Summary
Es wird ein Verfahren zur Untersuchung der Dynamik des mitochondrialen DNA-Stoffwechsels (mtDNA) in Zellen unter Verwendung eines Multi-Well-Plattenformats und automatisierter Immunfluoreszenzbildgebung zum Nachweis und zur Quantifizierung der mtDNA-Synthese und -Verteilung beschrieben. Dies kann weiter genutzt werden, um die Auswirkungen verschiedener Inhibitoren, zellulärer Belastungen und Genstilllegung auf den mtDNA-Stoffwechsel zu untersuchen.
Abstract
Die überwiegende Mehrheit der zellulären Prozesse erfordert eine kontinuierliche Energiezufuhr, deren häufigster Träger das ATP-Molekül ist. Eukaryotische Zellen produzieren den größten Teil ihres ATP in den Mitochondrien durch oxidative Phosphorylierung. Mitochondrien sind einzigartige Organellen, weil sie ein eigenes Genom haben, das repliziert und an die nächste Generation von Zellen weitergegeben wird. Im Gegensatz zum Kerngenom gibt es in der Zelle mehrere Kopien des mitochondrialen Genoms. Die detaillierte Untersuchung der Mechanismen, die für die Replikation, Reparatur und Aufrechterhaltung des mitochondrialen Genoms verantwortlich sind, ist unerlässlich, um das ordnungsgemäße Funktionieren von Mitochondrien und ganzen Zellen sowohl unter normalen als auch unter Krankheitsbedingungen zu verstehen. Hier wird eine Methode vorgestellt, die die Hochdurchsatzquantifizierung der Synthese und Verteilung von mitochondrialer DNA (mtDNA) in in vitro kultivierten humanen Zellen ermöglicht. Dieser Ansatz basiert auf der Immunfluoreszenzdetektion von aktiv synthetisierten DNA-Molekülen, die durch den Einbau von 5-Brom-2'-Desoxyuridin (BrdU) markiert sind, und der gleichzeitigen Detektion aller mtDNA-Moleküle mit Anti-DNA-Antikörpern. Zusätzlich werden die Mitochondrien mit spezifischen Farbstoffen oder Antikörpern sichtbar gemacht. Die Kultivierung von Zellen im Multi-Well-Format und der Einsatz eines automatisierten Fluoreszenzmikroskops erleichtern es, die Dynamik der mtDNA und die Morphologie der Mitochondrien unter verschiedenen experimentellen Bedingungen in relativ kurzer Zeit zu untersuchen.
Introduction
Für die meisten eukaryotischen Zellen sind Mitochondrien essentielle Organellen, da sie eine entscheidende Rolle in zahlreichen zellulären Prozessen spielen. Mitochondrien sind in erster Linie die wichtigsten Energielieferanten der Zellen1. Mitochondrien sind auch an der Regulierung der zellulären Homöostase (z. B. intrazelluläres Redox2 und des Kalziumhaushalts3), der Zellsignalübertragung 4,5, der Apoptose6, der Synthese verschiedener biochemischer Verbindungen 7,8 und der angeborenen Immunantwortbeteiligt 9. Mitochondriale Dysfunktion wird mit verschiedenen pathologischen Zuständen und menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht10.
Die Funktion der Mitochondrien hängt von der genetischen Information ab, die sich in zwei getrennten Genomen befindet: dem Kern- und dem mitochondrialen Genom. Das mitochondriale Genom kodiert im Vergleich zum Kerngenom nur eine kleine Anzahl von Genen, aber alle mtDNA-kodierten Gene sind für das menschliche Leben unerlässlich. Die mitochondriale Proteinmaschinerie, die für die Aufrechterhaltung der mtDNA notwendig ist, wird von nDNA kodiert. Die grundlegenden Komponenten des mitochondrialen Replisoms sowie einige mitochondriale Biogenesefaktoren wurden bereits identifiziert (in früheren Forschungsarbeiten überprüft11,12). Die mitochondrialen DNA-Replikations- und Erhaltungsmechanismen sind jedoch noch weit davon entfernt, verstanden zu werden. Im Gegensatz zur nDNA liegt das mitochondriale Genom in mehreren Kopien vor, was eine zusätzliche Schicht zur Regulierung der mitochondrialen Genexpression darstellt. Viel weniger ist derzeit über die Verteilung und Segregation von mtDNA innerhalb von Organellen bekannt, inwieweit diese Prozesse reguliert sind und wenn ja, welche Proteine beteiligt sind13. Das Segregationsmuster ist entscheidend, wenn Zellen eine gemischte Population aus Wildtyp- und mutierter mtDNA enthalten. Ihre ungleiche Verteilung kann zur Bildung von Zellen mit einer schädlichen Menge an mutierter mtDNA führen.
