基于图像的高通量线粒体DNA合成和分布定量

Summary

描述了使用多孔板格式和自动免疫荧光成像来检测和量化mtDNA合成和分布的细胞中线粒体DNA（mtDNA）代谢动力学的程序。这可以进一步用于研究各种抑制剂，细胞应激和基因沉默对mtDNA代谢的影响。

Abstract

绝大多数细胞过程需要持续的能量供应，其中最常见的载体是ATP分子。真核细胞通过氧化磷酸化在线粒体中产生大部分ATP。线粒体是独特的细胞器，因为它们有自己的基因组，可以复制并传递给下一代细胞。与核基因组相反，细胞中线粒体基因组有多个拷贝。详细研究负责线粒体基因组复制、修复和维持的机制对于了解线粒体和整个细胞在正常和疾病条件下的正常功能至关重要。本文提出了一种允许高通量定量体外 培养的人细胞 中线粒体DNA（mtDNA）的合成和分布的方法。该方法基于对通过5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）掺入标记的活性合成DNA分子进行免疫荧光检测，以及同时检测具有抗DNA抗体的所有mtDNA分子。此外，线粒体用特定的染料或抗体可视化。以多孔形式培养细胞和利用自动荧光显微镜使得在相对较短的时间内在各种实验条件下研究mtDNA的动力学和线粒体的形态变得更加容易。

Introduction

对于大多数真核细胞来说，线粒体是必不可少的细胞器，因为它们在许多细胞过程中起着至关重要的作用。首先，线粒体^是细胞1的主要能量供应商。线粒体还参与调节细胞稳态（例如，细胞内氧化还原²和钙平衡³），细胞信号传导⁴，5^，细胞凋亡⁶，不同生^{化化合物的}合成7^，8和先天免疫反应⁹。线粒体功能障碍与各种病理状态和人类疾病有关¹⁰.

线粒体的功能取决于位于两个独立基因组中的遗传信息:核基因组和线粒体基因组。与核基因组相比，线粒体基因组编码的基因数量很少，但所有mtDNA编码的基因对人类生命都是必不可少的。维持mtDNA所必需的线粒体蛋白机制由nDNA编码。线粒体爬替体的基本成分以及一些线粒体生物发生因子已经被确定（在以前的研究中回顾了^11，12）。然而，线粒体D....

Protocol

1. siRNA混合物的制备

1. 在实验开始前一天，将细胞（例如HeLa）接种在100毫米的培养皿上，以便第二天达到70%-90%的汇合。
   注意:所有操作必须在无菌条件下在层流室中进行。
2. 在Opti-MEM培养基中制备稀释至140nM浓度的适量的siRNA（参见 材料表）。96孔板可用作储液器。
3. 向黑色 384 孔细胞培养微孔板的每个孔中加入 5 μL siRNA 溶液（或用于对照样品的 Opti-MEM 培养基）。
   注意:根据测试的siRNA样品数量，可以使用电动或多通道移液器。
4. 在Opti-MEM培养基中制备适量的RNAiMAX转染试剂溶液（参见 材料表）。每 100 μL 培养基添加 1 μL RNAiMAX。
5. 向 384 孔板的每个孔中加入 10 μL 转染试剂溶液。最方便、最快捷的方法是使用试剂分配器。
6. 将siRNA与转染试剂在室温下孵育30分钟。

2. 转染用细胞的制备

1. 在孵育期间（步骤1.6），使用抽吸装置吸出培养基（参见 材料表），并用3mL PBS洗涤细胞。
2. 加入在PBS中以1:2稀释的1.5mL胰蛋白酶，并将细胞....

