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Genetics

3 सी के साथ ए प्राप्त करना: अंडरग्रेजुएट्स के लिए क्रोमोसोम अनुरूपता कैप्चर।

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65213
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, 1,2
1Department of Biological and Biomedical Sciences, Bryant University, 2Center of Health and Behavioral Sciences, Bryant University
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम स्नातक भागीदारी और सीखने पर जोर देने के साथ क्रोमोसोम रचना कैप्चर (3 सी) तकनीक का एक अनुकूलन प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

क्रोमोसोम रचना कैप्चर (3 सी) एक शक्तिशाली उपकरण है जिसने समान तकनीकों (जैसे, हाई-सी, 4 सी, और 5 सी, जिसे यहां 3 सी तकनीकों के रूप में संदर्भित किया गया है) के एक परिवार को जन्म दिया है जो क्रोमैटिन के त्रि-आयामी संगठन की विस्तृत जानकारी प्रदान करते हैं। 3 सी तकनीकों का उपयोग अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला में किया गया है, कैंसर कोशिकाओं में क्रोमैटिन संगठन में परिवर्तन की निगरानी से लेकर जीन प्रमोटरों के साथ किए गए एन्हांसर संपर्कों की पहचान करने तक। जबकि इन तकनीकों का उपयोग करने वाले कई अध्ययन जटिल नमूना प्रकारों (यानी, एकल-कोशिका विश्लेषण) के साथ बड़े जीनोम-व्यापी प्रश्न पूछ रहे हैं, अक्सर जो खो जाता है वह यह है कि 3 सी तकनीक बुनियादी आणविक जीव विज्ञान विधियों में आधारित हैं जो अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होते हैं। क्रोमैटिन संगठन के कसकर केंद्रित प्रश्नों को संबोधित करके, इस अत्याधुनिक तकनीक का उपयोग स्नातक अनुसंधान और शिक्षण प्रयोगशाला अनुभव को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। यह पेपर एक 3 सी प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है और स्नातक अनुसंधान और शिक्षण अनुभवों में मुख्य रूप से स्नातक संस्थानों में कार्यान्वयन के लिए अनुकूलन और जोर के बिंदु प्रदान करता है।

Introduction

एक जीव का जीनोम न केवल कार्य के लिए आवश्यक सभी जीनों को रखता है, बल्कि उनका उपयोग कैसे और कब करना है, इस पर सभी निर्देश भी रखता है। यह जीनोम तक पहुंच को विनियमित करना सेल के सबसे महत्वपूर्ण कार्यों में से एक बनाता है। जीन फ़ंक्शन को नियंत्रित करने के लिए कई तंत्र हैं; हालांकि, इसके आधार स्तर पर, जीन विनियमन नियामक प्रतिलेखन कारकों (ट्रांस-कारकों) की क्षमता को उनके विशिष्ट डीएनए अनुक्रमों (सीआईएस-नियामक अनुक्रमों) से बांधने की क्षमता तक आता है। यह एक जन्मजात क्षमता नहीं है; इसके बजाय, यह नाभिक में जीनोम के संगठन / संरचना द्वारा नियंत्रित होता है, जो ट्रांस-फैक्टर 1,2,3 के लिए सीआईएस-नियामक अनुक्रमों की उपलब्धता / जोखिम को नियंत्रित करता है। यदि ट्रांस-कारक अपने सीआईएस-नियामक अनुक्रमों को नहीं पा सकते हैं, तो ट्रांस-कारक अपने नियामक कार्यों को नहीं कर सकते हैं। इसने यह समझने को बनाया है कि नाभिक में जीनोम कैसे व्यवस्थित होते हैं, जांच का एक महत्वपूर्ण स्रोत है।

यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि इंटरफेज़ के दौरान, नाभिक में यूकेरियोटिक गुणसूत्र परमाणु लैमिना और परमाणु मैट्रिक्स (चित्रा 1) से जुड़े अपने स्वयं के डोमेन पर कब्जा कर लेते हैं, इस प्रकार क्रोमोसोम को स्पेगेटी की प्लेट पर नूडल के बजाय पिज्जा के टुकड़े की तरह बनाते हैं। क्रोमोसोम आंशिक रूप से प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन (क्रोमैटिन) द्वारा संघनित होते हैं जो क्रोमोसोम के कुछ हिस्सों को मोड़ते हैं और लूप करते हैं। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, तीन आयामी डीएनए फ्लोरेसेंस इन सीटू संकरण (फिश), और डीएनए टैगिंग तकनीकों (यानी, फ्लोरोसेंट और कृत्रिम डीएनए मिथाइलेशन) के माध्यम से, क्रोमैटिन के निष्क्रिय डोमेन को परमाणु परिधि 4,5,6 के साथ कसकर पैक किया गया है, जबकि नाभिक के इंटीरियर में सक्रिय, कम संघनित क्रोमैटिन के हिस्सेपाए जाते हैं। 10. ये प्रयोग क्रोमोसोम गतिशीलता का एक व्यापक कोण दृश्य प्रदान करते हैं, लेकिन DNase 11,12 और न्यूक्लियोसोम 13,14,15 अध्ययनों में देखे गए जीन प्रोमोटर्स के आसपास स्थानीय रूप से होने वाले परिवर्तनों को पकड़ने के लिए बहुत कम हैं।

उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रोमैटिन गतिशीलता को अनलॉक करने की कुंजी 3 डी क्रोमोसोम मैपिंग तकनीक, 3 सी का निर्माण था। 3 सी तकनीक में स्वयं चार मुख्य चरण शामिल हैं: क्रोमैटिन का क्रॉसलिंकिंग, प्रतिबंध एंजाइमों द्वारा क्रोमैटिन पाचन, क्रोमैटिन बंधाव और डीएनए शुद्धिकरण (चित्रा 2)। इस प्रक्रिया द्वारा उत्पन्न नए कृत्रिम डीएनए टुकड़ों को तब डीएनए16 के रैखिक रूप से दूर के टुकड़ों के बीच घनिष्ठ भौतिक संबंध को प्रकट करने की विशेषता हो सकती है। 3 सी तकनीक कई स्पिन-ऑफ तकनीकों के निर्माण का आधार बन गई जो व्यापक जीनोम-वाइड प्रश्न (जैसे, हाई-सी, 4 सी, सीएचआईपी-सी) पूछने के लिए 3 सी के प्रारंभिक चरणों का उपयोग करती है। 3 सी तकनीकों के इस परिवार ने पहचान की है कि गुणसूत्रों को कई असतत इकाइयों में व्यवस्थित किया जाता है जिन्हें टोपोलॉजिकल रूप से जुड़े डोमेन (टीएडी) कहा जाता है। टीएडी जीनोम में एन्कोड किए गए हैं और क्रोमैटिन लूप द्वारा परिभाषित किए जाते हैं जो अनलूप ्ड सीमाओं16,17,18,19 से घिरे होते हैं। टीएडी सीमाओं को दो क्रमिक रूप से संरक्षित और सर्वव्यापी कारकों द्वारा बनाए रखा जाता है, जिसमें सीसीसीटी बाइंडिंग फैक्टर (सीटीसीएफ) और सामंजस्य शामिल हैं, जो अलग-अलग टीएडी के भीतर लूप को16,20 से बातचीत करने से रोकते हैं। लूप को उनके नियामक अनुक्रमों के साथ-साथ सीटीसीएफऔर सामंजस्य 21 के साथ ट्रांस-कारकों की बातचीत द्वारा मध्यस्थ किया जाता है।

हालांकि 3 सी प्रौद्योगिकियों का उपयोग करने वाले कई अध्ययन व्यापक जीनोम-व्यापक प्रश्न पूछते हैं और जटिल नमूना संग्रह तकनीकों को नियोजित करते हैं, 3 सी तकनीक का निर्माण बुनियादी आणविक जीव विज्ञान तकनीकों पर आधारित है। यह स्नातक अनुसंधान और शिक्षण प्रयोगशालाओं दोनों में तैनाती के लिए 3 सी पेचीदा बनाता है। 3 सी तकनीक को छोटे केंद्रित प्रश्नों के लिए नियोजित किया जा सकता है और पूछे गए प्रश्नों के फोकस और दिशा के आधार पर ऊपर या नीचे (एकल जीन22, क्रोमोसोम16, और / या जीनोम18) स्केलिंग के लिए स्वाभाविक रूप से लचीला है। इस तकनीक को मॉडल सिस्टम 7,16,19,23 की एक विस्तृत श्रृंखला पर भी लागू किया गया है और इसके उपयोग में बहुमुखी साबित हुआ है। यह 3 सी को अंडरग्रेजुएट्स के लिए एक उत्कृष्ट तकनीक बनाता है जिसमें छात्र सामान्य आणविक जीव विज्ञान तकनीकों में अनुभव प्राप्त कर सकते हैं, जबकि निर्देशित प्रश्नों के उत्तर देने में मूल्यवान अनुभव भी प्राप्त कर सकते हैं।

यहां प्रस्तुत पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल24,25,26,27 के आधार पर 3 सी लाइब्रेरी तैयारी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है। इस प्रोटोकॉल को लगभग 1 × 107 कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है, हालांकि इसने 1 × 105 कोशिकाओं के साथ 3 सी पुस्तकालय उत्पन्न किए हैं। यह प्रोटोकॉल बहुमुखी साबित हुआ है और इसका उपयोग ज़ेबराफ़िश भ्रूण, ज़ेबराफ़िश सेल लाइनों और युवा-वयस्क (वाईए) केनोरहाब्डिस एलिगेंस (राउंडवर्म) से 3 सी पुस्तकालयों को उत्पन्न करने के लिए किया गया है। प्रोटोकॉल स्तनधारी सेल लाइनों और, आगे अनुकूलन के साथ, खमीर के लिए भी उपयुक्त होना चाहिए।

इन अनुकूलन का लक्ष्य अंडरग्रेजुएट्स के लिए 3 सी को अधिक सुलभ बनाना है। उन तकनीकों का उपयोग करने के लिए सावधानी बरती गई है जो उन तकनीकों के समान हैं जिन्हें स्नातक शिक्षण प्रयोगशाला में पूरा किया जा सकता है। 3 सी तकनीक स्नातक के लिए बुनियादी आणविक जीव विज्ञान तकनीकों को सीखने के लिए कई सीखने के अवसर प्रदान करती है जो स्नातक स्तर की पढ़ाई के बाद बेंच पर, कक्षा में और उनके प्रयासों में उनके विकास को लाभान्वित करेगी।

Protocol

1. प्राइमर डिजाइन

नोट: 3 सी प्राइमर डिजाइन उपकरण ऑनलाइन उपलब्ध हैं28. वैकल्पिक रूप से, कस्टम प्राइमरों को छात्रों द्वारा डिज़ाइन किया जा सकता है (नीचे देखें)।