Bisher wurden die Proteinfaktoren, die für den Erhalt der mtDNA notwendig sind, vor allem durch biochemische Methoden, bioinformatische Analysen oder durch krankheitsassoziierte Studien identifiziert. Um eine hohe Wahrscheinlichkeit zu gewährleisten, Faktoren zu identifizieren, die sich bisher der Identifizierung entzogen haben, wird in dieser Arbeit eine andere Strategie beschrieben. Die Methode basiert auf der Markierung von mtDNA während der Replikation oder Reparatur mit 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU), einem Nukleosid-Analogon von Thymidin. BrdU wird während der DNA-Synthese leicht in entstehende DNA-Stränge eingebaut und im Allgemeinen zur Überwachung der Replikation von Kern-DNAverwendet 14. Das hier entwickelte Verfahren wurde jedoch für den Nachweis von in mtDNA eingebautem BrdU unter Verwendung der Immunfluoreszenz von Anti-BrdU-Antikörpern optimiert.
Der Ansatz ermöglicht die Hochdurchsatzquantifizierung der mtDNA-Synthese und -Verteilung in humanen Zellen, die in vitro kultiviert wurden. Eine Hochdurchsatzstrategie ist notwendig, um Tests unter verschiedenen Versuchsbedingungen in relativ kurzer Zeit durchzuführen; Daher wird im Protokoll vorgeschlagen, ein Multi-Well-Format für die Zellkultivierung und automatisierte Fluoreszenzmikroskopie für die Bildgebung zu verwenden. Das Protokoll umfasst die Transfektion von humanen HeLa-Zellen mit einer siRNA-Bibliothek und die anschließende Überwachung der mtDNA-Replikation oder -Reparatur durch die metabolische Markierung neu synthetisierter DNA mit BrdU. Dieser Ansatz wird mit einer Immunfärbung der DNA mit Hilfe von Anti-DNA-Antikörpern kombiniert. Beide Parameter werden mittels quantitativer Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Zusätzlich werden Mitochondrien mit einem bestimmten Farbstoff sichtbar gemacht. Um die Spezifität des Protokolls zu demonstrieren, wurde die BrdU-Färbung an Zellen ohne mtDNA (rho0-Zellen), an HeLa-Zellen nach dem Silencing bekannter mtDNA-Erhaltungsfaktoren und an HeLa-Zellen nach Behandlung mit einem mtDNA-Replikationsinhibitor getestet. Die mtDNA-Konzentrationen wurden auch mit einer unabhängigen Methode, nämlich der qPCR, gemessen.
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Protocol
1. Herstellung der siRNA-Mischung
- Einen Tag vor Beginn des Experiments werden Zellen (z.B. HeLa) auf einer 100-mm-Schale so ausgesät, dass sie am nächsten Tag eine 70%-90%-Konfluenz erreichen.
Anmerkungen: Alle Operationen müssen unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Kammer durchgeführt werden. - Die entsprechende Menge siRNA wird auf eine Konzentration von 140 nM in Opti-MEM-Medium verdünnt (siehe Materialtabelle) hergestellt. Eine 96-Well-Platte kann als Reservoir verwendet werden.
- Geben Sie 5 μl der siRNA-Lösung (oder des Opti-MEM-Mediums für die Kontrollproben) in jede Vertiefung einer schwarzen 384-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte.
HINWEIS: Abhängig von der Anzahl der getesteten siRNA-Proben kann eine elektronische oder Mehrkanalpipette verwendet werden. - Bereiten Sie die entsprechende Menge RNAiMAX-Transfektionsreagenzlösung (siehe Materialtabelle) in Opti-MEM-Medium vor. Fügen Sie 1 μl RNAiMAX pro 100 μl Medium hinzu.
- Geben Sie 10 μl der Transfektionsreagenzlösung in jede Vertiefung der 384-Well-Platte. Der bequemste und schnellste Weg, dies zu tun, ist mit einem Reagenzienspender.
- Inkubieren Sie die siRNA mit dem Transfektionsreagenz für 30 min bei Raumtemperatur.
2. Vorbereitung der Zellen für die Transfektion
- Während der Inkubation (Schritt 1.6) wird das Medium mit einer Absaugvorrichtung angesaugt (siehe Materialtabelle) und die Zellen mit 3 ml PBS gewaschen.
- Fügen Sie 1,5 ml Trypsin hinzu, das 1:2 in PBS verdünnt ist, und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 10 Minuten.
