत्वपूर्ण है जब कोशिकाओं में जंगली-प्रकार और उत्परिवर्तित एमटीडीएनए की मिश्रित आबादी होती है। उनके असमान वितरण से उत्परिवर्तित एमटीडीएनए की हानिकारक मात्रा के साथ कोशिकाओं की पीढ़ी हो सकती है।

अब तक, एमटीडीएनए रखरखाव के लिए आवश्यक प्रोटीन कारकों की पहचान मुख्य रूप से जैव रासायनिक विधियों, जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण, या रोग से जुड़े अध्ययनों के माध्यम से की गई है। इस काम में, उन कारकों की पहचान करने का एक उच्च मौका सुनिश्चित करने के लिए जो पहले पहचान से बच गए हैं, एक अलग रणनीति का वर्णन किया गया है। विधि 5-ब्रोमो-2'-डीऑक्सीयूरिडीन (बीआरडीयू), थाइमिडीन के न्यूक्लियोसाइड एनालॉग के साथ प्रतिकृति या मरम्मत के दौरान एमटीडीएनए के लेबलिंग पर आधारित है। बीआरडीयू को डीएनए संश्लेषण के दौरान नवजात डीएनए किस्में में आसानी से शामिल किया जाता है और सामान्य तौर पर, परमाणु डीएनए14 की प्रतिकृति की निगरानी के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, यहां विकसित प्रक्रिया को एंटी-बीआरडीयू एंटीबॉडी के इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके एमटीडीएनए में शामिल बीआरडीयू का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया है।

यह दृष्टिकोण इन विट्रो में सुसंस्कृत मानव कोशिकाओं में एमटीडीएनए संश्लेषण और वितरण के उच्च-थ्रूपुट परिमाणीकरण की अनुमति देता है। अपेक्षाकृत कम समय में विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों में परीक्षण करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट रणनीति आवश्यक है; इसलिए, प्रोटोकॉल में इमेजिंग के लिए सेल संवर्धन और स्वचालित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए एक बहु-अच्छी प्रारूप का उपयोग करने का प्रस्ताव है। प्रोटोकॉल में एक सीआरएनए लाइब्रेरी के साथ मानव हेला कोशिकाओं का अभिकर्मक और बीआरडीयू के साथ नए संश्लेषित डीएनए के चयापचय लेबलिंग का उपयोग करके एमटीडीएनए प्रतिकृति या मरम्मत की बाद की निगरानी शामिल है। इस दृष्टिकोण को एंटी-डीएनए एंटीबॉडी की मदद से डीएनए के इम्यूनोस्टेनिंग के साथ जोड़ा जाता है। मात्रात्मक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके दोनों मापदंडों का विश्लेषण किया जाता है। इसके अतिरिक्त, माइटोकॉन्ड्रिया को एक विशिष्ट डाई के साथ देखा जाता है। प्रोटोकॉल की विशिष्टता को प्रदर्शित करने के लिए, बीआरडीयू धुंधला होने का परीक्षण एमटीडीएनए (आरएचओ0 कोशिकाओं) से रहित कोशिकाओं पर, प्रसिद्ध एमटीडीएनए रखरखाव कारकों को चुप कराने पर हेला कोशिकाओं पर और एमटीडीएनए प्रतिकृति अवरोधक के साथ उपचार के बाद हेला कोशिकाओं पर किया गया था। एमटीडीएनए के स्तर को एक स्वतंत्र विधि, अर्थात् क्यूपीसीआर द्वारा भी मापा गया था।

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Protocol

1. सीआरएनए मिश्रण की तैयारी

  1. प्रयोग की शुरुआत से एक दिन पहले, बीज कोशिकाओं (जैसे, हेला) को 100 मिमी डिश पर रखें ताकि वे अगले दिन 70% -90% संगम तक पहुंच जाएं।
    नोट: सभी ऑपरेशन एक लामिनर प्रवाह कक्ष में बाँझ परिस्थितियों में किए जाने चाहिए।
  2. ऑप्टि-एमईएम माध्यम में 140 एनएम की एकाग्रता के लिए पतला सीआरएनए की उचित मात्रा तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। एक 96-वेल प्लेट को जलाशय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. काले 384-वेल सेल कल्चर माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं में सीआरएनए समाधान (या नियंत्रण नमूने के लिए ऑप्टी-एमईएम माध्यम) के 5 μL जोड़ें।
    नोट: परीक्षण किए गए सीआरएनए नमूनों की संख्या के आधार पर, एक इलेक्ट्रॉनिक या मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग किया जा सकता है।
  4. ऑप्टिम-एमईएम माध्यम में आरएनएआईमैक्स अभिकर्मक समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) की उचित मात्रा तैयार करें। प्रत्येक 100 μL मध्यम के लिए RNAIMAX का 1 μL जोड़ें।
  5. 384-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में अभिकर्मक अभिकर्मक समाधान के 10 μL जोड़ें। ऐसा करने का सबसे सुविधाजनक और तेज़ तरीका एक अभिकर्मक डिस्पेंसर के साथ है।
  6. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ सीआरएनए को इनक्यूबेट करें।