  1. प्राइमर स्थानों की पहचान
    1. यूसीएससी जीनोम ब्राउज़र (http://genome.ucsc.edu/) खोलें, अध्ययन के जीव का चयन करें, और 3 सी का उपयोग करके मूल्यांकन किए जाने वाले जीनोम के क्षेत्र की खोज करें।
    2. अगली विंडो में, रेस्टर एंजाइम पर क्लिक करके ब्राउज़र के नीचे मैपिंग और अनुक्रमण टैब में एंजाइम ट्रैक को सक्रिय करें।
    3. उपयोग किए जाने वाले प्रतिबंध एंजाइम (ओं) को दर्ज करें, और प्रदर्शन मोड को पैक करने के लिए सेट करें। सबमिट पर क्लिक करें।
    4. भिन्नता और दोहराव में, सुनिश्चित करें कि रिपीटमास्कर घने होने के लिए सेट है।
    5. गाइड के रूप में प्रतिबंध साइटों का उपयोग करके, नकाबपोश दोहराए जाने वाले क्षेत्रों (ब्लैक बार) के भीतर रुचि की साइटों की पहचान करें। स्थिति (सबसे ऊपरी ट्रैक ) पर क्लिक करके और वांछित लंबाई (~ 600 बीपी) पर खींचकर प्रतिबंध स्थल के आसपास के अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम अनुक्रम दोनों को फ्लैंक करने वाले 300 बेस जोड़े (बीपी) को हाइलाइट करें।
    6. माउस छोड़ें, और एक पॉप-अप बॉक्स दिखाई देगा। जीनोमिक स्थान पर ध्यान दें, ज़ूम इन पर क्लिक करें, और ब्राउज़र को चयन के लिए रीजस्ट करने दें।
    7. ऊपरी ब्राउज़र रिबन पर दृश्य टैब पर माउस को घुमाएं, और ड्रॉप-डाउन मेनू में, डीएनए का चयन करें।
    8. डिफ़ॉल्ट विकल्प छोड़ दें, नकाबपोश अनुक्रमों के पदनाम पर ध्यान दें (उन्हें एन बनाने का विकल्प है)। डीएनए प्राप्त करें पर क्लिक करें।
    9. हाइलाइट किया गया अनुक्रम तब विंडो में प्रदर्शित किया जाएगा। इस अनुक्रम को प्राइमर 3 (https://primer3.ut.ee/) में कॉपी और पेस्ट करें।
    10. प्राइमर 3 डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग करके, पिक प्राइमर पर क्लिक करके प्राइमर उत्पन्न करें।
    11. परिणामों में, प्रतिबंध एंजाइम के स्थान पर ध्यान दें, और प्राइमरों का चयन करें जो बीच में स्थित प्रतिबंध साइट के साथ 200-500 बीपी पीसीआर उत्पाद बनाते हैं।
    12. इन चरणों का पालन करते हुए, डिज़ाइन परीक्षण प्राइमर 1 किलोबेस (केबी), 2 केबी, 5 केबी, 10 केबी और 20 केबी रुचि की साइट (ओं) से करें।
    13. इनपुट कंट्रोल प्राइमरों को डिज़ाइन करने के लिए, इन चरणों को रुचि की साइट से 1-2 kB साइट के लिए दोहराएं जिसमें प्रतिबंध साइट का अभाव है, जिसका अर्थ है कि इसे कभी नहीं काटा जाता है।
  2. कार्यात्मक प्राइमर सत्यापन
    1. प्राइमर कार्यक्षमता को मान्य करने के लिए, टाइटेटेड प्राइमर सांद्रता और शुद्ध जीनोमिक डीएनए का उपयोग करके पीसीआर प्रतिक्रियाओं को सेट करें। या तो मात्रात्मक या अर्ध-मात्रात्मक साधनों के माध्यम से, यह निर्धारित करें कि प्राइमर अपेक्षित उत्पाद बनाते हैं या नहीं।
    2. सत्यापन में विफल होने वाले प्राइमरों को फिर से डिज़ाइन करें।

2. दिन 1

नोट: प्रोटोकॉल को क्रोमैटिन क्रॉस-लिंकिंग के बाद और नाभिक संग्रह के बाद रोका जा सकता है (-20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए)। स्नातक के साथ औसतन, 5-6 घंटे के लिए कदम उठाते हैं।

  1. युवा वयस्क (वाईए) सी एलिगेंस नाभिक संग्रह (हान एट अल 29 से अनुकूलित)।
    1. क्रोमैटिन क्रॉसलिंकिंग
      1. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एम 9 माध्यम के 30 मिलीलीटर में 5,000 वाईए कीड़े इकट्ठा करें, और कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर स्पिन करें।
      2. बैक्टीरिया को हटाने के लिए एम 9 के साथ कीड़े के गोली को 3 गुना अधिक धोएं।
      3. सतह पर तैरने वाले को हटा दें, 47.3 मिलीलीटर एम 9 में कृमि गोली को फिर से निलंबित करें, जिसमें 2.7 एमएल 37% फॉर्मलाडेहाइड (2% अंतिम) हो, और आरटी पर 30 मिनट के लिए आंदोलन (रॉकिंग या न्यूटेटिंग) के साथ इनक्यूबेट करें।
        सावधानी: फॉर्मलाडेहाइड को देखभाल के साथ संभालें, और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई-लैब कोट, उचित दस्ताने, और आंखों की सुरक्षा) के साथ फ्यूम हुड के तहत काम करें। फॉर्मलाडेहाइड एक अड़चन है जो आंखों, नाक, गले और फेफड़ों को प्रभावित करता है।
      4. आरटी पर 2 मिनट के लिए कीड़े को 400 × ग्राम पर घुमाएं।
      5. सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और 1 एम ग्लाइसिन के 50 एमएल में कीड़े की गोली को फिर से निलंबित करें। आरटी पर 2 मिनट के लिए कीड़े को 400 × ग्राम पर घुमाएं।
    2. नाभिक संग्रह
      1. 6 मिलीलीटर ठंडा एनपी बफर (पीएच 7.5, 40 एमएम एनएसीएल, 90 एमएम केसीएल, 2 एमएम ईडीटीए, 0.5 एमएम ईजीटीए, 0.1% ट्वीन 20, 0.2 एमएम डीटीटी, 0.5 एमएम स्पर्मिडाइन, 0.25 एमएम स्पर्मिन, 1 एक्स पूर्ण प्रोटीज अवरोधक) में वर्म गोली को फिर से निलंबित करें।
      2. कृमि निलंबन को बर्फ पर 7 एमएल ढीले-फिटिंग डोंस में स्थानांतरित करें। नमूना 15x को औंस करें, और 5 मिनट के लिए बर्फ पर पकड़ें।
      3. कृमि निलंबन को बर्फ पर 7 एमएल टाइट-फिटिंग डोंस में स्थानांतरित करें। नमूना 20x को औंस करें, और 5 मिनट के लिए बर्फ पर पकड़ो।
      4. कृमि निलंबन को एक साफ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें, और एनपी बफर को कुल मिलाकर 10 एमएल (लगभग 4 एमएल) में जोड़ें।
      5. 30 सेकंड के लिए एक उच्च सेटिंग पर कीड़ा निलंबन भंवर। 5 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना सेने करें।
      6. पिछले चरण को दोहराएँ।
      7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर कृमि निलंबन को घुमाएं।
      8. सतह पर तैरनेवाला को एक ताजा 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      9. कीड़े मलबे के लिए नमूने की जांच करें। एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ नमूने के 10 μL की कल्पना करें। यदि कीड़ा मलबा मौजूद है, तो नमूने को 2,000 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं, गोली को एनपी बफर के ताजा 10 एमएल में फिर से निलंबित करें, और नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर फिर से घुमाएं। गोली को छोड़ दें, कीड़े के मलबे के लिए सतह पर तैरनेवाले की जांच करें, और तब तक दोहराएं जब तक कि नमूना कृमि मलबे से मुक्त न हो जाए।
        नोट: वैकल्पिक रूप से, कीड़े के मलबे को 40 μm सेल स्ट्रेनर (6x) के माध्यम से नमूने को तनाव देकर भी हटाया जा सकता है, इसके बाद 20 μm सेल स्ट्रेनर (6x) होता है।
      10. यदि नमूना कृमि मलबे से स्पष्ट है, तो नमूने का 5 μL लें, मिथाइल ग्रीन पाइरोनिन के 5 μL जोड़ें (नाभिक नीला होगा), और हेमोसाइटोमीटर के साथ नाभिक की गणना करें।
      11. नमूने को 2,000 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें।
      12. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, नमूने बर्फ पर रखें, और आगे बढ़ें; वैकल्पिक रूप से, नाभिक को स्नैप-फ्रीज करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. क्रोमैटिन पाचन
    1. 450 μL स्वच्छ पानी में नाभिक को पुन: निलंबित करें। नाभिक को एक साफ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. क्रॉस-लिंक्ड नमूने में, 10x DpnII प्रतिबंध एंजाइम बफर के 60 μL जोड़ें, और अच्छी तरह मिलाएं।
      नोट: अन्य प्रतिबंध एंजाइम जो अभी भी क्रॉसलिंक्ड डीएनए को काटते हैं, उनका उपयोग किया जा सकता है।
    3. नाभिक को स्थिर करने के लिए 10% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) के 15 μL जोड़ें, और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन (रॉकिंग या न्यूटिंग) के साथ इनक्यूबेट करें।
      सावधानी: एसडीएस एक अड़चन है और त्वचा के माध्यम से निगलने या अवशोषित होने पर विषाक्त है। देखभाल के साथ संभालें, और उचित पीपीई (लैब कोट, उचित दस्ताने, और आंखों की सुरक्षा) का उपयोग करें।
    4. 20% ट्राइटन एक्स -100 के 75 μL को जोड़कर एसडीएस को बुझाएं और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के साथ इंक्यूबेट करें।
    5. एक अपचनीय नियंत्रण के रूप में नमूने से 10 μL लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. डीपीएनआईआई के 400 यू जोड़ें, और आंदोलन के साथ रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