- Überprüfen Sie, ob sich die Zellen gelöst haben. Wenn dies der Fall ist, fügen Sie 3 ml DMEM-Medium mit 10 % FBS hinzu. Suspendieren Sie die Zellen gründlich und übertragen Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen. Nehmen Sie mindestens 150 μl der Suspension und zählen Sie die Zellen in einer Zellzählkammer (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie eine Zellsuspension in der entsprechenden Konzentration (35.000/ml für die HeLa-Linie) in DMEM-Medium mit 10 % FBS, Penicillin und Streptomycin vor.
3. Zelltransfektion
- Geben Sie 20 μl der Zellsuspension mit dem Reagenziendispenser in jede Vertiefung der 384-Well-Platte. Dies führt dazu, dass pro Well 700 Zellen ausgesät werden.
- Inkubieren Sie die Zellen 1 h bei Raumtemperatur und legen Sie sie dann für 72 h (37 °C und 5 % CO2) in den Inkubator.
4. Gründung der BrdU
- Bereiten Sie eine 90-μM-Lösung von BrdU (siehe Materialtabelle) in DMEM-Medium mit 10 % FBS vor.
- 56 h nach der siRNA-Transfektion (16 h vor der Zellfixierung) werden 10 μl 90 μM BrdU-Lösung in jede Vertiefung der 384-Well-Platte gegeben (die endgültige BrdU-Konzentration beträgt 20 μM).
HINWEIS: Die Aktion sollte so schnell wie möglich ausgeführt werden. Daher ist es am besten, einen Reagenziendispenser, eine elektronische Pipette oder eine Multi-Dispenser-Pipette zu verwenden. Denken Sie daran, Kontrollbohrungen ohne Zusatz von BrdU vorzubereiten. - Inkubieren Sie die Zellen für 16 h (37 °C und 5 % CO2).
5. Markierung von Mitochondrien
- Bereiten Sie eine 20 μM Lösung von BrdU in DMEM mit 10 % FBS vor und fügen Sie ihr die Mitochondrien-Tracking-Farbstofflösung (siehe Materialtabelle) bis zu einer Konzentration von 1,1 μM hinzu.
- 15 h nach Beginn der BrdU-Inkorporation (1 h vor der Zellfixierung) werden 10 μl der Mitochondrien-Tracking-Farbstofflösung (siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung der 384-Well-Platte gegeben (die endgültige Farbstoffkonzentration beträgt 200 nM).
Anmerkungen: Verwenden Sie einen Reagenziendispenser, eine elektronische Pipette oder eine Multi-Dispenser-Pipette. Denken Sie daran, Kontrollvertiefungen ohne Zusatz von BrdU, aber mit Zugabe des Mitochondrien-Tracking-Farbstoffs beizubehalten. - Inkubieren Sie die Zellen für 1 h (37 °C und 5 % CO2).
6. Fixierung der Zellen
Anmerkungen: Das Waschen erfolgt am bequemsten mit einem Mikrotiterplattenreiniger, während die Zugabe von Reagenzien am schnellsten mit einem Reagenzienspender erfolgt.
- Spülen Sie mit dem Mikrotiterplatten-Washer (siehe Materialtabelle) jeweils zweimal mit 100 μl PBS aus. Lassen Sie nach dem zweiten Waschen 25 μl PBS in der Vertiefung.
HINWEIS: Wenn PBS in der Vertiefung verbleibt, verringert sich die Wahrscheinlichkeit einer Zellablösung während der Zugabe von Flüssigkeit im nächsten Schritt. Alle Wäschen werden mit dem PBS abgeschlossen; Daher sollte die im nächsten Schritt hinzugefügte Lösung immer in einer 2-fachen Konzentration hergestellt werden, da sie in gleichem Volumen zum verbleibenden PBS hinzugefügt wird. - Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 25 μl einer 8%igen Formaldehydlösung in PBS mit 0,4% Triton X-100 und Hoechst 33342 bei einer Konzentration von 4 μg/ml (die Endkonzentrationen der einzelnen Reagenzien betragen 4 %, 0,2 % bzw. 2 μg/ml) (siehe Materialtabelle).
- Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
7. Sperrung
- Spülen Sie jede Vertiefung viermal mit 100 μl PBS aus. Lassen Sie nach der letzten Wäsche 25 μl PBS in der Welle.
- Geben Sie 25 μl 6 % BSA in PBS (die endgültige BSA-Konzentration beträgt 3 %) in jede Vertiefung.
- Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
8. Zugabe der Primärantikörper
- Aspirieren Sie die BSA mit einem Mikrotiterplatten-Washer und lassen Sie 10 μl Lösung in der Vertiefung.
