Summary
En prosedyre for å studere dynamikken i mitokondriell DNA (mtDNA) metabolisme i celler ved hjelp av et multi-brønn plateformat og automatisert immunfluorescensavbildning for å oppdage og kvantifisere mtDNA-syntese og distribusjon er beskrevet. Dette kan videre brukes til å undersøke effekten av ulike hemmere, cellulære påkjenninger og geninaktivering på mtDNA-metabolismen.
Abstract
De aller fleste cellulære prosesser krever kontinuerlig tilførsel av energi, den vanligste bæreren er ATP-molekylet. Eukaryote celler produserer mesteparten av deres ATP i mitokondriene ved oksidativ fosforylering. Mitokondrier er unike organeller fordi de har sitt eget genom som replikeres og overføres til neste generasjon celler. I motsetning til det nukleære genomet er det flere kopier av mitokondriegenomet i cellen. Den detaljerte studien av mekanismene som er ansvarlige for replikasjon, reparasjon og vedlikehold av mitokondriegenomet er avgjørende for å forstå riktig funksjon av mitokondrier og hele celler under både normale og sykdomsforhold. Her presenteres en metode som tillater høy gjennomstrømningskvantifisering av syntesen og fordelingen av mitokondrielt DNA (mtDNA) i humane celler dyrket in vitro . Denne tilnærmingen er basert på immunfluorescensdeteksjon av aktivt syntetiserte DNA-molekyler merket ved 5-brom-2'-deoksyuridin (BrdU) inkorporering og samtidig påvisning av alle mtDNA-molekylene med anti-DNA-antistoffer. I tillegg visualiseres mitokondriene med spesifikke fargestoffer eller antistoffer. Dyrking av celler i et multibrønnformat og bruk av et automatisert fluorescensmikroskop gjør det lettere å studere dynamikken til mtDNA og mitokondrienes morfologi under en rekke eksperimentelle forhold på relativt kort tid.
Introduction
For de fleste eukaryote celler er mitokondrier essensielle organeller, da de spiller en avgjørende rolle i mange cellulære prosesser. Først og fremst er mitokondrier de viktigste energileverandørene til celler1. Mitokondrier er også involvert i regulering av cellulær homeostase (for eksempel intracellulær redoks-2 og kalsiumbalanse3), cellesignalering4,5, apoptose6, syntesen av forskjellige biokjemiske forbindelser 7,8 og den medfødte immunresponsen9. Mitokondriell dysfunksjon er forbundet med ulike patologiske tilstander og menneskelige sykdommer10.
Funksjonen av mitokondrier avhenger av den genetiske informasjonen som ligger i to separate genomer: kjernefysiske og mitokondrielle genomer. Mitokondriegenomet koder for et lite antall gener sammenlignet med kjernegenomet, men alle mtDNA-kodede gener er essensielle for menneskeliv. Det mitokondrielle proteinmaskineriet som er nødvendig for å opprettholde mtDNA, er kodet av nDNA. De grunnleggende komponentene i mitokondriell replisome, samt noen mitokondrielle biogenesefaktorer, er allerede identifisert (gjennomgått i tidligere forskning11,12). Imidlertid er mitokondriell DNA-replikasjon og vedlikeholdsmekanismer fortsatt langt fra å bli forstått. I motsetning til nDNA eksisterer mitokondriegenomet i flere kopier, noe som gir et ekstra lag for å regulere mitokondriell genuttrykk. Mye mindre er for tiden kjent om distribusjon og segregering av mtDNA i organeller, i hvilken grad disse prosessene er regulert, og hvis de er, hvilke proteiner som er involvert13. Segregeringsmønsteret er avgjørende når celler inneholder en blandet populasjon av villtype og mutert mtDNA. Deres ulik fordeling kan føre til generering av celler med en skadelig mengde mutert mtDNA.
