Summary
Um procedimento para estudar a dinâmica do metabolismo do DNA mitocondrial (mtDNA) em células usando um formato de placa multi-poço e imagens automatizadas de imunofluorescência para detectar e quantificar a síntese e distribuição do mtDNA é descrito. Isso pode ser usado para investigar os efeitos de vários inibidores, estresses celulares e silenciamento gênico no metabolismo do mtDNA.
Abstract
A grande maioria dos processos celulares requer um fornecimento contínuo de energia, cujo portador mais comum é a molécula de ATP. As células eucarióticas produzem a maior parte de seu ATP nas mitocôndrias por fosforilação oxidativa. As mitocôndrias são organelas únicas porque têm seu próprio genoma que é replicado e transmitido para a próxima geração de células. Em contraste com o genoma nuclear, existem múltiplas cópias do genoma mitocondrial na célula. O estudo detalhado dos mecanismos responsáveis pela replicação, reparo e manutenção do genoma mitocondrial é essencial para a compreensão do bom funcionamento das mitocôndrias e das células inteiras em condições normais e de doença. Aqui, um método que permite a quantificação em alto rendimento da síntese e distribuição de DNA mitocondrial (mtDNA) em células humanas cultivadas in vitro é apresentado. Esta abordagem é baseada na detecção por imunofluorescência de moléculas de DNA ativamente sintetizadas marcadas pela incorporação de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) e na detecção concomitante de todas as moléculas de mtDNA com anticorpos anti-DNA. Além disso, as mitocôndrias são visualizadas com corantes ou anticorpos específicos. O cultivo de células em formato multipoço e o uso de um microscópio automatizado de fluorescência facilitam o estudo da dinâmica do mtDNA e da morfologia das mitocôndrias sob uma variedade de condições experimentais em um tempo relativamente curto.
Introduction
Para a maioria das células eucarióticas, as mitocôndrias são organelas essenciais, pois desempenham um papel crucial em inúmeros processos celulares. Em primeiro lugar, as mitocôndrias são os principais fornecedores de energia das células1. As mitocôndrias também estão envolvidas na regulação da homeostase celular (por exemplo, redoxintracelular 2 e balanço de cálcio3), sinalização celular4,5, apoptose6, síntese de diferentes compostos bioquímicos 7,8 e resposta imune inata9. A disfunção mitocondrial está associada a vários estados patológicos e doenças humanas10.
O funcionamento das mitocôndrias depende da informação genética localizada em dois genomas separados: o genoma nuclear e o genoma mitocondrial. O genoma mitocondrial codifica um pequeno número de genes em comparação com o genoma nuclear, mas todos os genes codificados pelo mtDNA são essenciais para a vida humana. A maquinaria de proteínas mitocondriais necessária para manter o mtDNA é codificada por nDNA. Os componentes básicos do replissoma mitocondrial, bem como alguns fatores da biogênese mitocondrial, já foram identificados (revisado em pesquisaanterior11,12). No entanto, os mecanismos de replicação e manutenção do DNA mitocondrial ainda estão longe de serem compreendidos. Em contraste com o nDNA, o genoma mitocondrial existe em múltiplas cópias, o que fornece uma camada adicional para regular a expressão gênica mitocondrial. Muito menos se sabe atualmente sobre a distribuição e segregação do mtDNA dentro de organelas, em que medida esses processos são regulados e, se são, quais proteínas estão envolvidas13. O padrão de segregação é crucial quando as células contêm uma população mista de mtDNA selvagem e mutado. Sua distribuição desigual pode levar à geração de células com uma quantidade prejudicial de mtDNA mutado.
Até o momento, os fatores proteicos necessários para a manutenção do mtDNA têm sido identificados principalmente por métodos bioquímicos, análises bioinformáticas ou estudos associados a doenças. Neste trabalho, a fim de garantir uma alta chance de identificar fatores que escaparam previamente à identificação, uma estratégia diferente é descrita. O método é baseado na marcação do mtDNA durante replicação ou reparo com 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU), um análogo nucleosídeo da timidina. O BrdU é prontamente incorporado em fitas de DNA nascentes durante a síntese de DNA e, em geral, é usado para monitorar a replicação do DNA nuclear14. No entanto, o procedimento aqui desenvolvido foi otimizado para detectar BrdU incorporado ao mtDNA usando a imunofluorescência de anticorpos anti-BrdU.