- Fügen Sie 10 μl der primären Antikörperlösung hinzu, die in 3 % BSA in PBS hergestellt wurde. Anti-BrdU mit 0,8 μg/ml und Anti-DNA mit 0,4 μg/ml (die Endkonzentrationen der Antikörper betragen 0,4 μg/ml bzw. 0,2 μg/ml) (siehe Materialtabelle).
- Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln bei 4 °C über Nacht.
9. Zugabe der Sekundärantikörper
- Spülen Sie jede Vertiefung viermal mit 100 μl PBS aus. Lassen Sie nach dem letzten Waschen 10 μl PBS in der Vertiefung.
- Fügen Sie 10 μl der 4 μg/ml Sekundärantikörperlösung hinzu, die in 6 % BSA in PBS hergestellt wurde (die Endkonzentration beträgt 2 μg/ml). Verwenden Sie isotypspezifische Antikörper (Anti-Maus-IgG1 und Anti-Maus-IgM), die an Fluorochrome wie Alexa Fluor 488 und Alexa Fluor 555 konjugiert sind (siehe Materialtabelle).
- Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur für 1 h.
- Spülen Sie jede Vertiefung viermal mit 100 μl PBS aus. Lassen Sie nach dem letzten Waschen 50 μl PBS in der Vertiefung.
- Verschließen Sie die Platte mit einer selbstklebenden Siegelfolie (siehe Materialtabelle) und lagern Sie sie im Dunkeln bei 4 °C. Die Bildgebung muss innerhalb von 2 Wochen durchgeführt werden.
10. Bildgebung
HINWEIS: Die Bildgebung muss mit einem automatisierten Weitfeldmikroskop durchgeführt werden. Das Mikroskop muss mit einem Motortisch ausgestattet sein, der mit Bedienelementen ausgestattet ist, um einzelne Bereiche der Platte automatisch abzubilden.
- Überprüfen Sie die Autofokuseinstellungen in den Eckbereichen der Platte (Vertiefungen A1, A24, P24, P1) und in der Mitte.
HINWEIS: Für die Bildgebung wird empfohlen, ein 20-faches Objektiv mit kurzem Arbeitsabstand (siehe Materialtabelle) mit der höchstmöglichen numerischen Apertur zu verwenden. - Wählen Sie anhand der von der Bildgebungssoftware im Live-View-Modus erzeugten Intensitätshistogramme eine ausreichend lange Belichtungszeit für die einzelnen Fluoreszenzkanäle, damit das resultierende Bild nicht übersättigt wird.
- Legen Sie die entsprechende Anzahl von Ebenen für die Bildgebung auf der z-Achse fest.
HINWEIS: Das Sichtfeld bei 20-facher Vergrößerung ist groß genug, dass sich nicht alle Zellen in derselben Fokusebene befinden, daher muss ein Z-Schnitt durchgeführt werden, um alle Zellen in ihrer richtigen Fokusebene anzuzeigen. In der Regel reichen fünf Flugzeuge aus. Je nach verfügbarem Speicherplatz können einzelne Z-Stapel oder nur Projektionen der maximalen Intensität gespeichert werden. Die im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" gezeigte Bildanalyse basiert auf Projektionen der maximalen Intensität. - Wählen Sie die entsprechende Anzahl von Sichtfeldern aus, die pro Vertiefung angezeigt werden sollen.
HINWEIS: Je nach Konfluenz können ca. 60-300 Zellen in einem Sichtfeld abgebildet werden. In der Regel können HeLa-Zellen mit einer Konfluenz von 60 % bis 90 % durch die Abbildung von fünf Sichtfeldern von 500 Zellen bis über 1.000 Zellen analysiert werden. - Wählen Sie die Wells aus, die abgebildet werden sollen, und starten Sie die Bildgebung.
11. Quantitative Bildanalyse
HINWEIS: Die quantitative Analyse der aufgenommenen Bilder kann mit einer Open-Source-Software wie Cell Profiler15 durchgeführt werden. Für die vorliegende Studie wurde die Analyse mit der Software ScanR 3.0.0 durchgeführt (siehe Materialtabelle).
- Beginnen Sie die Analyse, indem Sie eine Hintergrundkorrektur für alle Bilder aus allen Fluoreszenzkanälen durchführen. Wählen Sie je nach Größe der analysierten Objekte die passende Filtergröße: 80 Pixel für Zellkerne und 4 Pixel für BrdU- und mtDNA-Spots.
- Beginnen Sie mit der Segmentierung des Bildes, indem Sie eine Maske des Hauptobjekts erstellen, die auf dem Verhältnis der Intensität des Fluoreszenzsignals zum Hintergrund für den Kanal basiert, der den Zellkernen entspricht.