3. दिन 2

नोट: औसतन, इन चरणों को पूरा करने के लिए स्नातक को 5 घंटे लगते हैं।

  1. क्रोमैटिन पाचन
    1. डीपीएनआईआई के अतिरिक्त 200 यू जोड़ें, और क्रॉसलिंक किए गए नमूने के पूर्ण पाचन को सुनिश्चित करने के लिए आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
    2. पाचन नियंत्रण के रूप में नमूने से 10 μL एलिकोट लें।
    3. 65 डिग्री सेल्सियस (या निर्माता के निर्देशों के अनुसार) पर 20 मिनट के लिए नमूने को इंजेक्ट करके प्रतिबंध एंजाइम को गर्मी-निष्क्रिय करें। चरण 2.1.3 जारी रखें।
    4. यदि एंजाइम को गर्मी से निष्क्रिय नहीं किया जा सकता है, तो 10% एसडीएस के 80 μL जोड़ें, और 65 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें। फिर, 20% ट्राइटन एक्स -100 के 375 μL जोड़ें, और घूमकर मिलाएं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें, और चरण 2.2 जारी रखें।
  2. क्रोमैटिन बंधाव
    1. नमूने को एक साफ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें, आणविक-ग्रेड एच2ओ के साथ नमूना मात्रा को 5.7 एमएल में समायोजित करें, और घूमकर मिलाएं।
    2. 10x T4 लिगेज बफर के 700 μL जोड़ें, और घूमकर मिलाएं।
    3. टी 4 डीएनए लिगेज के 60 यू जोड़ें, और घूमकर मिलाएं।
    4. 16 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।

4. दिन 3

नोट: औसतन, इन चरणों को पूरा करने के लिए स्नातक 15-30 मिनट लगते हैं। रात भर इनक्यूबेशन के बाद, नमूने फ्रीज किए जा सकते हैं।

  1. प्रोटीन पाचन और रिवर्स क्रॉस-लिंकिंग
    1. 3 सी नमूने में 30 μL प्रोटीनके (10 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें, और आंदोलन के साथ रात भर 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। बिना पचे हुए और पाचन नियंत्रण के लिए 5 μL प्रोटीनके (10 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें, और आंदोलन के साथ रात भर 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