2. अभिकर्मक के लिए कोशिकाओं की तैयारी

  1. इनक्यूबेशन (चरण 1.6) के दौरान, एक सक्शन डिवाइस ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके माध्यम को एस्पिरेट करें, और पीबीएस के 3 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं।
  2. पीबीएस में 1.5 एमएल ट्रिप्सिन पतला 1: 2 जोड़ें, और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. जांचें कि क्या कोशिकाएं अलग हो गई हैं; यदि हां, तो 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम माध्यम के 3 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं को अच्छी तरह से निलंबित करें, और उन्हें 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। निलंबन के कम से कम 150 μL लें, और सेल-काउंटिंग कक्ष में कोशिकाओं की गणना करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  4. 10% एफबीएस, पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ डीएमईएम माध्यम में उचित एकाग्रता (हेला लाइन के लिए 35,000 / एमएल) पर एक सेल निलंबन तैयार करें।

3. सेल अभिकर्मक

  1. अभिकर्मक डिस्पेंसर का उपयोग करके 384-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल सस्पेंशन के 20 μL जोड़ें। इसके परिणामस्वरूप प्रति कुएं में 700 कोशिकाओं का बीज होगा।
  2. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, और फिर उन्हें 72 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2) के लिए इनक्यूबेटर में रखें।

4. बीआरडीयू निगमन

  1. 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम माध्यम में बीआरडीयू ( सामग्री की तालिका देखें) का 90 μM समाधान तैयार करें।
  2. सीआरएनए अभिकर्मक (सेल निर्धारण से 16 घंटे पहले) के बाद 56 घंटे पर, 384-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 90 μM BrdU समाधान के 10 μL जोड़ें (अंतिम BrdU एकाग्रता 20 μM है)।
    नोट: कार्रवाई जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए; इसलिए, एक अभिकर्मक डिस्पेंसर, इलेक्ट्रॉनिक पिपेट या मल्टी-डिस्पेंसर पिपेट का उपयोग करना सबसे अच्छा है। बीआरडीयू के अतिरिक्त के बिना नियंत्रण कुएं तैयार करना याद रखें।
  3. 16 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2) के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।

5. माइटोकॉन्ड्रिया की लेबलिंग

  1. 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम में बीआरडीयू का 20 μM समाधान तैयार करें, और इसमें माइटोकॉन्ड्रिया ट्रैकिंग डाई समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) को 1.1 μM की एकाग्रता में जोड़ें।
  2. बीआरडीयू निगमन की शुरुआत के 15 घंटे बाद (सेल निर्धारण से 1 घंटे पहले), 384-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में माइटोकॉन्ड्रिया ट्रैकिंग डाई समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के 10 μL जोड़ें (अंतिम डाई एकाग्रता 200 एनएम है)।
    नोट: एक अभिकर्मक डिस्पेंसर, इलेक्ट्रॉनिक पिपेट, या मल्टी-डिस्पेंसर पिपेट का उपयोग करें। बीआरडीयू के अतिरिक्त के बिना नियंत्रण कुओं को बनाए रखना याद रखें, लेकिन माइटोकॉन्ड्रिया ट्रैकिंग डाई के अतिरिक्त।
  3. 1 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2) के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।

6. सेल निर्धारण

नोट: सभी धुलाई सबसे आसानी से एक माइक्रोप्लेट वॉशर का उपयोग करके की जाती है, जबकि अभिकर्मकों को जोड़ने के लिए अभिकर्मक डिस्पेंसर का उपयोग करके सबसे जल्दी किया जाता है।

  1. माइक्रोप्लेट वॉशर का उपयोग करके ( सामग्री की तालिका देखें), प्रत्येक को पीबीएस के 100 μL के साथ दो बार अच्छी तरह से धोएं। दूसरे धोने के बाद, पीबीएस के 25 μL को कुएं में छोड़ दें।
    नोट: कुएं में पीबीएस छोड़ने से अगले चरण में तरल के अलावा सेल डिटेचमेंट की संभावना कम हो जाती है। पीबीएस के साथ सभी वॉश पूरे हो जाते हैं; इसलिए, अगले चरण में जोड़ा गया समाधान हमेशा 2x एकाग्रता पर तैयार किया जाना चाहिए क्योंकि इसे शेष पीबीएस के बराबर मात्रा में जोड़ा जाएगा।
  2. 4 μg /mL की सांद्रता पर PBS में 8% फॉर्मलाडेहाइड घोल के 25 μL को 0.4% ट्राइटन X-100 और Hoechst 33342 के साथ जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें (व्यक्तिगत अभिकर्मकों की अंतिम सांद्रता क्रमशः 4%, 0.2%, और 2 μg / mL है) ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में प्लेट को इनक्यूबेट करें।

7. ब्लॉकिंग

  1. प्रत्येक को 100 μL PBS के साथ चार बार अच्छी तरह से धो लें। अंतिम धोने के बाद, कुएं में पीबीएस के 25 μL छोड़ दें।
  2. पीबीएस में 6% बीएसए के 25 μL जोड़ें (अंतिम बीएसए एकाग्रता 3% है) प्रत्येक कुएं में।
  3. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में प्लेट को इनक्यूबेट करें।