- Erstellen Sie Masken für die Unterobjekte, die die BrdU- bzw. mtDNA-Punkte darstellen, indem Sie die für die gegebenen Strukturen geeigneten Fluoreszenzkanäle verwenden.
HINWEIS: Jedes Unterobjekt ist dem nächstgelegenen Hauptobjekt (Zellkern) zugeordnet. - Legen Sie die Parameter fest, die während der Analyse gemessen werden sollen, und messen Sie die Intensität der einzelnen Pixel innerhalb jeder Maske für alle Fluoreszenzkanäle.
HINWEIS: Es ist auch notwendig, die Anzahl der Unterobjekte zu berechnen, die einem bestimmten Zellkern zugeordnet sind, und die Fläche jedes Unterobjekts. - Definieren Sie die abgeleiteten Parameter, die auf der Grundlage der erhaltenen Daten berechnet werden sollen. Um die Gesamtfluoreszenzintensitäten für den BrdU- oder mtDNA-Kanal zu erhalten, summieren Sie die Intensitäten aller Unterobjekte, die einem bestimmten Zellkern zugeordnet sind. Um die mittlere Fluoreszenzintensität zu erhalten, dividieren Sie die Gesamtfluoreszenzintensität durch die Summe der Fläche der Unterobjekte, die einem bestimmten Zellkern zugeordnet sind.
HINWEIS: Um sicherzustellen, dass sich das erstellte Unterobjekt (BrdU- oder mtDNA-Spot) tatsächlich in den Mitochondrien befindet, ist es notwendig, sie basierend auf der Fluoreszenzintensität des Mitochondrien-Tracking-Farbstoffs zu gaten. - Führen Sie eine weitere Analyse der mit der ScanR-Software erhaltenen Daten mit der Statistiksoftware R 4.2.216 zusammen mit den folgenden Paketen durch: dplyr 17, data.table18, ggplot219 und ggpubr20. Dieser Schritt ist optional.
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Representative Results
Ein Schema des Verfahrens für die Hochdurchsatzuntersuchung der Dynamik der mtDNA-Synthese und -Verteilung ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Verwendung eines Multi-Well-Plattenformats ermöglicht die gleichzeitige Analyse vieler verschiedener experimenteller Bedingungen, wie z.B. das Silencing verschiedener Gene mit Hilfe einer siRNA-Bibliothek. Die Bedingungen, die für die Markierung neu synthetisierter DNA-Moleküle mit BrdU verwendet werden, ermöglichen den Nachweis von BrdU-markierter DNA in den Mitochondrien von HeLa-Zellen (Abbildung 2A), können aber auch als Ausgangsbedingungen für die Einrichtung des Assays für andere Zelltypen verwendet werden. Die Inkubationszeit mit BrdU sollte für einzelne Zelllinien anhand eines Zeitverlaufsexperiments gewählt werden (ergänzende Abbildung 1). In der vorliegenden Arbeit wurden HeLa-Zellen verwendet, da für das Screening von siRNAs Zellen benötigt werden, die mit hoher Effizienz transfiziert werden können. Wichtig ist, dass das Signal, das mit Anti-BrdU-Antikörpern erhalten wird, spezifisch ist, da es nur in Zellen beobachtet werden kann, die mit BrdU behandelt wurden (Abbildung 2). Die Spezifität der Anti-BrdU- und Anti-DNA-Markierung wurde anhand von rho0-Zellen bestätigt, denen die mitochondriale DNA21 fehlt (ergänzende Abbildung 2). Erwartungsgemäß wurde in diesen Zellen, unabhängig von der BrdU-Behandlung, kein Signal in den Mitochondrien sowohl für den Anti-BrdU- als auch für den Anti-DNA-Antikörper nachgewiesen (Abbildung 2B). Die Quantifizierung des Fluoreszenzsignals der Anti-BrdU-Antikörper zeigte, dass die mit BrdU behandelten rho0-Zellen die gleiche niedrige Fluoreszenz aufwiesen wie die unbehandelten BrdU-Zellen, während das Signal für die Elternlinien A549 und HeLa im Durchschnitt 50-fach höher war (Abbildung 2C).