5. दिन 4

नोट: औसतन, इन चरणों को पूरा करने के लिए स्नातक 4-5 घंटे लगते हैं।

  1. 3 सी पुस्तकालय का शुद्धिकरण
    1. 3 सी नमूने में RNase A (10 मिलीग्राम / एमएल) के 30 μL जोड़ें, और मिश्रण करने के लिए घुमाएं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
    2. नमूने में फिनोल-क्लोरोफॉर्म के 7 एमएल जोड़ें, और हिलाकर मिलाएं।
      चेतावनी: फिनोल-क्लोरोफॉर्म एक त्वचा और आंखों की जलन है और अगर संपर्क का इलाज नहीं किया जाता है तो जलन हो सकती है। फिनोल-क्लोरोफॉर्म का उपयोग उचित आंखों की सुरक्षा और दस्ताने (नाइट्राइल) के साथ फ्यूम हुड में किया जाना चाहिए।
    3. आरटी में 3,270 × ग्राम पर 15 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। जलीय चरण एकत्र करें, और एक साफ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। क्लोरोफॉर्म की समान मात्रा जोड़ें, और मिश्रण को हिलाकर मिलाएं।
    4. आरटी में 3,270 × ग्राम पर 15 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। जलीय चरण एकत्र करें, और एक साफ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। 7.5 एमएल आणविक-ग्रेड एच2ओ, 100% इथेनॉल के 35 एमएल, और (वैकल्पिक) ग्लाइकोजन के 7 μL (1 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें। हिलाकर मिलाएं, और -80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि नमूना जम न जाए।
      नोट: नमूने को फ्रीज होने में 1 घंटे या उससे अधिक समय लग सकता है। प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है।
      1. जबकि 3 सी नमूना ठंड है, नियंत्रण नमूने को शुद्ध करें। नियंत्रण नमूने के लिए, आणविक-ग्रेड पानी का उपयोग करके मात्रा को 500 μL में समायोजित करें, और ट्यूब को फ्लिक करके RNase A (10 मिलीग्राम / एमएल) मिश्रण के 2 μL जोड़ें।
      2. ट्यूब के निचले भाग में नमूना एकत्र करने के लिए संक्षेप में स्पिन करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
      3. नियंत्रण नमूने के लिए, फिनोल-क्लोरोफॉर्म के 1 एमएल जोड़ें, और ट्यूबों को हिलाकर मिलाएं। आरटी में 3,270 × ग्राम पर 15 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। नियंत्रण के जलीय चरण को इकट्ठा करें, और एक साफ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें।
      4. क्लोरोफॉर्म की समान मात्रा जोड़ें, और मिश्रण को हिलाकर मिलाएं। आरटी में 3,270 × ग्राम पर 15 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। नियंत्रण के जलीय चरण को इकट्ठा करें, और एक साफ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें।
      5. 100% इथेनॉल का 1 एमएल और ग्लाइकोजन के 2 μL (1 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें। हिलाकर मिलाएं, और 30 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,270 × ग्राम पर 15 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, और 750 μL ठंडा 70% इथेनॉल जोड़ें।
      7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,270 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और नमूनों को हवा में सुखाएं। आणविक-ग्रेड एच2ओ के 50 μL में गोली को पुन: निलंबित करें, या चरण 6 को जारी रखें।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,270 × ग्राम पर 60 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाला को हटा दें, और 10 मिलीलीटर ठंडा 70% इथेनॉल जोड़ें। मिश्रण करने के लिए नमूने को हिलाकर डीएनए गोली को बाधित और तोड़ दें।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,270 × ग्राम पर 30 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और नमूने को आरटी पर आंशिक रूप से हवा में सूखने दें। ऊपर और नीचे पाइप करके 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.5) के 150 μ L में गोली को फिर से निलंबित करें। यह "3 सी लाइब्रेरी" है।
      नोट: नमूना फ्रीज करें, या विश्लेषण जारी रखें।