8. प्राथमिक एंटीबॉडी का जोड़

  1. एक माइक्रोप्लेट वॉशर का उपयोग करके बीएसए को एस्पिरेट करें, और कुएं में 10 μL घोल छोड़ दें।
  2. पीबीएस में 3% बीएसए में तैयार प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 10 μL जोड़ें। 0.8 μg /mL पर एंटी-BrdU और 0.4 μg/mL पर एंटी-DNA का उपयोग करें (एंटीबॉडी की अंतिम सांद्रता क्रमशः 0.4 μg/mL और 0.2 μg/mL हैं) (सामग्री की तालिका देखें)।
  3. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में प्लेट को इनक्यूबेट करें।

9. द्वितीयक एंटीबॉडी का जोड़

  1. प्रत्येक को 100 μL PBS के साथ चार बार अच्छी तरह से धो लें। अंतिम धोने के बाद, पीबीएस के 10 μL को कुएं में छोड़ दें।
  2. पीबीएस में 6% बीएसए में तैयार 4 μg / mL द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के 10 μL जोड़ें (अंतिम एकाग्रता 2 μg / mL है)। आइसोटाइप-विशिष्ट एंटीबॉडी (एंटी-माउस आईजीजी 1 और एंटी-माउस आईजीएम) का उपयोग करें जो फ्लोरोक्रोम जैसे एलेक्सा फ्लुर 488 और एलेक्सा फ्लुर 555 से संयुग्मित हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  4. प्रत्येक को 100 μL PBS के साथ चार बार अच्छी तरह से धो लें। अंतिम धोने के बाद, 50 μL PBS को कुएं में छोड़ दें।
  5. प्लेट को चिपकने वाली सीलिंग फिल्म ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ सील करें, और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें। इमेजिंग 2 सप्ताह के भीतर किया जाना चाहिए।

10. इमेजिंग

नोट: इमेजिंग एक स्वचालित वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोप के साथ किया जाना चाहिए; माइक्रोस्कोप को प्लेट के अलग-अलग क्षेत्रों को स्वचालित रूप से चित्रित करने के लिए नियंत्रण के साथ आपूर्ति किए गए मोटर चरण से लैस होना चाहिए।

  1. प्लेट के कोने क्षेत्रों (वेल्स ए 1, ए 24, पी 24, पी 1) और केंद्र में ऑटोफोकस सेटिंग्स की जांच करें।
    नोट: इमेजिंग के लिए, उच्चतम संभव संख्यात्मक एपर्चर के साथ 20x छोटी कामकाजी दूरी उद्देश्य ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  2. लाइव व्यू मोड में इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न तीव्रता हिस्टोग्राम के आधार पर, व्यक्तिगत फ्लोरेसेंस चैनलों के लिए पर्याप्त रूप से लंबे एक्सपोज़र समय का चयन करें ताकि परिणामी छवि ओवरसैचुरेटेड न हो।
  3. जेड-अक्ष पर इमेजिंग के लिए विमानों की उचित संख्या सेट करें।
    नोट: 20x आवर्धन पर दृश्य का क्षेत्र इतना बड़ा है कि सभी कोशिकाएं फ़ोकस के एक ही तल में नहीं हैं, इसलिए सभी कोशिकाओं को फ़ोकस के सही तल में देखने के लिए z-सेक्शनिंग की जानी चाहिए। आमतौर पर, पांच विमान पर्याप्त होते हैं। डिस्क स्थान की उपलब्धता के आधार पर, व्यक्तिगत जेड-स्टैक्स या केवल अधिकतम तीव्रता अनुमानों को सहेजा जा सकता है। प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में दिखाया गया छवि विश्लेषण अधिकतम तीव्रता अनुमानों पर आधारित है।
  4. प्रति अच्छी तरह से प्रदर्शित करने के लिए दृश्य के फ़ील्ड की उपयुक्त संख्या का चयन करें।
    नोट: संगम के आधार पर, लगभग 60-300 कोशिकाओं को एक क्षेत्र में चित्रित किया जा सकता है। आमतौर पर, 60% -90% के संगम के साथ हेला कोशिकाओं के लिए, पांच क्षेत्रों की इमेजिंग 500 कोशिकाओं से 1,000 से अधिक कोशिकाओं तक विश्लेषण करने की अनुमति देगी।
  5. छवि बनाने के लिए कुओं का चयन करें, और इमेजिंग शुरू करें।

11. मात्रात्मक छवि विश्लेषण

नोट: अधिग्रहित छवियों का मात्रात्मक विश्लेषण सेल प्रोफाइलर15 जैसे ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन के लिए, विश्लेषण स्कैनआर 3.0.0 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