Så langt har proteinfaktorene som er nødvendige for mtDNA-vedlikehold blitt identifisert hovedsakelig ved biokjemiske metoder, bioinformatiske analyser eller gjennom sykdomsassosierte studier. For å sikre stor sjanse for å identifisere faktorer som tidligere har unnsluppet identifisering, beskrives en annen strategi i dette arbeidet. Metoden er basert på merking av mtDNA under replikasjon eller reparasjon med 5-brom-2'-deoksyuridin (BrdU), en nukleosidanalog av tymidin. BrdU er lett innlemmet i begynnende DNA-tråder under DNA-syntese og brukes generelt til å overvåke replikasjonen av nukleært DNA14. Imidlertid har prosedyren utviklet her blitt optimalisert for å oppdage BrdU innlemmet i mtDNA ved bruk av immunfluorescens av anti-BrdU-antistoffer.
Tilnærmingen muliggjør høy gjennomstrømningskvantifisering av mtDNA-syntese og distribusjon i humane celler dyrket in vitro. En strategi med høy gjennomstrømning er nødvendig for å gjennomføre tester under forskjellige eksperimentelle forhold på relativt kort tid; Derfor foreslås det i protokollen å benytte et multibrønnformat for celledyrking og automatisert fluorescensmikroskopi for avbildning. Protokollen inkluderer transfeksjon av humane HeLa-celler med et siRNA-bibliotek og den påfølgende overvåking av mtDNA-replikasjon eller reparasjon ved bruk av metabolsk merking av nylig syntetisert DNA med BrdU. Denne tilnærmingen kombineres med immunfarging av DNA ved hjelp av anti-DNA-antistoffer. Begge parametrene analyseres ved hjelp av kvantitativ fluorescensmikroskopi. I tillegg visualiseres mitokondrier med et bestemt fargestoff. For å demonstrere protokollens spesifisitet ble BrdU-farging testet på celler uten mtDNA (rho0-celler), på HeLa-celler ved deaktivering av kjente mtDNA-vedlikeholdsfaktorer, og på HeLa-celler etter behandling med en mtDNA-replikasjonshemmer. mtDNA-nivåene ble også målt med en uavhengig metode, nemlig qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av siRNA-blandingen
- En dag før starten av forsøket, frøceller (f.eks. HeLa) på en 100 mm tallerken slik at de når 70% -90% samløp neste dag.
MERK: Alle operasjoner må utføres under sterile forhold i et laminært strømningskammer. - Klargjør riktig mengde siRNA fortynnet til en konsentrasjon på 140 nM i Opti-MEM medium (se Materialtabell). En plate med 96 brønner kan brukes som reservoar.
- Tilsett 5 μL av siRNA-løsningen (eller Opti-MEM-medium for kontrollprøvene) til hver brønn av en svart 384-brønns cellekulturmikroplate.
MERK: Avhengig av antall siRNA-prøver som er testet, kan en elektronisk eller flerkanals pipette brukes. - Klargjør riktig mengde RNAiMAX transfeksjonsreagensoppløsning (se materialfortegnelse) i Opti-MEM medium. Tilsett 1 μL RNAiMAX for hver 100 μL medium.
- Tilsett 10 μL av transfeksjonsreagensoppløsningen til hver brønn i 384-brønnplaten. Den mest praktiske og raskeste måten å gjøre dette på er med en reagensdispenser.
- Inkuber siRNA med transfeksjonsreagenset i 30 minutter ved romtemperatur.
2. Forberedelse av celler for transfeksjon
- Under inkubasjonen (trinn 1.6), aspirer mediet ved hjelp av en sugeanordning (se materialfortegnelse), og vask cellene med 3 ml PBS.
- Tilsett 1,5 ml trypsin fortynnet 1:2 i PBS, og inkuber cellene ved 37 °C i 10 minutter.
- Sjekk om cellene har løsnet; tilsett i så fall 3 ml DMEM-medium med 10% FBS. Suspender cellene grundig, og overfør dem til et 15 ml rør. Ta minst 150 μL av suspensjonen, og tell cellene i et celletellingskammer (se Materialfortegnelse).