A abordagem permite a quantificação em alto rendimento da síntese e distribuição do mtDNA em células humanas cultivadas in vitro. Uma estratégia de alto rendimento é necessária para conduzir testes sob diferentes condições experimentais em um tempo relativamente curto; Portanto, propõe-se no protocolo a utilização de um formato multipoço para cultura celular e microscopia de fluorescência automatizada para obtenção de imagens. O protocolo inclui a transfecção de células HeLa humanas com uma biblioteca de siRNA e o monitoramento subsequente da replicação ou reparo do mtDNA usando a marcação metabólica do DNA recém-sintetizado com BrdU. Essa abordagem é combinada com a imunomarcação do DNA com a ajuda de anticorpos anti-DNA. Ambos os parâmetros são analisados por microscopia quantitativa de fluorescência. Além disso, as mitocôndrias são visualizadas com um corante específico. Para demonstrar a especificidade do protocolo, a coloração BrdU foi testada em células desprovidas de mtDNA (células rho0), em células HeLa após o silenciamento de fatores de manutenção bem conhecidos do mtDNA e em células HeLa após tratamento com um inibidor de replicação do mtDNA. Os níveis de mtDNA também foram medidos por um método independente, a qPCR.
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Protocol
1. Preparação da mistura de siRNA
- Um dia antes do início do experimento, as células de sementes (por exemplo, HeLa) em uma placa de 100 mm para que atinjam 70%-90% de confluência no dia seguinte.
NOTA: Todas as operações devem ser realizadas em condições estéreis em uma câmara de fluxo laminar. - Preparar a quantidade adequada de siRNA diluído a uma concentração de 140 nM em meio Opti-MEM (ver Tabela de Materiais). Uma placa de 96 poços pode ser usada como reservatório.
- Adicionar 5 μL da solução de siRNA (ou meio Opti-MEM para as amostras de controle) a cada poço de uma microplaca preta de cultura celular de 384 poços.
NOTA: Dependendo do número de amostras de siRNA testadas, uma pipeta eletrônica ou multicanal pode ser usada. - Preparar a quantidade adequada de solução reagente de transfecção RNAiMAX (ver Tabela de Materiais) em meio Opti-MEM. Adicionar 1 μL de RNAiMAX para cada 100 μL de meio.
- Adicionar 10 μL da solução reagente de transfecção a cada poço da placa de 384 poços. A maneira mais conveniente e rápida de fazer isso é com um dispensador de reagentes.
- Incubar o siRNA com o reagente de transfecção por 30 min à temperatura ambiente.
2. Preparação das células para transfecção
- Durante a incubação (passo 1.6), aspirar o meio com um dispositivo de sucção (ver Tabela de Materiais) e lavar as células com 3 ml de PBS.
- Adicionar 1,5 ml de tripsina diluída 1:2 em PBS e incubar as células a 37 °C durante 10 minutos.
- Verifique se as células se destacaram; em caso afirmativo, adicionar 3 mL de meio DMEM com FBS a 10%. Suspender completamente as células e transferi-las para um tubo de 15 mL. Tome pelo menos 150 μL da suspensão e conte as células numa câmara de contagem de células (ver Tabela de Materiais).
- Preparar uma suspensão celular na concentração apropriada (35.000/mL para a linha HeLa) em meio DMEM com SFB a 10%, penicilina e estreptomicina.
3. Transfecção celular
- Adicionar 20 μL da suspensão celular a cada poço da placa de 384 poços usando o dispensador de reagentes. Isso resultará em 700 células semeadas por poço.
- Incubar as células durante 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, colocá-las na incubadora durante 72 h (37 °C e 5% CO2).
4. Incorporação do BrdU
- Preparar uma solução de 90 μM de BrdU (ver Tabela de Materiais) em meio DMEM com FBS a 10%.
- Em 56 h após a transfecção do siRNA (16 h antes da fixação celular), adicionar 10 μL de solução de BrdU 90 μM a cada poço da placa de 384 poços (a concentração final de BrdU é de 20 μM).