Um die Nützlichkeit der hier vorgestellten Methode bei der Untersuchung der mitochondrialen DNA-Synthese und -Verteilung zu demonstrieren, wurde ein Experiment durchgeführt, in dem HeLa-Zellen mit 2′,3′-Didesoxycytidin (ddC), einem Inhibitor der mtDNA-Synthese22, behandelt wurden und die Expression von Genen, von denen bekannt ist, dass sie für die mtDNA-Replikation essentiell sind, mit siRNA stillgelegt wurde (Abbildung 3). Die Behandlung von Zellen mit ddC führte zu einer vollständigen Hemmung des BrdU-Einbaus, während die verwendeten siRNAs unterschiedliche Effekte zeigten. Die Herunterregulierung der Twinkle-Helikase (TWNK)23 führte zur stärksten Hemmung des BrdU-Einbaus; Für das TFAM-Protein24 wurde ein schwächerer Effekt beobachtet, während das Silencing der mitochondrialen DNA-Polymerase gamma (POLG)25 zu einer moderaten Abnahme der BrdU-Inkorporation im Vergleich zu Zellen führte, die mit negativ kontrollierter siRNA behandelt wurden (Abbildung 3A,B). Die Verwendung von Anti-DNA-Antikörpern im Verfahren ermöglicht die Überwachung der mtDNA-Verteilung in der Zelle unter den gegebenen experimentellen Bedingungen. Die Herunterregulierung von TFAM führte zu drastischen Veränderungen in der mtDNA-Verteilung; Im Vergleich zu Kontrollzellen wurden weniger mtDNA-Spots nachgewiesen, aber die verbleibenden wiesen eine sehr hohe Fluoreszenzintensität auf (Abbildung 3A). Die Quantifizierung des mittleren Fluoreszenzsignals des Anti-DNA-Antikörpers zeigte einen mehrfachen Anstieg des TFAM-Silencings im Vergleich zu den anderen getesteten Bedingungen (Abbildung 3C).
Die Spezifität der Bildgebungsergebnisse wurde durch die Messung der mtDNA und der Genexpression mit Hilfe der quantitativen real-time PCR (qPCR) verifiziert (Abbildung 4). Das Verfahren ist an anderer Stelle26 ausführlich beschrieben worden. Die Behandlung mit ddC führte zu einer sehr starken Abnahme der mtDNA-Spiegel; ein schwächerer Effekt wurde im Falle von TFAM- und TWNK-Silencing beobachtet, während die Transfektion von Zellen mit POLG-siRNA einen sehr geringen Effekt auf die mtDNA-Kopienzahl hatte (Abbildung 4A). Die Quantifizierung der TFAM- und TWNK-Expression bestätigte eine effiziente Reduktion ihrer Expression auf ~15%-20% der Kontrollniveaus, im Gegensatz zu POLG, dessen Expression auf mRNA-Ebene auf 30% reduziert wurde (Abbildung 4B).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Protokollschritte. Die Maßstabsbalken für die mikroskopischen Aufnahmen betragen 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Spezifischer Nachweis des Einbaus von BrdU in die mtDNA durch Anti-BrdU-Antikörper. Beispielbilder von (A) HeLa und (B) A549 und A549 rho0 Zellen, die einer Immunfluoreszenzfärbung mit Anti-BrdU (grün) und Anti-DNA (rot) Antikörpern unterzogen wurden. Die Zellen wurden mit der BrdU-Lösung behandelt oder nicht behandelt. Die nukleäre DNA (blau) wurde mit Hoechst markiert und die Mitochondrien (cyan) wurden mit einem Mitochondrien-Tracking-Farbstoff visualisiert. Es wird ein zusammengefügtes Bild aller vier Fluoreszenzkanäle gezeigt. Der Maßstabsbalken stellt 10 μm dar. (C) Das Ergebnis der Quantifizierung des Signals der Anti-BrdU-Antikörper. Die Analyse wurde für vier unabhängige biologische Replikate durchgeführt; Jedes Mal wurden 100 zufällig ausgewählte Zellen für jede Versuchsbedingung analysiert (N = 400 Zellen). Im Durchschnitt wurden 18 BrdU-Herde pro Zelle detektiert. Die Kästchen stellen das erste und dritte Quartil des Interquartilsabstands (IQR) dar, der Median wird durch eine horizontale Linie dargestellt, die Whisker definieren das Minimum und Maximum, und die Ausreißer sind als 1,5 x IQR definiert. Es wurde ein statistischer Kruskal-Wallis-Test durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Ergebnisse der Hemmung der mtDNA-Synthese, einschließlich der Verringerung der Effizienz des BrdU-Einbaus und der Beeinflussung der Verteilung von Nukleoiden. (A) Fluoreszenzbilder von HeLa-Zellen, die 72 h lang mit ddC oder siRNA behandelt wurden, die die an der mtDNA-Replikation beteiligten Proteine herunterregulieren. Die Zellen wurden vor der Fixierung 16 h lang mit BrdU behandelt. Die Kern-DNA (blau) wurde mit