  1. सभी प्रतिदीप्ति चैनलों से सभी छवियों के लिए पृष्ठभूमि सुधार करके विश्लेषण शुरू करें। विश्लेषण की गई वस्तुओं के आकार के आधार पर, उपयुक्त फ़िल्टर आकार का चयन करें: सेल नाभिक के लिए 80 पिक्सेल और बीआरडीयू और एमटीडीएनए स्पॉट के लिए 4 पिक्सेल।
  2. सेल नाभिक के अनुरूप चैनल के लिए पृष्ठभूमि में प्रतिदीप्ति संकेत की तीव्रता के अनुपात के आधार पर मुख्य वस्तु का मुखौटा बनाकर छवि को विभाजित करना शुरू करें।
  3. दिए गए संरचनाओं के लिए उपयुक्त प्रतिदीप्ति चैनलों का उपयोग करके क्रमशः बीआरडीयू और एमटीडीएनए स्पॉट का प्रतिनिधित्व करने वाली उप-वस्तुओं के लिए मास्क बनाएं।
    नोट: प्रत्येक उप-वस्तु निकटतम मुख्य वस्तु (सेल न्यूक्लियस) को सौंपी गई है।
  4. विश्लेषण के दौरान मापा जाने वाला पैरामीटर सेट करें, और सभी प्रतिदीप्ति चैनलों के लिए प्रत्येक मास्क के भीतर व्यक्तिगत पिक्सेल की तीव्रता को मापें।
    नोट: किसी दिए गए सेल नाभिक को सौंपी गई उप-वस्तुओं की संख्या और प्रत्येक उप-वस्तु के क्षेत्र की गणना करना भी आवश्यक है।
  5. प्राप्त डेटा के आधार पर गणना किए जाने वाले व्युत्पन्न मापदंडों को परिभाषित करें। बीआरडीयू या एमटीडीएनए चैनल के लिए कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्त करने के लिए, किसी दिए गए सेल नाभिक को सौंपे गए सभी उप-वस्तुओं की तीव्रता को सारांशित करें। माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्त करने के लिए, किसी दिए गए सेल नाभिक को सौंपे गए उप-वस्तुओं के क्षेत्र के योग से कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता को विभाजित करें।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि निर्मित उप-वस्तु (बीआरडीयू या एमटीडीएनए स्पॉट) वास्तव में माइटोकॉन्ड्रिया में स्थित है, माइटोकॉन्ड्रिया ट्रैकिंग डाई से प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर उन्हें गेट करना आवश्यक है।
  6. निम्नलिखित पैकेजों के साथ R 4.2.2 सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर16 का उपयोग करके ScanR सॉफ़्टवेयर के साथ प्राप्त डेटा का आगे विश्लेषण करें: dplyr 17, data.table 18, ggplot219, और ggpubr 20. यह चरण वैकल्पिक है.

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Representative Results

एमटीडीएनए संश्लेषण और वितरण की गतिशीलता के उच्च-थ्रूपुट अध्ययन के लिए प्रक्रिया की एक योजना चित्रा 1 में दिखाई गई है। एक मल्टी-वेल प्लेट प्रारूप का उपयोग कई अलग-अलग प्रयोगात्मक स्थितियों के एक साथ विश्लेषण को सक्षम बनाता है, जैसे कि सीआरएनए लाइब्रेरी का उपयोग करके विभिन्न जीनों को चुप करना। बीआरडीयू के साथ नए संश्लेषित डीएनए अणुओं के लेबलिंग के लिए उपयोग की जाने वाली स्थितियां हेला कोशिकाओं (चित्रा 2 ए) के माइटोकॉन्ड्रिया में बीआरडीयू-लेबल डीएनए का पता लगाने की अनुमति देती हैं, लेकिन अन्य सेल प्रकारों के लिए परख स्थापित करने के लिए शुरुआती स्थितियों के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है। बीआरडीयू के साथ इनक्यूबेशन समय को समय-पाठ्यक्रम प्रयोग (पूरक चित्रा 1) के आधार पर अलग-अलग सेल लाइनों के लिए चुना जाना चाहिए। वर्तमान अध्ययन में, हेला कोशिकाओं का उपयोग किया गया था, क्योंकि एसआईआरएनए की स्क्रीनिंग के लिए कोशिकाओं की आवश्यकता होती है जिन्हें उच्च दक्षता के साथ स्थानांतरित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, एंटी-बीआरडीयू एंटीबॉडी के साथ प्राप्त संकेत विशिष्ट है, क्योंकि यह केवल बीआरडीयू (चित्रा 2) के साथ इलाज की गई कोशिकाओं में देखा जा सकता है। एंटी-बीआरडीयू और एंटी-डीएनए लेबलिंग की विशिष्टताओं को माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए21 (पूरक चित्रा 2) की कमी वाले आरएचओ0 कोशिकाओं का उपयोग करके पुष्टि की गई थी। जैसा कि अपेक्षित था, इन कोशिकाओं में, बीआरडीयू उपचार की परवाह किए बिना, एंटी-बीआरडीयू या एंटी-डीएनए एंटीबॉडी (चित्रा 2 बी) दोनों के लिए माइटोकॉन्ड्रिया में कोई संकेत नहीं पाया गया था। एंटी-बीआरडीयू एंटीबॉडी से फ्लोरोसेंट सिग्नल की मात्रा निर्धारित करने से संकेत मिलता है कि बीआरडीयू के साथ इलाज किए गए रोड0 कोशिकाओं ने बीआरडीयू-अनुपचारित कोशिकाओं के समान प्रतिदीप्ति का निम्न स्तर दिखाया, जबकि पैतृक लाइनों ए 549 और हेला के लिए संकेत औसतन 50 गुना अधिक था (चित्रा 2 सी)।

माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए संश्लेषण और वितरण के अध्ययन में यहां प्रस्तुत विधि की उपयोगिता दिखाने के लिए, एक प्रयोग आयोजित किया गया था जिसमें हेला कोशिकाओं को 2', 3'-डिडोक्सीसाइटिडीन (डीडीसी), एमटीडीएनए संश्लेषण22 के अवरोधक के साथ इलाज किया गया था, और एमटीडीएनए प्रतिकृति के लिए आवश्यक जीन की अभिव्यक्ति को सीआरएनए के साथ चुप कर दिया गया था (चित्रा 3). डीडीसी के साथ कोशिकाओं के उपचार से बीआरडीयू निगमन का पूर्ण निषेध हुआ, जबकि उपयोग किए जाने वाले एसआईआरएनए के विभिन्न प्रभाव थे। ट्विंकल हेलिकेस (TWNK) 23 के डाउनरेग्यूलेशन ने BrdU निगमन के सबसे शक्तिशाली अवरोध को जन्म दिया; टीएफएएम प्रोटीन24 के लिए एक कमजोर प्रभाव देखा गया था, जबकि माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए पोलीमरेज़ गामा (पीओएलजी) 25 के साइलेंसिंग से नकारात्मक नियंत्रण सीआरएनए (चित्रा 3 ए, बी) के साथ इलाज की गई कोशिकाओं की तुलना में बीआरडीयू निगमन में मध्यम कमी आई है। प्रक्रिया में एंटी-डीएनए एंटीबॉडी का उपयोग दी गई प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत सेल में एमटीडीएनए वितरण की निगरानी के लिए अनुमति देता है। टीएफएएम के डाउनरेग्यूलेशन ने एमटीडीएनए वितरण में भारी बदलाव किए; नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में कम एमटीडीएनए स्पॉट का पता लगाया गया था, लेकिन जो बने हुए थे, उनमें बहुत अधिक प्रतिदीप्ति तीव्रता थी (चित्रा 3 ए)। एंटी-डीएनए एंटीबॉडी से औसत प्रतिदीप्ति संकेत की मात्रा निर्धारित करने से परीक्षण की गई अन्य स्थितियों की तुलना में टीएफएएम साइलेंसिंग पर कई गुना वृद्धि देखी गई (चित्रा 3 सी)।