OBS: A ação deve ser executada o mais rápido possível; Portanto, é melhor usar um dispensador de reagentes, pipeta eletrônica ou pipeta multidispensador. Lembre-se de preparar poços de controle sem a adição de BrdU. - Incubar as células durante 16 h (37 °C e 5% CO2).
5. Marcação de mitocôndrias
- Preparar uma solução de 20 μM de BrdU em DMEM com FBS a 10% e adicionar a solução corante de rastreamento de mitocôndrias (ver Tabela de Materiais) a uma concentração de 1,1 μM.
- Às 15 h após o início da incorporação de BrdU (1 h antes da fixação celular), adicione 10 μL da solução de corante rastreador de mitocôndrias (ver Tabela de Materiais) a cada poço da placa de 384 poços (a concentração final do corante é de 200 nM).
NOTA: Use um dispensador de reagentes, pipeta eletrônica ou pipeta multidispensador. Lembre-se de manter os poços de controle sem a adição de BrdU, mas com a adição do corante rastreador de mitocôndrias. - Incubar as células durante 1 h (37 °C e 5% CO2).
6. Fixação celular
NOTA: Toda a lavagem é mais convenientemente realizada usando uma lavadora de microplacas, enquanto a adição de reagentes é realizada mais rapidamente usando um dispensador de reagentes.
- Usando a lavadora de microplacas (ver Tabela de Materiais), enxágue cada poço duas vezes com 100 μL de PBS. Após a segunda lavagem, deixar 25 μL de PBS no poço.
NOTA: Deixar PBS no poço reduz a probabilidade de desprendimento celular durante a adição de líquido na próxima etapa. Todas as lavagens são concluídas com o PBS deixado; portanto, a solução adicionada na próxima etapa deve ser sempre preparada em uma concentração de 2x, pois será adicionada em um volume igual ao PBS restante. - Corrigir as células adicionando 25 μL de uma solução de formaldeído a 8% em PBS com Triton X-100 a 0,4% e Hoechst 33342 a uma concentração de 4 μg/mL (as concentrações finais de reagentes individuais são de 4%, 0,2% e 2 μg/mL, respectivamente) (ver Tabela de Materiais).
- Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 30 minutos.
7. Bloqueio
- Enxaguar cada poço quatro vezes com 100 μL de PBS. Após a última lavagem, deixar 25 μL de PBS no poço.
- Adicionar 25 μL de BSA a 6% em PBS (a concentração final de BSA é de 3%) a cada poço.
- Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 30 minutos.
8. Adição dos anticorpos primários
- Aspirar a BSA usando uma arruela de microplacas e deixar 10 μL de solução no poço.
- Adicionar 10 μL da solução de anticorpos primários preparada em BSA a 3% em PBS. Use anti-BrdU a 0,8 μg/mL e anti-DNA a 0,4 μg/mL (as concentrações finais de anticorpos são 0,4 μg/mL e 0,2 μg/mL, respectivamente) (ver Tabela de Materiais).
- Incubar a placa no escuro a 4 °C durante a noite.
9. Adição dos anticorpos secundários
- Enxaguar cada poço quatro vezes com 100 μL de PBS. Após a última lavagem, deixe 10 μL de PBS no poço.
- Adicionar 10 μL da solução de anticorpos secundários de 4 μg/mL preparada em BSA a 6% em PBS (a concentração final é de 2 μg/mL). Use anticorpos isotipo-específicos (IgG1 anti-camundongo e IgM anti-camundongo) conjugados a fluorocromos como Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 555 (consulte a Tabela de Materiais).
- Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 1 h.
- Enxaguar cada poço quatro vezes com 100 μL de PBS. Após a última lavagem, deixe 50 μL de PBS no poço.
- Selar a placa com uma película de vedação adesiva (ver Tabela de Materiais) e guardá-la no escuro a 4 °C. Os exames de imagem devem ser realizados dentro de 2 semanas.
10. Exames por imagem
NOTA: As imagens devem ser realizadas com um microscópio de campo largo automatizado; O microscópio deve estar equipado com um estágio motor fornecido com comandos para obter imagens automáticas de áreas individuais da placa.
- Verifique as configurações de foco automático nas áreas de canto da placa (poços A1, A24, P24, P1) e no centro.