Hoechst gefärbt, es wurden Anti-BrdU- (grün) und Anti-DNA-Antikörper (rot) verwendet, und die Mitochondrien wurden mit einem Mitochondrien-Tracking-Farbstoff markiert. Es wird ein zusammengefügtes Bild aller vier Fluoreszenzkanäle gezeigt. Der Maßstabsbalken stellt 10 μm dar. (B,C) Quantifizierung der Fluoreszenzsignale von (B) Anti-BrdU- und (C) Anti-DNA-Antikörpern. Die Analyse wurde für vier unabhängige biologische Replikate durchgeführt; jedes Mal wurden 650 zufällig ausgewählte Zellen für jede Versuchsbedingung analysiert (N = 2.600 Zellen). Im Mittel wurden 18 BrdU-Foci und 46 mtDNA-Foci pro Zelle detektiert. Die Kästchen stellen das erste und dritte Quartil des Interquartilsabstands (IQR) dar, der Median wird durch eine horizontale Linie dargestellt, die Whisker definieren das Minimum und Maximum, und die Ausreißer sind als 1,5 x IQR definiert. Es wurde ein statistischer Kruskal-Wallis-Test durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Validierung der Effizienz der Hemmung der mtDNA-Synthese und der Wirksamkeit der getesteten siRNAs. HeLa-Zellen wurden 72 h lang mit ddC oder den angegebenen siRNAs behandelt und anschließend einer DNA- und RNA-Isolierung unterzogen. (A) Ergebnisse der mtDNA-Level-Analyse mittels qPCR. (B) qPCR-Analyse von Genexpressionsänderungen unter den angegebenen Bedingungen. Die Balken stellen die Mittelwerte von vier unabhängigen biologischen Wiederholungen dar; Die Fehlerbalken stellen das REM dar. ein statistischer ANOVA-Test wurde durchgeführt; Es wurde ein t-Test für den paarweisen Vergleich mit Untr (unbehandelten) Proben durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Dynamik des BrdU-Einbaus in die mtDNA von HeLa-Zellen. Gezeigt werden die Ergebnisse eines Zeitverlaufsexperiments, bei dem die Zellen für eine bestimmte Zeit mit 20 μM BrdU inkubiert wurden. Die Mittelwerte von vier unabhängigen Replikaten für jeden Zeitpunkt werden angezeigt. In jedem Replikat wurden 900 zufällig ausgewählte Zellen analysiert. Die Balken stellen die Mittelwerte von vier Wiederholungen dar. Es wurde ein statistischer ANOVA-Test durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Validierung der A549 rho0-Zellen. (A) Elektrophoretische Analyse der qPCR-Produkte aus der Amplifikation von DNA-Fragmenten der mtDNA-kodierten ND1 - und nukleären DNA-kodierten B2M-Gene . Die Gesamt-DNA von A549 oder A549 rho0 Zellen wurde als Matrize für die Reaktion verwendet. (B) Ergebnisse der mtDNA-Level-Analyse mittels qPCR. Die Balken stellen die Mittelwerte von vier unabhängigen biologischen Wiederholungen dar; Die Fehlerbalken stellen das REM dar. Es wurde ein t-Test durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
In der Vergangenheit wurde die DNA-Markierung durch BrdU-Einbau und Antikörpernachweis in der nukleären DNA-Replikation und Zellzyklusforschung eingesetzt 14,27,28. Bisher enthielten alle Protokolle zum Nachweis von BrdU-markierter DNA einen DNA-Denaturierungsschritt (sauer oder thermisch) oder einen Enzymverdau (DNase oder Proteinase), um die Epitopexposition zu ermöglichen und das Eindringen von Antikörpern zu erleichtern. Diese Protokolle wurden für dicht gepackte nukleäre DNA entwickelt. Die unterschiedliche Organisation der mtDNA ermöglichte jedoch die Entwicklung eines Verfahrens ohne den Denaturierungsschritt; Dadurch wurde das Verfahren vereinfacht und für Anwendungen mit hohem Durchsatz besser geeignet. Dieser Ansatz hat zu hervorragenden Ergebnissen geführt, da der Verzicht auf den Denaturierungsschritt dazu führt, dass BrdU-markierte DNA nur außerhalb des Zellkerns nachgewiesen werden kann (Abbildung 2 und Abbildung 3). Folglich kann mit diesem Protokoll das starke Signal der Kern-DNA vermieden werden, das immer dann vorhanden ist, wenn ein Denaturierungsschritt enthalten ist, und das durch die Maskierung des Signals von BrdU-markierter mtDNA29 ein schwerwiegendes Problem verursachen kann. Darüber hinaus sorgt das Fehlen einer starken Denaturierung für eine bessere Erhaltung der Zellstrukturen und beeinträchtigt nicht die Effizienz der Färbung durch fluoreszierende Färbungen wie Hoechst oder Mitochondrien-Tracking-Farbstoff (Abbildung 2 und Abbildung 3).