- Forbered en cellesuspensjon ved riktig konsentrasjon (35 000 / ml for HeLa-linjen) i DMEM-medium med 10% FBS, penicillin og streptomycin.
3. Cell transfeksjon
- Tilsett 20 μL av cellesuspensjonen til hver brønn på 384-brønnplaten ved hjelp av reagensdispenseren. Dette vil resultere i 700 celler sådd per brønn.
- Inkuber cellene i 1 time ved romtemperatur, og legg dem deretter i inkubatoren i 72 timer (37 ° C og 5% CO2).
4. BrdU-innlemmelse
- Forbered en 90 μM løsning av BrdU (se materialfortegnelse) i DMEM medium med 10% FBS.
- Ved 56 timer etter siRNA-transfeksjonen (16 timer før cellefiksering), tilsett 10 μL 90 μM BrdU-løsning til hver brønn på 384-brønnplaten (den endelige BrdU-konsentrasjonen er 20 μM).
MERK: Handlingen skal utføres så raskt som mulig; Derfor er det best å bruke en reagensdispenser, elektronisk pipette eller multidispenserpipette. Husk å forberede kontrollbrønner uten tillegg av BrdU. - Inkuber cellene i 16 timer (37 °C og 5 % CO2).
5. Merking av mitokondrier
- Forbered en 20 μM-løsning av BrdU i DMEM med 10% FBS, og tilsett mitokondriesporingsfargestoffløsningen (se materialtabell) til en konsentrasjon på 1,1 μM.
- Ved 15 timer etter starten av BrdU-inkorporering (1 time før cellefiksering), tilsett 10 μL av mitokondriesporingsfargestoffløsningen (se materialtabell) til hver brønn på 384-brønnplaten (den endelige fargestoffkonsentrasjonen er 200 nM).
MERK: Bruk en reagensdispenser, elektronisk pipette eller multidispenserpipette. Husk å beholde kontrollbrønner uten tillegg av BrdU, men med tillegg av mitokondriesporingsfargestoffet. - Inkuber cellene i 1 time (37 °C og 5% CO2).
6. Cell fiksering
NOTAT: All vasking utføres mest hensiktsmessig ved hjelp av en mikroplatevaskemaskin, mens tilsetning av reagenser utføres raskest ved hjelp av en reagensdispenser.
- Bruk mikroplatevaskemaskinen (se materialfortegnelse), skyll hver brønn to ganger med 100 μL PBS. Etter den andre vasken, la 25 μL PBS ligge i brønnen.
MERK: Leaving PBS i brønnen reduserer sannsynligheten for celle løsrivelse under tilsetning av væske i neste trinn. Alle vaskene er ferdig med PBS igjen i; Derfor bør løsningen som tilsettes i neste trinn alltid fremstilles ved en 2x konsentrasjon, da den vil bli tilsatt i et likt volum som de gjenværende PBS. - Fikser cellene ved å tilsette 25 μL av en 8% formaldehydløsning i PBS med 0,4% Triton X-100 og Hoechst 33342 i en konsentrasjon på 4 μg / ml (de endelige konsentrasjonene av individuelle reagenser er henholdsvis 4%, 0,2% og 2 μg / ml) (se materialtabell).
- Inkuber platen i mørket ved romtemperatur i 30 minutter.
7. Blokkering
- Skyll hver brønn fire ganger med 100 μL PBS. Etter siste vask, la 25 μL PBS ligge i brønnen.
- Tilsett 25 μL 6% BSA i PBS (den endelige BSA-konsentrasjonen er 3%) til hver brønn.
- Inkuber platen i mørket ved romtemperatur i 30 minutter.
8. Tilsetning av de primære antistoffene
- Aspirer BSA ved hjelp av en mikroplatevasker, og la 10 μL oppløsning ligge i brønnen.