NOTA: Para aquisição de imagens, recomenda-se o uso de uma objetiva de curta distância de trabalho de 20x (consulte Tabela de Materiais) com a maior abertura numérica possível. - Com base nos histogramas de intensidade gerados pelo software de imagem no modo de visualização ao vivo, selecione um tempo de exposição suficientemente longo para os canais de fluorescência individuais para que a imagem resultante não fique saturada demais.
- Defina o número apropriado de planos para geração de imagens no eixo z.
Observação : o campo de visão em ampliação de 20x é grande o suficiente para que nem todas as células estão no mesmo plano de foco, portanto, z-seccionamento deve ser executado para exibir todas as células em seu plano correto de foco. Normalmente, cinco aviões são suficientes. Dependendo da disponibilidade de espaço em disco, z-stacks individuais ou apenas projeções de intensidade máxima podem ser salvas. A análise das imagens mostradas na seção de resultados representativos é baseada em projeções de intensidade máxima. - Selecione o número apropriado de campos de exibição a serem exibidos por poço.
Observação : dependendo da confluência, aproximadamente 60-300 células podem ser imageadas em um campo de visão. Normalmente, para células HeLa com uma confluência de 60%-90%, a obtenção de imagens de cinco campos de visão permitirá analisar de 500 células a mais de 1.000 células. - Selecione os poços a serem fotografados e inicie a geração de imagens.
11. Análise quantitativa de imagens
NOTA: A análise quantitativa das imagens adquiridas pode ser realizada utilizando um software de código aberto como o Cell Profiler15. Para o presente estudo, a análise foi realizada utilizando-se o software ScanR 3.0.0 (vide Tabela de Materiais).
- Inicie a análise realizando a correção de fundo para todas as imagens de todos os canais de fluorescência. Dependendo do tamanho dos objetos analisados, selecione o tamanho apropriado do filtro: 80 pixels para núcleos celulares e 4 pixels para pontos de BrdU e mtDNA.
- Comece a segmentar a imagem criando uma máscara do objeto principal com base na razão entre a intensidade do sinal de fluorescência e o fundo do canal correspondente aos núcleos celulares.
- Crie máscaras para os sub-objetos que representam os pontos BrdU e mtDNA, respectivamente, usando os canais de fluorescência apropriados para as estruturas dadas.
Observação : cada sub-objeto é atribuído ao objeto principal mais próximo (núcleo da célula). - Defina os parâmetros a serem medidos durante a análise e meça a intensidade dos pixels individuais dentro de cada máscara para todos os canais de fluorescência.
NOTA: Também é necessário calcular o número de sub-objetos atribuídos a um determinado núcleo celular e a área de cada sub-objeto. - Defina os parâmetros derivados a serem calculados com base nos dados obtidos. Para obter as intensidades totais de fluorescência para o canal BrdU ou mtDNA, somar as intensidades de todos os sub-objetos atribuídos a um dado núcleo celular. Para obter a intensidade média de fluorescência, divida a intensidade total de fluorescência pela soma da área dos subobjetos atribuídos a um dado núcleo celular.
NOTA: Para garantir que o sub-objeto criado (BrdU ou ponto de mtDNA) esteja realmente localizado nas mitocôndrias, é necessário portá-las com base na intensidade de fluorescência do corante de rastreamento de mitocôndrias. - Realizar uma análise mais aprofundada dos dados obtidos com o software ScanR utilizando o software estatístico R 4.2.216 juntamente com os seguintes pacotes: dplyr 17, data.table 18, ggplot219 e ggpubr20. Esta etapa é opcional.