6. दिन 5

नोट: औसतन, इन चरणों को पूरा करने के लिए स्नातक 1-2 घंटे लगते हैं।

  1. नियंत्रण प्राइमर के मानक वक्र का उपयोग करके नमूना गुणवत्ता का निर्धारण करना
    1. 3 सी नमूने के साथ-साथ सभी नियंत्रणों के लिए डीएनए एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें, और नमूने को 30 μg / μL (यदि सांद्रता अनुमति दे) में समायोजित करें। क्रमिक रूप से पतला नमूने को दो बार चार बार पतला किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक नमूने के लिए पांच कमजोर पड़ते हैं (1x, 0.5x, 0.25x, 0.125x, 0.0625x)।
      नोट: यदि परिमाणीकरण आसानी से नहीं किया जा सकता है, तो ऊपर बताए गए अनुसार नमूनों को क्रमबद्ध रूप से पतला करें, और आगे बढ़ें।
    2. नियंत्रण प्राइमरों के साथ प्रत्येक पतला नमूने के लिए 3 सी, जीनोमिक नियंत्रण और पचने वाले नियंत्रण के लिए पीसीआर प्रतिक्रियाएं सेट करें: डीएनए का 1 μL, 5x प्रतिक्रिया बफर का 10 μL, 10 mM dNTP का 1 μL, 10 mM नियंत्रण प्राइमर का 1 μL (आगे और रिवर्स मिश्रित), 1 μL Taq पोलीमरेज़, और 36 μL पानी।
    3. पीसीआर मशीन के लिए विशिष्ट सॉफ़्टवेयर के निर्देशों का पालन करते हुए, साइकिल िंग स्थितियों का उपयोग करके मानक वक्र पीसीआर प्रोग्राम को निम्नानुसार सेट करें: 98 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड; 98 डिग्री सेल्सियस पर 5 एस के 30 चक्र, 60 डिग्री सेल्सियस पर 5 एस और 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 एस; 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट; 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ो।
    4. सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, नमूने के लिए मानक वक्र उत्पन्न करें। सॉफ्टवेयर वक्र उत्पन्न करने के बाद, पीसीआर दक्षता और आर2 मान पर ध्यान दें।
  2. डीएनए एकाग्रता का निर्धारण
    1. 3 सी नमूनों की डीएनए एकाग्रता निर्धारित करने के लिए, नमूनों की तुलना ज्ञात एकाग्रता के जीनोमिक डीएनए नमूने से करें। नमूने को 30 ng/μL तक पतला करें, और एक मानक वक्र बनाने के लिए जीनोमिक नियंत्रण को 10 ng/μL से 0.01 ng/μL तक क्रमिक रूप से पतला करें।
      नोट: यदि परिमाणीकरण आसानी से नहीं किया जा सकता है, तो नमूना 1: 10 को पतला करें, और आगे बढ़ें।
    2. नियंत्रण प्राइमरों के साथ प्रत्येक पतला नमूने के लिए 3 सी, जीनोमिक नियंत्रण और पचा हुआ नियंत्रण के लिए पीसीआर प्रतिक्रियाओं को सेट करें: डीएनए का 1 μL, 5x प्रतिक्रिया बफर का 10 μL, 10 mM dNTP का 1 μL, 10 mM नियंत्रण प्राइमर का 1 μL (आगे और रिवर्स मिश्रित), 1 μL Taq पोलीमरेज़, और 36 μL पानी।
    3. पीसीआर मशीन के लिए विशिष्ट सॉफ़्टवेयर के निर्देशों का पालन करते हुए, साइकिल िंग स्थितियों का उपयोग करके मानक वक्र पीसीआर प्रोग्राम स्थापित करें: 98 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड; 98 डिग्री सेल्सियस पर 5 एस के 30 चक्र, 60 डिग्री सेल्सियस पर 5 एस और 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 एस; 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट; 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ो।
    4. सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, नमूने के लिए मानक वक्र उत्पन्न करें, वक्र पर 3 सी नमूने प्लॉट करें। ज्ञात एकाग्रता के जीनोमिक डीएनए की प्रतिक्रियाओं द्वारा बनाए गए मानक वक्र के लिए 3 सी नमूना बहुतायत की स्थिति की तुलना करें, और 3 सी नमूने को 30 एनजी /
  3. क्रोमैटिन इंटरैक्शन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का निर्धारण
    1. 3 सी नमूने, जीनोमिक नियंत्रण नमूना, और पचे हुए नियंत्रण नमूने के 30 एनजी के साथ क्यूपीसीआर प्रतिक्रियाओं को सेट करें: डीएनए का 1 μL, 5x प्रतिक्रिया बफर का 10 μL, 10 mM dNTP का 1 μL, 10 mM प्राइमर का 1 μL (आगे और रिवर्स मिश्रित), 1 μL Taq पोलीमरेज़, और 36 μL पानी।
      नोट: प्रतिक्रियाओं को नियंत्रण प्राइमर, व्यक्तिगत जीनोमिक लोकी के लिए परीक्षण प्राइमर, और क्रोमैटिन इंटरैक्शन (चित्रा 3) को निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जा रहे परीक्षण प्राइमरों (साइट "ए" फॉरवर्ड और साइट "बी" रिवर्स) के वांछित संयोजनों का उपयोग करके स्थापित किया जाना चाहिए।
    2. पीसीआर मशीन के सॉफ्टवेयर के निर्देशों का पालन करते हुए, पीसीआर प्रोग्राम को निम्नानुसार सेट करें: 98 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड; 98 डिग्री सेल्सियस पर 5 एस के 40 चक्र, 60 डिग्री सेल्सियस पर 5 एस और 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 एस; 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट; 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ो।
    3. पीसीआर चलाए जाने के बाद, प्रवर्धन भूखंड का निरीक्षण करें। सुनिश्चित करें कि पीसीआर प्रतिक्रियाएं घातीय प्रवर्धन प्रदर्शित करती हैं, हर चक्र को दोगुना करती हैं।
      नोट: घातीय प्रवर्धन प्रदर्शित नहीं करने वाली प्रतिक्रियाओं का आगे विश्लेषण नहीं किया जा सकता है।
    4. पीसीआर मशीन के सॉफ्टवेयर के निर्देशों का पालन करते हुए, क्यूपीसीआर प्रयोग की सीमा को परिभाषित करें।
    5. सभी नमूने के लिए सीटी मान निर्यात करें।
    6. समीकरण (1) का उपयोग करके परीक्षण प्राइमर (टीपी) और नियंत्रण प्राइमर (सीपी) सीटी मानों का उपयोग करके पाचन दक्षता निर्धारित करें और अनडाइजेस्टेड कंट्रोल (यूसी) और पचे हुए नियंत्रण (डीसी) नमूनों से नियंत्रण करें।
      पचने वाला प्रतिशत = 100 - Equation 1 (1)
    7. ये मान 80% -90% पाचन की सीमा में होना चाहिए। इन मानों को रिकॉर्ड करें (चित्रा 4A).
    8. समीकरण (2) का उपयोग करके परीक्षण प्राइमर संयोजन (टीपीसी) और नियंत्रण प्राइमर (सीपी) सीटी मानों का उपयोग करके सापेक्ष क्रोमैटिन इंटरैक्शन का निर्धारण करें।
      क्रोमैटिन इंटरैक्शन = 100 - Equation 2 (2)
    9. प्रत्येक परीक्षण प्राइमर संयोजन के लिए बार ग्राफ पर प्रत्येक नमूने के लिए मान प्लॉट करें।
    10. यह निर्धारित करने के लिए 3 सी नमूने के संकेत की तुलना नियंत्रण नमूनों से करें कि क्या 3 सी नमूने में नियंत्रण नमूनों पर एक विशेष क्रोमैटिन इंटरैक्शन का संवर्धन है। 3 सी नमूने जो नियंत्रण पर संवर्धन दिखाते हैं, उन्हें सशर्त रूप से सकारात्मक माना जा सकता है और सेंगर अनुक्रमण (चित्रा 4 बी) का उपयोग करके सत्यापन की आवश्यकता होती है।
      नोट: ग्राफ़ डेटा का विश्लेषण करते समय, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि जब तक "नियंत्रण टेम्पलेट" का उपयोग नहीं किया जाता है (चर्चा देखें), प्रतिक्रियाओं के बीच बहुतायत (यानी, प्राइमरों के एक सेट से दूसरे तक) की तुलना नहीं की जा सकती है।
  4. 3 सी उत्पादों की पहचान
    1. पीसीआर उत्पादों को 1.5% एगारोस जेल पर चलाएं।
    2. यूवी लाइट बॉक्स या जेल प्रलेखन प्रणाली का उपयोग करके पीसीआर उत्पादों के सही आकार के लिए जेल की कल्पना करें।
      नोट: अच्छी तरह से निर्मित 3 सी पुस्तकालयों में डीएनए टुकड़ों की एक विविध श्रृंखला होगी, और विशिष्टता के लिए प्राइमरों के पिछले सत्यापन के बावजूद, 3 सी पुस्तकालयों से पीसीआर प्रतिक्रियाओं में कई बैंड (चित्रा 5 ए) शामिल होने की क्षमता है। यह 3C लायब्रेरीज़ के विश्लेषण को रोकता नहीं है।
    3. अपेक्षित टुकड़े के आकार के अनुरूप उत्पाद बैंड का उत्पाद शुल्क लें, और एक वाणिज्यिक किट या नीचे उल्लिखित होममेड प्रोटोकॉल के निर्देशों का पालन करते हुए पीसीआर उत्पादों का जेल निष्कर्षण करें।
      सावधानी: यूवी प्रकाश एक ज्ञात कार्सिनोजेन है, और यूवी प्रकाश के संपर्क में आने वाले समय को सीमित करने के लिए बहुत सावधानी बरतनी चाहिए। यूवी प्रतिरोधी आंख संरक्षण, एक नमूना ढाल, दस्ताने, और एक प्रयोगशाला कोट पहना जाना चाहिए।
      1. एक घर का बना शुद्धिकरण कारतूस बनाने के लिए, एक सुई के साथ 0.5 एमएल ट्यूब के तल में एक छेद करें।
      2. 0.5 एमएल ट्यूब के तल में एक कपास की गेंद से कपास की एक छोटी मात्रा पैक करें, ट्यूब के आधे से अधिक न भरें।
      3. 0.5 एमएल ट्यूब को 1.5 एमएल ट्यूब में रखें; सुनिश्चित करें कि छोटी ट्यूब बड़ी ट्यूब के होंठ पर टिकी हुई है, ट्यूब में नहीं।
      4. सावधानी से एक जेल के टुकड़े को छोटे टुकड़ों में काटें, और इसे कारतूस के 0.5 एमएल ट्यूब में रखें।
      5. असेंबली को 5 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें। आरटी पर 13,000 × ग्राम पर 3 मिनट के लिए असेंबली को स्पिन करें।
      6. निकाले गए डीएनए के साथ 1.5 एमएल ट्यूब को बफर में रखें, और 0.5 एमएल ट्यूब का निपटान करें जिसमें अगारोस मलबे होते हैं।
      7. शुद्ध डीएनए को 3 सी टुकड़े के लिए आगे और रिवर्स प्राइमरों का उपयोग करके सेंगर अनुक्रमण के लिए भेजा जा सकता है।
    4. ब्लैट का उपयोग करके क्रोमैटिन संपर्कों की पहचान
      1. अनुक्रमण के पूरा होने पर, निर्धारित करें कि क्या नमूने अनुक्रमण रिपोर्ट में बताए गए गुणवत्ता नियंत्रण मानकों को पूरा करते हैं।
      2. QC को पास करने वाले अनुक्रमों के लिए, किसी अनुक्रमण संपादन प्रोग्राम जैसे अन्य प्लास्मिड संपादक (APE) में .seq और .ab1 (ट्रेस) फ़ाइलें खोलें, स्पष्ट आधार कॉलिंग चोटियों के लिए .ab1 फ़ाइल का निरीक्षण करें, और .seq फ़ाइल में गलत कही गई चोटियों को संपादित करें.
      3. संपादित .seq फ़ाइल का उपयोग करते हुए, DpnII साइट खोजें. अनुक्रम परिणाम के आधार पर, यह रिपोर्ट किए गए अनुक्रम में आधा होना चाहिए।
      4. यह निर्धारित करने के लिए कि क्या अनुक्रम अपेक्षित लक्ष्य अनुक्रम है, डीपीएनआईआई साइट और 3 सी के लिए परीक्षण किए गए जीनोमिक लोकी के फॉरवर्ड प्राइमर के अनुरूप अपस्ट्रीम अनुक्रम के अतिरिक्त 30-50 बीपी को हाइलाइट करें। लक्ष्य प्रजातियों के खिलाफ इस अनुक्रम की ब्लैट खोज करें। सुनिश्चित करें कि जीनोमिक लोकी प्राइमर से मेल खाती है।
      5. रिवर्स प्राइमर अनुक्रम के लिए ऊपर दिए गए चरण को दोहराएं, यह सुनिश्चित करें कि जीनोमिक लोकस रिवर्स प्राइमर से मेल खाता है।