- Tilsett 10 μL av den primære antistoffoppløsningen fremstilt i 3% BSA i PBS. Bruk anti-BrdU ved 0,8 μg/ml og anti-DNA ved 0,4 μg/ml (endelige konsentrasjoner av antistoffer er henholdsvis 0,4 μg/ml og 0,2 μg/ml) (se materialtabell).
- Inkuber platen i mørket ved 4 °C over natten.
9. Tilsetning av sekundære antistoffer
- Skyll hver brønn fire ganger med 100 μL PBS. Etter siste vask, la 10 μL PBS ligge i brønnen.
- Tilsett 10 μL av den 4 μg/ml sekundære antistoffoppløsningen fremstilt i 6 % BSA i PBS (den endelige konsentrasjonen er 2 μg/ml). Bruk isotypespesifikke antistoffer (anti-mus IgG1 og anti-mus IgM) konjugert til fluorokromer som Alexa Fluor 488 og Alexa Fluor 555 (se Materialfortegnelse).
- Inkuber platen i mørket ved romtemperatur i 1 time.
- Skyll hver brønn fire ganger med 100 μL PBS. Etter siste vask, la 50 μL PBS ligge i brønnen.
- Forsegl platen med en selvklebende folie (se materialfortegnelsen), og oppbevar den i mørket ved 4 °C. Avbildning må utføres innen 2 uker.
10. Bildebehandling
MERK: Avbildning må utføres med et automatisert bredfeltsmikroskop; Mikroskopet må være utstyrt med et motortrinn som leveres med kontroller for å avbilde individuelle områder av platen automatisk.
- Kontroller autofokusinnstillingene i hjørneområdene på platen (brønner A1, A24, P24, P1) og i midten.
MERK: For avbildning anbefales det å bruke et mål på 20x kort arbeidsavstand (se Materialfortegnelse) med høyest mulig numerisk blenderåpning. - Basert på intensitetshistogrammene som genereres av bildebehandlingsprogramvaren i live view-modus, velger du en tilstrekkelig lang eksponeringstid for de enkelte fluorescenskanalene slik at det resulterende bildet ikke blir overmettet.
- Angi riktig antall plan for avbildning på z-aksen.
MERK: Synsfeltet ved 20x forstørrelse er stort nok til at ikke alle cellene er i samme fokusplan, så z-seksjonering må utføres for å vise alle cellene i riktig fokusplan. Vanligvis er fem fly nok. Avhengig av tilgjengeligheten av diskplass, kan individuelle z-stakker eller bare projeksjoner med maksimal intensitet lagres. Bildeanalysen som vises i delen representative resultater er basert på projeksjoner for maksimal intensitet. - Velg riktig antall synsfelt som skal vises per brønn.
MERK: Avhengig av sammenløpet, kan omtrent 60-300 celler avbildes i ett synsfelt. Vanligvis, for HeLa-celler med en sammenløp på 60% -90%, vil avbildning av fem synsfelt tillate en å analysere fra 500 celler til over 1000 celler. - Velg brønnene som skal avbildes, og start avbildningen.
11. Kvantitativ bildeanalyse
MERK: Den kvantitative analysen av anskaffede bilder kan utføres ved hjelp av en åpen kildekode-programvare som Cell Profiler15. For denne studien ble analysen utført ved hjelp av programvaren ScanR 3.0.0 (se Materialfortegnelse).
- Start analysen ved å utføre bakgrunnskorrigering for alle bildene fra alle fluorescenskanalene. Avhengig av størrelsen på de analyserte objektene, velg riktig filterstørrelse: 80 piksler for cellekjerner og 4 piksler for BrdU- og mtDNA-flekker.
- Begynn å segmentere bildet ved å lage en maske av hovedobjektet basert på forholdet mellom intensiteten av fluorescenssignalet og bakgrunnen for kanalen som svarer til cellekjernene.