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Representative Results
Um esquema do procedimento para o estudo de alto rendimento da dinâmica da síntese e distribuição do mtDNA é mostrado na Figura 1. O uso de um formato de placa multipoço permite a análise simultânea de muitas condições experimentais diferentes, como o silenciamento de diferentes genes usando uma biblioteca de siRNAs. As condições usadas para a marcação de moléculas de DNA recém-sintetizadas com BrdU permitem a detecção de DNA marcado com BrdU nas mitocôndrias de células HeLa (Figura 2A), mas também podem ser usadas como condições iniciais para a montagem do ensaio para outros tipos celulares. O tempo de incubação com BrdU deve ser selecionado para linhagens celulares individuais com base em um experimento de curso temporal (Figura 1 Suplementar). No presente estudo, células HeLa foram utilizadas, uma vez que a triagem de siRNAs requer células que possam ser transfectadas com alta eficiência. É importante ressaltar que o sinal obtido com anticorpos anti-BrdU é específico, pois só pode ser observado em células tratadas com BrdU (Figura 2). As especificidades da marcação anti-BrdU e anti-DNA foram confirmadas usando células rho0 sem DNA mitocondrial21 (Figura 2 suplementar). Como esperado, nessas células, independentemente do tratamento com BrdU, nenhum sinal foi detectado nas mitocôndrias tanto para anticorpos anti-BrdU quanto para anticorpos anti-DNA (Figura 2B). A quantificação do sinal fluorescente dos anticorpos anti-BrdU indicou que as células rho0 tratadas com BrdU apresentaram o mesmo baixo nível de fluorescência que as células não tratadas com BrdU, enquanto o sinal para as linhagens parentais A549 e HeLa foi, em média, 50 vezes maior (Figura 2C).
A fim de mostrar a utilidade do método aqui apresentado no estudo da síntese e distribuição do DNA mitocondrial, foi conduzido um experimento no qual células HeLa foram tratadas com 2′,3′-dideoxicitidina (ddC), um inibidor da síntese do mtDNA22, e a expressão de genes sabidamente essenciais para a replicação do mtDNA foi silenciada com siRNA (Figura 3). O tratamento das células com ddC levou à inibição completa da incorporação de BrdU, enquanto os siRNAs utilizados tiveram efeitos variados. O downregulation da helicase de Twinkle (TWNK)23 levou à mais potente inibição da incorporação de BrdU; um efeito mais fraco foi observado para a proteína TFAM24, enquanto o silenciamento da gama da DNA polimerase mitocondrial (POLG)25 levou a uma diminuição moderada na incorporação de BrdU em comparação com células tratadas com siRNA de controle negativo (Figura 3A,B). O uso de anticorpos anti-DNA no procedimento permite o monitoramento da distribuição do mtDNA na célula sob as condições experimentais dadas. A regulação negativa da TFAM levou a mudanças drásticas na distribuição do mtDNA; menos manchas de mtDNA foram detectadas em comparação com as células controle, mas as que permaneceram tiveram uma intensidade de fluorescência muito alta (Figura 3A). A quantificação do sinal médio de fluorescência do anticorpo anti-DNA mostrou um aumento de várias vezes após o silenciamento da TFAM em comparação com as outras condições testadas (Figura 3C).
A especificidade dos resultados de imagem foi verificada medindo-se os níveis de mtDNA e expressão gênica com o auxílio da PCR quantitativa em tempo real (qPCR) (Figura 4). O método foi descrito em detalhes em outra publicação26. O tratamento com ddC resultou em uma diminuição muito forte nos níveis de mtDNA; um efeito mais fraco foi observado no caso de silenciamento de TFAM e TWNK, enquanto a transfecção de células com siRNA de POLG teve um efeito muito modesto no número de cópias do mtDNA (Figura 4A). A quantificação da expressão de TFAM e TWNK confirmou uma redução eficiente em sua expressão para ~15%-20% dos níveis de controle, em contraste com a POLG, cuja expressão no nível de RNAm foi reduzida para 30% (Figura 4B).