Die Dynamik des Einbaus von BrdU in mtDNA ist abhängig von der Zelllinie. Die Durchführung eines Zeitverlaufsexperiments zur BrdU-Inkorporation wird empfohlen, wenn eine neue Zelllinie verwendet wird. In dieser Studie wurde 16 h als optimale BrdU-Inkubationszeit für HeLa-Zelllinien festgelegt. Aufgrund der biologischen Variation in HeLa-Linien aus verschiedenen Laboratorien30 wird jedoch vorgeschlagen, ein BrdU-Zeitverlaufsexperiment an der speziellen HeLa-Variante durchzuführen, mit der man arbeiten möchte.
Die Kombination von Anti-BrdU- und Anti-DNA-Markierung in diesem Protokoll ermöglicht die Überwachung der mtDNA-Synthese und die gleichzeitige Untersuchung der mtDNA-Verteilung in der Zelle. Dies ist sehr gut in TFAM-stillgelegten Zellen zu sehen (Abbildung 3). Eine Verringerung des TFAM-Spiegels führt zu einer Verringerung der mtDNA-Synthese (ein verringertes Gesamt-Anti-BrdU-Signal) und zu einer Clusterbildung von mitochondrialen Nukleoiden, was sich in einem erheblichen Anstieg des mittleren mtDNA-Fluoreszenzsignals manifestiert (Abbildung 3). Es ist zu beachten, dass in diesem Fall der Anstieg der mittleren mtDNA-Fluoreszenzintensität durch die veränderte Verteilung der mitochondrialen Nukleoide verursacht wird und nicht die Hochregulierung der mtDNA-Spiegel widerspiegelt. Tatsächlich sind die mtDNA-Spiegel reduziert, wie die quantitative PCR-Analyse ergab (Abbildung 4A). Überraschende Ergebnisse wurden für die mit POLG siRNA transfizierten Zellen erzielt (Abbildung 3). Man könnte erwarten, dass die Transfektion von Zellen mit siRNA-gerichteter POLG, der replikativen DNA-Polymerase in Mitochondrien, den Einbau von BrdU in die mtDNA signifikant reduzieren würde. In dieser Studie war der Effekt auf die BrdU-Inkorporation jedoch vernachlässigbar (Abbildung 3), was durch die Messung der mtDNA-Spiegel mittels qPCR weiter bestätigt wurde (Abbildung 4A). Die schlechte Herunterregulierung der POLG-Expression kann dieses scheinbar widersprüchliche Ergebnis bei der Transfektion von Zellen mit der applizierten siRNA erklären (Abbildung 4B). Dies verdeutlicht einen potenziellen Nachteil der Verwendung von siRNA für funktionelle Studien und deutet darauf hin, dass eine Gen-Silencing-Validierung erforderlich ist.
Insgesamt wurde ein Assay zur Untersuchung der Dynamik des mtDNA-Stoffwechsels in kultivierten Zellen entwickelt, der ein Multi-Well-Plattenformat und Immunfluoreszenz-Bildgebung verwendet, um die mtDNA-Replikation, -Reparatur und -Verteilung zu erkennen und zu quantifizieren. Die Methode ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung vieler verschiedener Versuchsbedingungen. Es kann verwendet werden, um die Auswirkungen verschiedener Inhibitoren, zellulärer Stressfaktoren und Genstilllegung auf den mtDNA-Stoffwechsel zu untersuchen. Obwohl der Assay ein hohes Potenzial für die Untersuchung des mtDNA-Stoffwechsels in verschiedenen physiologischen und pathologischen Kontexten hat, sollte beachtet werden, dass der Assay keine Unterscheidung zwischen Replikation und reparaturgebundener mtDNA-Synthese zulässt. Dies sollte bei der Interpretation der Ergebnisse und der Planung nachfolgender funktioneller Experimente berücksichtigt werden. Bemerkenswert ist, dass der Assay weiteres Entwicklungspotenzial aufweist. Zum Beispiel werden replikationsinaktive (oder reparaturinaktive) mitochondriale Nukleoide mit Anti-BrdU-Antikörpern nicht nachgewiesen. Daher ermöglicht die Anwendung von Anti-DNA-Antikörpern die Quantifizierung der mtDNA-Zustandsniveaus, der Anzahl der replikationsstillen Nukleoide und der Verteilung von Nukleoiden in der Zelle.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Science Centre, Polen unterstützt (Grant/Award Number: 2018/31/D/NZ2/03901).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
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