- Lag masker for underobjektene som representerer henholdsvis BrdU- og mtDNA-flekkene, ved hjelp av fluorescenskanalene som passer for de gitte strukturene.
MERK: Hvert underobjekt er tilordnet det nærmeste hovedobjektet (cellekjernen). - Angi parametrene som skal måles under analysen, og mål intensiteten til de individuelle bildepunktene i hver maske for alle fluorescenskanalene.
MERK: Det er også nødvendig å beregne antall underobjekter som er tildelt en gitt cellekjerne og arealet til hvert underobjekt. - Definer de avledede parametrene som skal beregnes basert på de oppnådde dataene. For å oppnå de totale fluorescensintensitetene for BrdU- eller mtDNA-kanalen, oppsummer intensiteten til alle underobjektene som er tildelt en gitt cellekjerne. For å oppnå gjennomsnittlig fluorescensintensitet, del den totale fluorescensintensiteten med summen av arealet av underobjektene som er tildelt en gitt cellekjerne.
MERK: For å sikre at det opprettede underobjektet (BrdU eller mtDNA-flekk) faktisk befinner seg i mitokondriene, er det nødvendig å portere dem basert på fluorescensintensiteten fra mitokondriesporingsfargestoffet. - Utfør ytterligere analyse av dataene som er oppnådd med ScanR-programvaren ved hjelp av R 4.2.2 statistisk programvare16 sammen med følgende pakker: dplyr 17, data.table 18, ggplot219 og ggpubr20. Dette trinnet er valgfritt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et skjema for prosedyren for høykapasitetsstudien av dynamikken i mtDNA-syntese og distribusjon er vist i figur 1. Bruken av et multibrønnsplateformat muliggjør samtidig analyse av mange forskjellige eksperimentelle forhold, for eksempel deaktivering av forskjellige gener ved hjelp av et siRNA-bibliotek. Betingelsene som brukes til merking av nylig syntetiserte DNA-molekyler med BrdU tillater påvisning av BrdU-merket DNA i mitokondriene av HeLa-celler (figur 2A), men kan også brukes som startbetingelser for å sette opp analysen for andre celletyper. Inkubasjonstiden med BrdU bør velges for individuelle cellelinjer på grunnlag av et tidsforløpseksperiment (tilleggsfigur 1). I denne studien ble HeLa-celler brukt, siden screening av siRNA krever celler som kan transfekteres med høy effektivitet. Det er viktig at signalet oppnådd med anti-BrdU-antistoffer er spesifikt, da det bare kan observeres i celler behandlet med BrdU (figur 2). Spesifisitetene til anti-BrdU og anti-DNA-merking ble ytterligere bekreftet ved bruk av rho0-celler som manglet mitokondrielt DNA21 (tilleggsfigur 2). I disse cellene, uavhengig av BrdU-behandling, ble det som forventet ikke påvist noe signal i mitokondriene både for anti-BrdU eller for anti-DNA-antistoffer (figur 2B). Kvantifisering av det fluorescerende signalet fra anti-BrdU-antistoffene indikerte at rho0-celler behandlet med BrdU viste det samme lave nivået av fluorescens som BrdU-ubehandlede celler, mens signalet for foreldrelinjene A549 og HeLa i gjennomsnitt var 50 ganger høyere (figur 2C).