Figura 1: Representação esquemática das etapas do protocolo. As barras de escala para as imagens microscópicas são de 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Detecção específica da incorporação de BrdU ao mtDNA por anticorpos anti-BrdU. Imagens de amostras de células (A) HeLa e (B) A549 e A549 rho0 submetidas à coloração de imunofluorescência com anticorpos anti-BrdU (verde) e anti-DNA (vermelho). As células foram tratadas ou não com a solução de BrdU. O DNA nuclear (azul) foi marcado com Hoechst, e as mitocôndrias (ciano) foram visualizadas com um corante rastreador de mitocôndrias. Uma imagem mesclada de todos os quatro canais de fluorescência é mostrada. A barra de escala representa 10 μm. (C) O resultado da quantificação do sinal dos anticorpos anti-BrdU. A análise foi realizada para quatro réplicas biológicas independentes; cada vez, 100 células selecionadas aleatoriamente foram analisadas para cada condição experimental (N = 400 células). Em média, 18 focos de BrdU foram detectados por célula. As caixas representam o primeiro e o terceiro quartis do intervalo interquartil (IIQ), a mediana é representada por uma linha horizontal, os bigodes definem o mínimo e o máximo, e os outliers são definidos como 1,5 x IIQ. Foi realizado o teste estatístico de Kruskal-Wallis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados da inibição da síntese de mtDNA, incluindo a redução da eficiência da incorporação de BrdU e afetando a distribuição de nucleóides. (A) Imagens de fluorescência de amostras de células HeLa tratadas por 72 h com ddC ou siRNA, que regulam negativamente as proteínas envolvidas na replicação do mtDNA. As células foram tratadas com BrdU por 16 h antes da fixação. O DNA nuclear (azul) foi corado com Hoechst, anticorpos anti-BrdU (verde) e anti-DNA (vermelho) foram usados, e as mitocôndrias foram marcadas com um corante rastreador de mitocôndrias. Uma imagem mesclada de todos os quatro canais de fluorescência é mostrada. A barra de escala representa 10 μm. (B,C) Quantificação dos sinais de fluorescência de (B) anticorpos anti-BrdU e (C) anti-DNA. A análise foi realizada para quatro réplicas biológicas independentes; de cada vez, 650 células selecionadas aleatoriamente foram analisadas para cada condição experimental (N = 2.600 células). Em média, 18 focos de BrdU e 46 focos de mtDNA foram detectados por célula. As caixas representam o primeiro e o terceiro quartis do intervalo interquartil (IIQ), a mediana é representada por uma linha horizontal, os bigodes definem o mínimo e o máximo, e os outliers são definidos como 1,5 x IIQ. Foi realizado o teste estatístico de Kruskal-Wallis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Validação da eficiência da inibição da síntese de mtDNA e da eficácia dos siRNAs testados. As células HeLa foram tratadas por 72 h com ddC ou os siRNAs indicados e, em seguida, submetidas ao isolamento de DNA e RNA. (A) Resultados da análise do nível de mtDNA usando qPCR. (B) análise por qPCR de alterações na expressão gênica nas condições indicadas. As barras representam os valores médios de quatro réplicas biológicas independentes; as barras de erro representam o MEV; foi realizado teste estatístico ANOVA; um teste t foi realizado para comparação pareada com amostras Untr (não tratadas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Dinâmica de incorporação de BrdU ao mtDNA de células HeLa. Os resultados de um experimento de curso de tempo em que as células foram incubadas com 20 μM BrdU por um determinado tempo são mostrados. As médias de quatro réplicas independentes para cada ponto de tempo são mostradas; Foram analisadas 900 células selecionadas aleatoriamente em cada repetição. As barras representam a média de quatro réplicas; foi realizado teste estatístico ANOVA. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 2: Validação das células A549 rho0. (A) Análise eletroforética dos produtos da qPCR a partir da amplificação de fragmentos de DNA dos genes ND1 codificado por mtDNA e B2M codificado por DNA nuclear. DNA total de células A549 ou A549 rho0 foi usado como molde na reação. (B) Resultados da análise do nível de mtDNA usando qPCR. As barras representam os valores médios de quatro réplicas biológicas independentes; as barras de erro representam o MEV; Foi realizado o teste t. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Historicamente, a marcação de DNA por incorporação de BrdU e detecção de anticorpos tem sido utilizada na replicação de DNA nuclear e na pesquisa do ciclo celular 14,27,28. Até agora, todos os protocolos para detecção de DNA marcado com BrdU incluíram uma etapa de desnaturação do DNA (ácida ou térmica) ou digestão enzimática (DNase ou proteinase) para permitir a exposição de epítopos e facilitar a penetração de anticorpos. Esses protocolos foram desenvolvidos para DNA nuclear fortemente compactado. No entanto, a organização diferente do mtDNA possibilitou o desenvolvimento de um procedimento sem a etapa de desnaturação; Isso simplificou o procedimento e o tornou mais adequado para aplicações de alto rendimento. Essa abordagem tem trazido excelentes resultados, pois a omissão da etapa de desnaturação resulta na detecção de DNA marcado com BrdU apenas fora do núcleo (Figura 2 e Figura 3). Consequentemente, o forte sinal do DNA nuclear, que está sempre presente quando uma etapa de desnaturação é incluída e que pode causar um problema grave ao mascarar o sinal do mtDNA29 marcado com BrdU, pode ser evitado com este protocolo. Além disso, a falta de desnaturação severa garante melhor preservação das estruturas celulares e não afeta a eficiência da coloração por colorações fluorescentes como Hoechst ou corante rastreador de mitocôndrias (Figura 2 e Figura 3).