Representative Results

यह प्रक्रिया एक प्रयोगात्मक 3 सी नमूना और दो नियंत्रण नमूने (बिना पचे और पचे हुए) का उत्पादन करेगी। इन तीन नमूनों का उपयोग करके, क्यूपीसीआर का प्रदर्शन किया गया था। इन परिणामों से, पाचन दक्षता की गणना (समीकरण 1) और दर्ज की गई (तालिका 1)। इन गणनाओं से, यह निर्धारित किया गया था कि 3 सी नमूने में परीक्षण किए गए सात जीनोमिक लोकी में लगभग 88% पाचन दक्षता (तालिका 1 का औसत) थी।

इसके बाद, नमूनों को लोकी-विशिष्ट प्राइमरों (तालिका 2) और क्यूपीसीआर के संयोजन का उपयोग करके विभिन्न जीनोमिक लोकी के बीच लंबी दूरी के क्रोमैटिन संपर्कों की उपस्थिति के लिए परीक्षण किया गया था। इन परिणामों का उपयोग करके, एक नियंत्रण प्राइमर सेट के सापेक्ष उत्पाद बहुतायत की गणना (समीकरण 2) की गई और तुलना के लिए ग्राफ़ किया गया (चित्रा 4)। इन आंकड़ों ने संकेत दिया कि 10 प्रतिक्रियाओं में से 8 लंबी दूरी की बातचीत के लिए सशर्त सकारात्मक थे।

पीसीआर प्रतिक्रियाओं को तब एक अगारोस जेल पर चलाया गया था। आठ सशर्त सकारात्मक और एक नकारात्मक प्रतिक्रिया के लिए अपेक्षित पीसीआर उत्पाद को जेल-शुद्ध किया गया और सेंगर अनुक्रमण के लिए भेजा गया। प्रतिनिधि सकारात्मक (नीला तीर, नीला बॉक्स) और नकारात्मक (लाल तीर, लाल बॉक्स) प्रतिक्रियाओं के परिणाम दिखाए गए हैं (चित्रा 5)।