Results

图1显示了mtDNA合成和分布动力学的高通量研究程序方案。使用多孔板形式可以同时分析许多不同的实验条件，例如使用siRNA文库沉默不同的基因。用于用BrdU标记新合成的DNA分子的条件允许检测HeLa细胞线粒体中的BrdU标记DNA（图2A），但也可以用作建立其他细胞类型测定的起始条件。应根据时程实验为单个细胞系选择BrdU孵育时间（补充图1）。在本研究中，使用了HeLa细胞，因为siRNA的筛选需要可以高效转染的细胞。重要的是，用抗BrdU抗体获得的信号是特异性的，因为它只能在用BrdU处理的细胞中观察到（图2）。使用缺乏线粒体DNA²¹的rho0细胞进一步证实了抗BrdU和抗DNA标记的特异性（补充图2）。正如预期的那样，在这些细胞中，无论BrdU处理如何，在线粒体中都没有检测到抗BrdU或抗DNA抗体的信号（

Discussion

从历史上看，通过BrdU掺入和抗体检测进行DNA标记已被用于核DNA复制和细胞周期研究¹⁴，^27，28。到目前为止，所有用于检测BrdU标记DNA的方案都包括DNA变性步骤（酸性或热性）或酶消化（DNase或蛋白酶），以实现表位暴露并促进抗体渗透。这些协议是为紧密包装的核DNA开发的。然而，mtDNA的不同组织使得开发没有变性步骤的程序成为可能;这简化了程序，使其更适合高通量应用。这种方法带来了出色的结果，因为省略变性步骤会导致仅在细胞核外检测BrdU标记的DNA（图2和图3）。因此，该协议可以避免来自核DNA的强信号，当包括变性步骤时始终存在，并且可能通过掩盖来自BrdU标记的mtDNA²⁹的信号而导致严重问题。此外，没有剧烈的变性确保了细胞结构的更好.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′，3′-二脱氧胞苷 （ddC）	Sigma-Aldrich	D5782
384 孔细胞培养微孔板，黑色	Greiner Bio-One	#781946
5-溴-2′-脱氧尿嘧啶 （BrdU）	Sigma-Aldrich	B5002-1G	BrdU 粉末溶于水中，溶于 20 mM 储备液并分装。使用 20 µM BrdU 溶液进行标记。
胶粘剂密封膜	Nerbe Plus	04-095-0060
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG1 二抗	Thermo Fisher Scientific	A-21121
Alexa Fluor 555 山羊抗小鼠 IgM 二抗	Thermo Fisher Scientific	A-21426
BioTek 405 LS 洗板机	安捷伦
血清白蛋白 （BSA）	Sigma-Aldrich	A4503
细胞计数室 Thoma	Heinz Herenz	参考文献：1080339
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）	Cytiva	SH30243.01
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）	Thermo Fisher Scientific	41965-062
胎牛血清 （FBS）	Thermo Fisher Scientific	10270-106
甲醛溶液	Sigma-Aldrich	F1635	甲醛有毒;请仔细阅读安全数据表。
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
IgG1 小鼠单克隆抗 BrdU （IIB5） 一抗	Santa Cruz Biotechnology	sc-32323
IgM 小鼠单克隆抗 DNA （AC-30-10） 一抗	Progen	#61014
LightCycler 480 系统	Roche
Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂	ThermoFisher Scientific	#13778150
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426	线粒体追踪染料
Multidrop Combi 试剂分配器	Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Orca-R2 （C10600） CCD 相机	滨松
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green 预混液	Thermo Fisher Scientific	A25742
qPCR 引物 Fw B2M（参考）			CAGGTACTCCAAAGATTCAGG
qPCR 引物 Fw GPI （参考基因）			GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR 引物 Fw MT-ND1			TAGCAGAGACCAACCGAACC
qPCR 引物 Fw POLG			TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR 引物 Fw TFAM			GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR 引物 Fw TWNK			GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR 引物 Rev B2M （参考）			GTCAACTTCAATGTCGGATGG
qPCR 引物 Rev GPI （参考基因）			AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR 引物 Rev MT-ND1			ATGAAGAATAGGGCGAAGGG
qPCR 引物 Rev POLG			GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR 引物 Rev TFAM			GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR 引物 Rev TWNK			AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR 显微镜	奥林巴斯
siRNA Ctrl	Dharmacon	D-001810-10-5
siRNA POLG	Invitrogen	POLGHSS108223
siRNA TFAM	Invitrogen	TFAMHSS144252
siRNA TWNK	Invitrogen	C10orf2HSS125597
吸引装置	NeoLab	2-9335	细胞培养用吸引装置
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
胰蛋白酶	Biowest	L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA目标	奥林巴斯