इमेजिंग परिणामों की विशिष्टता को मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूपीसीआर) (चित्रा 4) की मदद से एमटीडीएनए और जीन अभिव्यक्ति के स्तर को मापकर सत्यापित किया गया था। विधि को कहीं और विस्तार से वर्णित किया गयाहै। डीडीसी के साथ उपचार के परिणामस्वरूप एमटीडीएनए के स्तर में बहुत मजबूत कमी आई; टीएफएएम और टीडब्ल्यूएनके साइलेंसिंग के मामले में एक कमजोर प्रभाव देखा गया था, जबकि पीओएलजी सीआरएनए के साथ कोशिकाओं के अभिकर्मक का एमटीडीएनए कॉपी नंबर (चित्रा 4 ए) पर बहुत मामूली प्रभाव पड़ा था। TFAM और TWNK अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करने से पीओएलजी के विपरीत, नियंत्रण स्तरों के ~ 15% -20% तक उनकी अभिव्यक्ति में एक कुशल कमी की पुष्टि हुई, जिसकी एमआरएनए स्तर पर अभिव्यक्ति 30% तक कम हो गई थी (चित्रा 4 बी)।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। सूक्ष्म छवियों के लिए स्केल बार 10 μm हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एंटी-बीआरडीयू एंटीबॉडी द्वारा एमटीडीएनए में बीआरडीयू निगमन का विशिष्ट पता लगाना। (ए) हेला और (बी) ए 549 और ए 549 आरएचओ 0 कोशिकाओं की नमूना छवियां एंटी-बीआरडीयू (हरे) और एंटी-डीएनए (लाल) एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के अधीन हैं। कोशिकाओं का इलाज किया गया था या बीआरडीयू समाधान के साथ इलाज नहीं किया गया था। परमाणु डीएनए (नीला) को होचस्ट के साथ लेबल किया गया था, और माइटोकॉन्ड्रिया (सियान) को माइटोकॉन्ड्रिया ट्रैकिंग डाई के साथ कल्पना की गई थी। सभी चार प्रतिदीप्ति चैनलों की एक विलय छवि दिखाई गई है। स्केल बार 10 μm का प्रतिनिधित्व करता है (C) एंटी-BrdU एंटीबॉडी से संकेत के परिमाणीकरण का परिणाम। विश्लेषण चार स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों के लिए किया गया था; हर बार, प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति (एन = 400 कोशिकाओं) के लिए 100 यादृच्छिक रूप से चयनित कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया था। औसतन, प्रति सेल 18 बीआरडीयू फॉसी का पता लगाया गया था। बक्से इंटरक्वार्टाइल रेंज (आईक्यूआर) के पहले और तीसरे चतुर्थक का प्रतिनिधित्व करते हैं, माध्य को एक क्षैतिज रेखा द्वारा दर्शाया जाता है, मूंछें न्यूनतम और अधिकतम को परिभाषित करती हैं, और आउटलायर्स को 1.5 x IQR के रूप में परिभाषित किया जाता है। एक क्रुस्कल-वालिस सांख्यिकीय परीक्षण किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एमटीडीएनए संश्लेषण के निषेध के परिणाम, जिसमें बीआरडीयू निगमन की दक्षता को कम करना और न्यूक्लियोइड के वितरण को प्रभावित करना शामिल है। (ए) डीडीसी या सीआरएनए के साथ 72 घंटे के लिए इलाज किए गए हेला कोशिकाओं की नमूना प्रतिदीप्ति छवियां, जो एमटीडीएनए प्रतिकृति में शामिल प्रोटीन को कम करती हैं। निर्धारण से पहले कोशिकाओं को 16 घंटे के लिए बीआरडीयू के साथ इलाज किया गया था। परमाणु डीएनए (नीला) होचस्ट के साथ सना हुआ था, एंटी-बीआरडीयू (हरा) और एंटी-डीएनए (लाल) एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था, और माइटोकॉन्ड्रिया को माइटोकॉन्ड्रिया ट्रैकिंग डाई के साथ लेबल किया गया था। सभी चार प्रतिदीप्ति चैनलों की एक विलय छवि दिखाई गई है। स्केल बार 10 μm का प्रतिनिधित्व करता है। (B, C) (B) एंटी-BrdU और (C) एंटी-डीएनए एंटीबॉडी से प्रतिदीप्ति संकेतों का परिमाणीकरण। विश्लेषण चार स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों के लिए किया गया था; हर बार, प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति (एन = 2,600 कोशिकाओं) के लिए यादृच्छिक रूप से चयनित 650 कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया था। औसतन, प्रति सेल 18 बीआरडीयू फॉसी और 46 एमटीडीएनए फॉसी का पता लगाया गया था। बक्से इंटरक्वार्टाइल रेंज (आईक्यूआर) के पहले और तीसरे चतुर्थक का प्रतिनिधित्व करते हैं, माध्य को एक क्षैतिज रेखा द्वारा दर्शाया जाता है, मूंछें न्यूनतम और अधिकतम को परिभाषित करती हैं, और आउटलायर्स को 1.5 x IQR के रूप में परिभाषित किया जाता है। एक क्रुस्कल-वालिस सांख्यिकीय परीक्षण किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एमटीडीएनए संश्लेषण के निषेध की दक्षता और परीक्षण किए गए एसआईआरएनए की प्रभावशीलता का सत्यापन। हेला कोशिकाओं को डीडीसी या संकेतित एसआईआरएनए के साथ 72 घंटे तक इलाज किया गया और फिर डीएनए और आरएनए अलगाव के अधीन किया गया। (ए) क्यूपीसीआर का उपयोग करके एमटीडीएनए स्तर विश्लेषण के परिणाम। (बी) संकेतित स्थितियों के तहत जीन अभिव्यक्ति परिवर्तनों का क्यूपीसीआर विश्लेषण। सलाखों चार स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों के औसत मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं; त्रुटि पट्टियाँ एसईएम का प्रतिनिधित्व करती हैं; एक एनोवा सांख्यिकीय परीक्षण किया गया था; अनटर (अनुपचारित) नमूनों के खिलाफ जोड़ीवार तुलना के लिए एक टी-परीक्षण किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: हेला कोशिकाओं के एमटीडीएनए में बीआरडीयू निगमन की गतिशीलता। एक टाइम-कोर्स प्रयोग के परिणाम जिसमें कोशिकाओं को एक निश्चित समय के लिए 20 μM BrdU के साथ इनक्यूबेट किया गया था, दिखाए गए हैं। प्रत्येक समय बिंदु के लिए चार स्वतंत्र प्रतिकृतियों के साधन दिखाए गए हैं; प्रत्येक प्रतिकृति में 900 यादृच्छिक रूप से चयनित कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया था। सलाखों चार प्रतिकृतियों के साधनों का प्रतिनिधित्व करते हैं; एक एनोवा सांख्यिकीय परीक्षण किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 2: A549 Rho0 कोशिकाओं का सत्यापन। (ए) एमटीडीएनए-एन्कोडेड एनडी 1 और परमाणु डीएनए-एन्कोडेड बी 2 एम जीन के डीएनए टुकड़ों को बढ़ाने से क्यूपीसीआर उत्पादों का इलेक्ट्रोफोरेटिक विश्लेषण। प्रतिक्रिया में ए 549 या ए 549 आरएचओ 0 कोशिकाओं से कुल डीएनए का उपयोग टेम्पलेट के रूप में किया गया था। (बी) क्यूपीसीआर का उपयोग करके एमटीडीएनए स्तर विश्लेषण के परिणाम। सलाखों चार स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों के औसत मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं; त्रुटि पट्टियाँ एसईएम का प्रतिनिधित्व करती हैं; एक टी-टेस्ट किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ऐतिहासिक रूप से, बीआरडीयू निगमन और एंटीबॉडी का पता लगाने द्वारा डीएनए लेबलिंग का उपयोग परमाणु डीएनए प्रतिकृति और सेल चक्र अनुसंधान 14,27,28 में किया गया है। अब तक, बीआरडीयू-लेबल डीएनए का पता लगाने के लिए सभी प्रोटोकॉल में एपिटोप एक्सपोजर को सक्षम करने और एंटीबॉडी प्रवेश की सुविधा के लिए डीएनए विकृतीकरण चरण (अम्लीय या थर्मल) या एंजाइम पाचन (डीनेस या प्रोटीन) शामिल हैं। इन प्रोटोकॉल को कसकर पैक किए गए परमाणु डीएनए के लिए विकसित किया गया था। हालांकि, एमटीडीएनए के विभिन्न संगठन ने विकृतीकरण चरण के बिना एक प्रक्रिया के विकास को सक्षम किया; इसने प्रक्रिया को सरल बना दिया है और इसे उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए अधिक उपयुक्त बना दिया है। इस दृष्टिकोण ने उत्कृष्ट परिणाम लाए हैं क्योंकि विकृतीकरण चरण को छोड़ने से केवल नाभिक के बाहर बीआरडीयू-लेबल डीएनए का पता चलता है (चित्रा 2 और चित्रा 3)। नतीजतन, परमाणु डीएनए से मजबूत संकेत, जो हमेशा मौजूद होता है जब एक विकृतीकरण कदम शामिल होता है और जो बीआरडीयू-लेबल एमटीडीएनए29 से सिग्नल को मुखौटा करके एक गंभीर समस्या पैदा कर सकता है, इस प्रोटोकॉल से बचा जा सकता है। इसके अलावा, कठोर विकृतीकरण की कमी सेलुलर संरचनाओं के बेहतर संरक्षण को सुनिश्चित करती है और फ्लोरोसेंट दाग जैसे होचस्ट या माइटोकॉन्ड्रिया ट्रैकिंग डाई (चित्रा 2 और चित्रा 3) द्वारा धुंधला होने की दक्षता को प्रभावित नहीं करती है।