A dinâmica da incorporação do BrdU ao mtDNA é dependente da linhagem celular. Recomenda-se fazer um experimento de curso de tempo sobre a incorporação de BrdU sempre que se usar uma nova linhagem celular. Este estudo estabeleceu 16 h como um tempo ótimo de incubação BrdU para linhagens celulares HeLa. No entanto, devido à variação biológica nas linhagens HeLa de diferentes laboratórios30, sugere-se a realização de um experimento de curso temporal BrdU na variante HeLa particular com a qual se planeja trabalhar.
A combinação de marcação anti-BrdU e anti-DNA neste protocolo permite o monitoramento da síntese de mtDNA e o estudo simultâneo da distribuição do mtDNA na célula. Isso pode ser visto muito bem em células silenciadas por TFAM (Figura 3). A diminuição do nível de TFAM leva a uma redução na síntese de mtDNA (uma diminuição do sinal anti-BrdU total) e ao agrupamento de nucleoides mitocondriais, que se manifesta por um aumento substancial no sinal médio de fluorescência do mtDNA (Figura 3). Deve-se notar que, neste caso, o aumento na intensidade média de fluorescência do mtDNA é causado pela distribuição alterada dos nucleoides mitocondriais e não reflete a regulação positiva dos níveis de mtDNA; de fato, os níveis de mtDNA estão reduzidos, como revelado pela análise quantitativa por PCR (Figura 4A). Resultados surpreendentes foram obtidos para as células transfectadas com siRNA da POLG (Figura 3). Poder-se-ia esperar que a transfecção de células com POLG direcionada a siRNA, que é a DNA polimerase replicativa em mitocôndrias, reduziria significativamente a incorporação de BrdU ao mtDNA. No entanto, neste estudo, o efeito sobre a incorporação de BrdU foi desprezível (Figura 3), como confirmado pela medição dos níveis de mtDNA usando qPCR (Figura 4A). A fraca regulação negativa da expressão de POLG pode explicar esse resultado aparentemente contraditório na transfecção das células com o siRNA aplicado (Figura 4B). Isso destaca uma desvantagem potencial do uso de siRNA para estudos funcionais e sugere que há uma necessidade de validação de silenciamento gênico.
Em geral, foi desenvolvido um ensaio para estudar a dinâmica do metabolismo do mtDNA em células cultivadas que usa um formato de placa multipoço e imagens de imunofluorescência para detectar e quantificar a replicação, reparo e distribuição do mtDNA. O método permite o estudo simultâneo de muitas condições experimentais diferentes. Ele pode ser usado para investigar os efeitos de vários inibidores, estresses celulares e silenciamento gênico no metabolismo do mtDNA. Embora o ensaio tenha um alto potencial para uso no estudo do metabolismo do mtDNA em vários contextos fisiológicos e patológicos, deve-se notar que o ensaio não permite distinguir a replicação e a síntese de mtDNA ligado ao reparo. Isso deve ser considerado ao interpretar os resultados e planejar experimentos funcionais subsequentes. Notavelmente, o ensaio tem mais potencial de desenvolvimento. Por exemplo, nucleoides mitocondriais inativos de replicação (ou inativos de reparo) não são detectados com anticorpos anti-BrdU. Portanto, a aplicação de anticorpos anti-DNA permite a quantificação dos níveis de estado do mtDNA, o número de nucleoides silenciosos à replicação e a distribuição de nucleoides na célula.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciência, Polônia (Grant/Award Number: 2018/31/D/NZ2/03901).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
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