For å vise nytten av metoden presentert her i studien av mitokondriell DNA-syntese og distribusjon, ble det utført et eksperiment der HeLa-celler ble behandlet med 2',3'-dideoksycytidin (ddC), en hemmer av mtDNA-syntese22, og ekspresjonen av gener kjent for å være essensielle for mtDNA-replikasjon ble brakt til taushet med siRNA (figur 3). Behandlingen av celler med ddC førte til fullstendig hemming av BrdU-inkorporering, mens siRNAene som ble brukt hadde varierende effekter. Nedreguleringen av Twinkle-helikasen (TWNK)23 førte til den mest potente hemmingen av BrdU-inkorporering; en svakere effekt ble observert for TFAM-proteinet24, mens inaktiveringen av mitokondriell DNA-polymerase gamma (POLG)25 førte til en moderat reduksjon i BrdU-inkorporering sammenlignet med celler behandlet med negativt kontroll-siRNA (figur 3A,B). Bruken av anti-DNA-antistoffer i prosedyren tillater overvåking av mtDNA-fordelingen i cellen under de gitte eksperimentelle forholdene. Nedreguleringen av TFAM førte til drastiske endringer i mtDNA-fordelingen; færre mtDNA-flekker ble påvist sammenlignet med kontrollceller, men de som var igjen hadde en svært høy fluorescensintensitet (figur 3A). Kvantifisering av gjennomsnittlig fluorescenssignal fra anti-DNA-antistoffet viste en flerfoldig økning ved TFAM-aktivering sammenlignet med de andre testede tilstandene (figur 3C).
Spesifisiteten til bilderesultatene ble verifisert ved å måle mtDNA- og genuttrykksnivåene ved hjelp av kvantitativ sanntids-PCR (qPCR) (figur 4). Metoden er beskrevet i detalj andre steder26. Behandling med ddC resulterte i en meget sterk reduksjon i nivåene av mtDNA; en svakere effekt ble observert ved TFAM- og TWNK-inaktivering, mens transfeksjon av celler med POLG siRNA hadde en svært beskjeden effekt på mtDNA-kopinummeret (figur 4A). Kvantifisering av TFAM- og TWNK-uttrykket bekreftet en effektiv reduksjon i uttrykket til ~ 15% -20% av kontrollnivåene, i motsetning til POLG, hvis uttrykk på mRNA-nivået ble redusert til 30% (figur 4B).
Figur 1: Skjematisk fremstilling av protokolltrinnene. Skalastengene for de mikroskopiske bildene er 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Spesifikk påvisning av BrdU-inkorporering i mtDNA av anti-BrdU-antistoffer. Eksempelbilder av (A) HeLa og (B) A549 og A549 rho0 celler utsatt for immunfluorescensfarging med anti-BrdU (grønn) og anti-DNA (rød) antistoffer. Cellene ble behandlet eller ikke behandlet med BrdU-oppløsningen. Nukleært DNA (blått) ble merket med Hoechst, og mitokondriene (cyan) ble visualisert med et mitokondriesporingsfargestoff. Et sammenslått bilde av alle fire fluorescenskanaler vises. Skalastangen representerer 10 μm. (C) Resultatet av kvantifiseringen av signalet fra anti-BrdU-antistoffene. Analysen ble utført for fire uavhengige biologiske replikater; hver gang ble 100 tilfeldig utvalgte celler analysert for hver eksperimentelle tilstand (N = 400 celler). I gjennomsnitt ble det påvist 18 BrdU-foci per celle. Boksene representerer første og tredje kvartil i interkvartilområdet (IQR), medianen er representert med en horisontal linje, værhårene definerer minimum og maksimum, og uteliggerne er definert som 1,5 x IQR. En Kruskal-Wallis statistisk test ble utført. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Utfall av hemming av mtDNA-syntese, inkludert reduksjon av effektiviteten av BrdU-inkorporering og påvirkning av fordelingen av nukleoider. (A) Eksempel på fluorescensbilder av HeLa-celler behandlet i 72 timer med ddC eller siRNA, som nedregulerer proteinene involvert i mtDNA-replikasjon. Cellene ble behandlet med BrdU i 16 timer før fiksering. Det nukleære DNA (blått) ble farget med Hoechst, anti-BrdU (grønn) og anti-DNA (rød) antistoffer ble brukt, og mitokondriene ble merket med et mitokondriesporingsfargestoff. Et sammenslått bilde av alle fire fluorescenskanaler vises. Skalastangen representerer 10 μm. (B,C) Kvantifisering av fluorescenssignalene fra (B) anti-BrdU og (C) anti-DNA-antistoffer. Analysen ble utført for fire uavhengige biologiske replikater; hver gang ble 650 tilfeldig utvalgte celler analysert for hver eksperimentelle tilstand (N = 2 600 celler). I gjennomsnitt ble det påvist 18 BrdU-foci og 46 mtDNA-foci per celle. Boksene representerer første og tredje kvartil i interkvartilområdet (IQR), medianen er representert med en horisontal linje, værhårene definerer minimum og maksimum, og uteliggerne er definert som 1,5 x IQR. En Kruskal-Wallis statistisk test ble utført. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Validering av effektiviteten av inhiberingen av mtDNA-syntese og effektiviteten av de testede siRNAene. HeLa-celler ble behandlet i 72 timer med ddC eller de angitte siRNAene og deretter utsatt for DNA- og RNA-isolasjon. (A) Resultater av mtDNA-nivåanalysen ved bruk av qPCR. (B) qPCR-analyse av genuttrykksendringer under de angitte forholdene. Stolpene representerer middelverdiene til fire uavhengige biologiske replikater; feilfeltene representerer SEM; en statistisk test fra ANOVA ble utført; Det ble utført t-test for parvis sammenlikning med Untr (ubehandlede) prøver. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Dynamikk av BrdU-inkorporering i mtDNA av HeLa-celler. Resultatene av et tidsløpseksperiment der cellene ble inkubert med 20 μM BrdU for en gitt tid er vist. Midlene til fire uavhengige replikater for hvert tidspunkt vises; 900 tilfeldig utvalgte celler ble analysert i hver replikasjon. Stolpene representerer midlene til fire replikater; Det ble utført en statistisk test av ANOVA. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Validering av A549 rho0-cellene. (A) Elektroforetisk analyse av qPCR-produktene fra amplifiserende DNA-fragmenter av mtDNA-kodede ND1 og nukleære DNA-kodede B2M-gener . Totalt DNA fra A549 eller A549 rho0 celler ble brukt som maler i reaksjonen. (B) Resultater av mtDNA-nivåanalysen ved bruk av qPCR. Stolpene representerer middelverdiene til fire uavhengige biologiske replikater; feilfeltene representerer SEM; Det ble utført en t-test. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Historisk har DNA-merking ved BrdU-inkorporering og antistoffdeteksjon blitt brukt i kjernefysisk DNA-replikasjon og cellesyklusforskning 14,27,28. Så langt har alle protokollene for å oppdage BrdU-merket DNA inkludert et DNA-denatureringstrinn (surt eller termisk) eller enzymfordøyelse (DNase eller proteinase) for å muliggjøre epitopeksponering og lette antistoffpenetrasjon. Disse protokollene ble utviklet for tettpakket kjernefysisk DNA. Imidlertid muliggjorde den forskjellige organiseringen av mtDNA utviklingen av en prosedyre uten denatureringstrinnet; Dette har forenklet prosedyren og gjort den mer egnet for applikasjoner med høy gjennomstrømning. Denne tilnærmingen har gitt gode resultater fordi utelatelse av denatureringstrinnet resulterer i deteksjon av BrdU-merket DNA bare utenfor kjernen (figur 2 og figur 3). Følgelig kan det sterke signalet fra nukleært DNA, som alltid er tilstede når et denatureringstrinn er inkludert, og som kan forårsake et alvorlig problem ved å maskere signalet fra BrdU-merket mtDNA29, unngås med denne protokollen. I tillegg sikrer mangelen på hard denaturering bedre bevaring av cellulære strukturer og påvirker ikke effektiviteten av farging ved fluorescerende flekker som Hoechst eller mitokondriesporingsfargestoff (figur 2 og figur 3).