एमटीडीएनए में बीआरडीयू निगमन की गतिशीलता सेल-लाइन निर्भर है। जब भी एक नई सेल लाइन का उपयोग किया जाता है तो बीआरडीयू निगमन पर एक समय-पाठ्यक्रम प्रयोग करने की सिफारिश की जाती है। इस अध्ययन ने हेला सेल लाइनों के लिए 16 घंटे को एक इष्टतम बीआरडीयू इनक्यूबेशन समय के रूप में स्थापित किया है। हालांकि, विभिन्न प्रयोगशालाओं से हेला लाइनों में जैविक भिन्नता के कारण, विशेष हेला संस्करण पर बीआरडीयू टाइम-कोर्स प्रयोग करने का सुझाव दिया जाताहै, जिसके साथ काम करने की योजना है।

इस प्रोटोकॉल में एंटी-बीआरडीयू और एंटी-डीएनए लेबलिंग का संयोजन एमटीडीएनए संश्लेषण की निगरानी और सेल में एमटीडीएनए वितरण के एक साथ अध्ययन के लिए अनुमति देता है। यह टीएफएएम-मौन कोशिकाओं में बहुत अच्छी तरह से देखा जा सकता है (चित्रा 3)। टीएफएएम के स्तर को कम करने से एमटीडीएनए संश्लेषण (कुल एंटी-बीआरडीयू सिग्नल में कमी) और माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड के क्लस्टरिंग में कमी आती है, जो औसत एमटीडीएनए फ्लोरेसेंस सिग्नल (चित्रा 3) में पर्याप्त वृद्धि से प्रकट होती है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, इस मामले में, औसत एमटीडीएनए प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड के परिवर्तित वितरण के कारण होती है और एमटीडीएनए स्तरों के अपरेगुलेशन को प्रतिबिंबित नहीं करती है; वास्तव में, एमटीडीएनए का स्तर कम हो जाता है, जैसा कि मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण (चित्रा 4 ए) से पता चला है। पीओएलजी सीआरएनए (चित्रा 3) के साथ स्थानांतरित कोशिकाओं के लिए आश्चर्यजनक परिणाम प्राप्त किए गए थे। कोई उम्मीद कर सकता है कि सीआरएनए-टारगेटिंग पीओएलजी के साथ कोशिकाओं का अभिकर्मक, जो माइटोकॉन्ड्रिया में प्रतिकृति डीएनए पोलीमरेज़ है, एमटीडीएनए में बीआरडीयू निगमन को काफी कम कर देगा। हालांकि, इस अध्ययन में, बीआरडीयू निगमन पर प्रभाव नगण्य था (चित्रा 3), जैसा कि क्यूपीसीआर (चित्रा 4 ए) का उपयोग करके एमटीडीएनए स्तरों को मापकर आगे पुष्टि की गई है। पीओएलजी अभिव्यक्ति का खराब डाउनरेगुलेशन लागू सीआरएनए (चित्रा 4 बी) के साथ कोशिकाओं के अभिकर्मक पर इस विरोधाभासी परिणाम की व्याख्या कर सकता है। यह कार्यात्मक अध्ययनों के लिए सीआरएनए का उपयोग करने के संभावित नुकसान पर प्रकाश डालता है और सुझाव देता है कि जीन साइलेंसिंग सत्यापन की आवश्यकता है।