Dynamikken i BrdU-innlemmelse i mtDNA er cellelinjeavhengig. Å gjøre et tidskurseksperiment på BrdU-innlemmelse anbefales når du bruker en ny cellelinje. Denne studien har etablert 16 timer som en optimal BrdU-inkubasjonstid for HeLa-cellelinjer. På grunn av den biologiske variasjonen i HeLa-linjer fra forskjellige laboratorier30, foreslås det imidlertid å utføre et BrdU-tidseksperiment på den spesielle HeLa-varianten man planlegger å jobbe med.
Kombinasjonen av anti-BrdU og anti-DNA-merking i denne protokollen muliggjør overvåking av mtDNA-syntese og samtidig studie av mtDNA-fordelingen i cellen. Dette kan ses svært godt i TFAM-lydløse celler (figur 3). Å redusere nivået av TFAM fører til en reduksjon i mtDNA-syntese (et redusert totalt anti-BrdU-signal) og til klynging av mitokondrielle nukleoider, noe som manifesteres av en betydelig økning i gjennomsnittlig mtDNA-fluorescenssignal (figur 3). Det skal bemerkes at i dette tilfellet er økningen i gjennomsnittlig mtDNA-fluorescensintensitet forårsaket av den endrede fordeling av mitokondrielle nukleoider og reflekterer ikke oppreguleringen av mtDNA-nivåer; Faktisk reduseres mtDNA-nivåene, som avslørt ved kvantitativ PCR-analyse (figur 4A). Overraskende resultater ble oppnådd for cellene transfeksjonert med POLG siRNA (figur 3). Man kunne forvente at transfeksjonen av celler med siRNA-målrettende POLG, som er den replikerende DNA-polymerasen i mitokondrier, ville redusere BrdU-innlemmelsen i mtDNA betydelig. I denne studien var imidlertid effekten på BrdU-inkorporering ubetydelig (figur 3), noe som ytterligere bekreftes ved å måle mtDNA-nivåene ved hjelp av qPCR (figur 4A). Den dårlige nedreguleringen av POLG-uttrykk kan forklare dette tilsynelatende motstridende resultatet ved transfeksjon av celler med det påførte siRNA (figur 4B). Dette fremhever en potensiell ulempe ved å bruke siRNA til funksjonelle studier og antyder at det er behov for validering av geninaktivering.
Samlet sett er det utviklet en analyse for å studere dynamikken i mtDNA-metabolisme i dyrkede celler som bruker et multibrønnplateformat og immunfluorescensavbildning for å oppdage og kvantifisere mtDNA-replikasjon, reparasjon og distribusjon. Metoden tillater samtidig studie av mange forskjellige eksperimentelle forhold. Det kan brukes til å undersøke effekten av ulike hemmere, cellulære påkjenninger og geninaktivering på mtDNA-metabolismen. Mens analysen har et høyt potensial for bruk i å studere mtDNA-metabolisme i forskjellige fysiologiske og patologiske sammenhenger, bør det bemerkes at analysen ikke tillater replikasjon og reparasjonsbundet mtDNA-syntese å skilles. Dette bør tas i betraktning ved tolkning av resultatene og planlegging av påfølgende funksjonelle eksperimenter. Spesielt har analysen ytterligere potensial for utvikling. For eksempel oppdages ikke replikasjonsinaktive (eller reparasjonsinaktive) mitokondrielle nukleoider med anti-BrdU-antistoffer. Derfor muliggjør anvendelsen av anti-DNA-antistoffer kvantifisering av mtDNA-tilstandsnivåene, antall replikasjonsstille nukleoider og fordelingen av nukleoider i cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Science Centre, Polen (Grant / Award Number: 2018/31/D/NZ2/03901).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284 (2019).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102 (2020).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
- Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579 (2020).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S.
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
- Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
- Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2021).
- Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021).
- Dowle, M., Srinivasan, A. data.table: Extension of `data.frame. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016).
- Kassambara, A. ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020).
- Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
- Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
- Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
- Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
- Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
- Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
- Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).