कुल मिलाकर, सुसंस्कृत कोशिकाओं में एमटीडीएनए चयापचय की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक परख विकसित की गई है जो एमटीडीएनए प्रतिकृति, मरम्मत और वितरण का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक बहु-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप और इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग करती है। विधि कई अलग-अलग प्रयोगात्मक स्थितियों के एक साथ अध्ययन के लिए अनुमति देती है। इसका उपयोग एमटीडीएनए चयापचय पर विभिन्न अवरोधकों, सेलुलर तनाव और जीन साइलेंसिंग के प्रभावों की जांच करने के लिए किया जा सकता है। जबकि परख में विभिन्न शारीरिक और रोग संबंधी संदर्भों में एमटीडीएनए चयापचय का अध्ययन करने में उपयोग की उच्च क्षमता है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि परख प्रतिकृति और मरम्मत से जुड़े एमटीडीएनए संश्लेषण को प्रतिष्ठित करने की अनुमति नहीं देती है। परिणामों की व्याख्या करते समय और बाद के कार्यात्मक प्रयोगों की योजना बनाते समय इस पर विचार किया जाना चाहिए। विशेष रूप से, परख में विकास के लिए और अधिक क्षमता है। उदाहरण के लिए, प्रतिकृति-निष्क्रिय (या मरम्मत-निष्क्रिय) माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड एंटी-बीआरडीयू एंटीबॉडी के साथ पता नहीं लगाया जाता है। इसलिए, एंटी-डीएनए एंटीबॉडी का आवेदन एमटीडीएनए राज्य स्तर, प्रतिकृति-मूक न्यूक्लियोइड की संख्या और सेल में न्यूक्लियोइड के वितरण की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम बनाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र, पोलैंड (अनुदान / पुरस्कार संख्या: 2018/31/ डी / एनजेड 2 / 03901) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) Sigma-Aldrich D5782
384  Well Cell Culture Microplates, black Greiner Bio-One #781946
5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) Sigma-Aldrich B5002-1G Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling.
Adhesive sealing film Nerbe Plus 04-095-0060
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21121
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21426
BioTek 405 LS microplate washer Agilent
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Cell counting chamber Thoma Heinz Herenz REF:1080339
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Cytiva SH30243.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 41965-062
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 10270-106
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F1635 Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully.
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody Santa Cruz Biotechnology sc-32323
IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody Progen #61014
LightCycler 480 System Roche
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific #13778150
MitoTracker Deep Red FM Thermo Fisher Scientific M22426 Mitochondria tracking dye 
Multidrop Combi Reagent Dispenser Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD Camera Hamamatsu
Penicillin-Streptomycin  Sigma-Aldrich P0781-100ML
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific A25742
qPCR primer Fw B2M (reference) CAGGTACTCCAAAGATTCAGG 
qPCR primer Fw GPI (reference gene) GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR primer Fw MT-ND1  TAGCAGAGACCAACCGAACC 
qPCR primer Fw POLG TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR primer Fw TFAM GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR primer Fw TWNK GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR primer Rev B2M (reference) GTCAACTTCAATGTCGGATGG 
qPCR primer Rev GPI (reference gene) AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR primer Rev MT-ND1  ATGAAGAATAGGGCGAAGGG 
qPCR primer Rev POLG GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR primer Rev TFAM GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR primer Rev TWNK AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR microscope Olympus
siRNA Ctrl Dharmacon D-001810-10-5
siRNA POLG Invitrogen POLGHSS108223
siRNA TFAM Invitrogen TFAMHSS144252
siRNA TWNK Invitrogen C10orf2HSS125597
Suction device NeoLab 2-9335 Suction device for cell culture
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-500ML
Trypsin Biowest L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA objective Olympus

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References

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जैव रसायन अंक 195 माइटोकॉन्ड्रिया माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए 5-ब्रोमो -2'-डीऑक्सीयूरिडाइन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग
माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए संश्लेषण और वितरण की उच्च-थ्रूपुट छवि-आधारित परिमाणीकरण
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Borowski, L. S., Kasztelan, K., Czerwinska-Kostrzewska, J., Szczesny, R. J. High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution. J. Vis. Exp. (195), e65236, doi:10.3791/65236 (2023).

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