Figure 1
चित्र 1: नाभिक में गुणसूत्र संरचना। नाभिक के अंदर काल्पनिक गुणसूत्र संगठन। (ए) परमाणु लिफाफा, काली रेखाएं; (बी) परमाणु लैमिना, नारंगी; (सी) हेटेरोक्रोमैटिन, कॉम्पैक्ट लाइनें; (डी) यूक्रोमैटिन, ढीले लूप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: 3 सी प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध। रैखिक गुणसूत्रों (नीले, पीले और गुलाबी) के दूर के हिस्सों को नियामक लूप के माध्यम से नाभिक के भीतर एक साथ लाया जाता है। (ए) लूप संरचनाओं को प्रतिलेखन कारकों (ग्रे सर्कल और ब्लैक स्टार) द्वारा मध्यस्थ किया जाता है; इन इंटरैक्शन को रासायनिक क्रॉसलिंकिंग के माध्यम से संरक्षित किया जाता है। (बी) लूप एंजाइमेटिक पाचन (काली रेखाओं) के माध्यम से टूट जाते हैं। (सी) दूर के क्रोमैटिन के टुकड़े पाचन द्वारा बनाए गए चिपके हुए सिरों के माध्यम से एक साथ बंधे होते हैं। (डी) डीएनए प्रोटीन से शुद्ध होता है। (ई) टुकड़ों के भीतर अनुक्रम की पहचान की जाती है और जीनोम में वापस मैप किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: 3 सी प्राइमर योजना। 3 सी प्राइमरों को रुचि के जीनोमिक स्थान से अलग-अलग दूरी पर प्रतिबंध साइटों के आसपास डिज़ाइन किया गया है। गुलाबी तीर एक डीपीएनआईआई साइट के आसपास प्रयोगात्मक प्राइमर सेट का प्रतिनिधित्व करते हैं। क्षेत्र में क्रोमैटिन लूपिंग का आकलन करने के लिए प्रयोगात्मक प्राइमरों को मिश्रित और मिलान किया जा सकता है। नारंगी प्राइमर डीपीएनआईआई साइट के बिना एक नकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: 3 सी प्रयोग के लिए प्रतिनिधि क्यूपीसीआर डेटा। 3 सी टेस्ट प्राइमर सेट की सापेक्ष बहुतायत। (ए) नियंत्रण ग्राफ जो बिना पचे हुए नियंत्रण (नीला), पचा हुआ नियंत्रण (ग्रे), और 3 सी नमूना (नारंगी) में उत्पाद की सापेक्ष बहुतायत को दर्शाता है। (बी) 3 सी प्रयोग; अनडाइजेस्टेड कंट्रोल (ब्लू), डाइजेस्टेड कंट्रोल (ग्रे), और 3 सी सैंपल (नारंगी) में टेस्ट प्राइमरों के संयोजन से उत्पाद की सापेक्ष बहुतायत। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: 3 सी क्यूपीसीआर उत्पादों का विज़ुअलाइज़ेशन। शीर्ष पर, संकेतित नमूनों के साथ क्यूपीसीआर एंडपॉइंट उत्पादों के साथ जेल। नीचे, प्रतिनिधि सेंगर अनुक्रम इंगित प्रतिक्रियाओं के लिए फ़ाइलों का पता लगाता है। नारंगी नमूना एक झूठे सकारात्मक का एक उदाहरण है ( चित्रा 4, आर 38/34 देखें), और नीला नमूना ट्रेस के ऊपर इंगित डीपीएनआईआई साइट के साथ एक सच्चे सकारात्मक का एक उदाहरण है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

साइट % पाचन
r8 86.98
r3 88.44
r38 89.64
r34 87.55
r33 87.85
r14 86.97
r47 89.45

तालिका 1: पाचन दक्षता की गणना की।

नाम अनुक्रम जीनोमिक लोकी।
r3 FWD ACGCAAGTAAAATCTGGTTTTTGACC chrX:11361475
आर 3 आरवीएस TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC chrX:11361561
r38 FWD TTACTTCTGAAGTAATCTTTTTCTCTCCCC chrX:5859700
r38 RVS AGACGAGCTGATTAAAAGTTGG chrX:5859775
r34 FWD ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG chrX:5429702
r34 RVS AATAATCCTTAACAAACGTGGCC chrX:5429777
r33 FWD AAGAGTTGTCCAAAAAAATTGAGCTAAC chrX:6296704
r33 RVS TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG chrX:6296807
r14 FWD AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG chrX:8036367
आर 14 आरवीएस एटीटीटीसीएएएटीजीएएएएएटीसीटीसी chrX:8036427
r47 FWD ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC chrX:9464939
r47 RVS AAGTTCTGCAACTGTTAGATGATAACAC chrX:9465064
r8 FWD GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG chrX:11094257
आर 8 आरवीएस TTACGAAATGGGGTTTTGGACC chrX:11094362
नियंत्रण प्राइमर एफडब्ल्यूडी; CAATCGTCTCGCTCACTTGTC chrX:7608049
नियंत्रण प्राइमर आरवीएस GATGTGAGCACACACACC chrX:7608166

तालिका 2: प्रतिनिधि 3 सी प्रयोग के लिए प्राइमर।

Discussion

3 सी एक शक्तिशाली तकनीक है जो बुनियादी आणविक तकनीकों में निहित है। यह मौलिक उपकरणों की नींव है जो 3 सी को अंडरग्रेजुएट्स के साथ उपयोग करने के लिए ऐसी पेचीदा तकनीक बनाती है। इतने व्यापक पैमाने पर क्रोमैटिन गतिशीलता का अवलोकन करने वाले कई हालिया अध्ययनों के साथ, इन परिणामों का उपयोग करके एकल जीन या जीनोमिक क्षेत्र पर एक संकीर्ण-केंद्रित प्रयोग तैयार करने में स्नातक अनुसंधान में एक अद्वितीय और प्रभावशाली प्रयोग बनाने की क्षमता है। अक्सर, इस तरह के प्रयोगों को अंडरग्रेजुएट्स के लिए बहुत उन्नत माना जाता है, लेकिन सावधानीपूर्वक योजना के साथ, वे आसानी से प्राप्त किए जा सकते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि 3 सी लाइब्रेरी द्वारा कैप्चर किए गए क्रोमैटिन कनेक्शन की जांच करने के लिए डिज़ाइन किए गए परख अर्ध-मात्रात्मक समापन बिंदु पीसीआर से पूरे जीनोम अनुक्रमण तक भिन्न हो सकते हैं। वास्तव में, पहले 3 सी पेपर16 से डेटा क्यूपीसीआर से उत्पन्न किया गया था। परख की इस विस्तृत श्रृंखला का उपयोग किया जा सकता है क्योंकि सभी 3 सी प्रौद्योगिकियां एक ही उत्पाद का उत्पादन करती हैं- नाभिक में 3 डी कनेक्शन का प्रतिनिधित्व करने वाले डीएनए टुकड़ों की एक लाइब्रेरी।

यहां प्रस्तुत एक अधिक लचीला और समायोजित प्रोटोकॉल का अनुकूलन है जो स्नातक शोधकर्ताओं के लिए बेहतर फिट है। ऊपर सूचीबद्ध विराम अवधि का अर्थ है रात भर की देरी; हालांकि, ये विराम सप्ताहांत में और कोशिकाओं और नाभिक के मामले में, हफ्तों तक बढ़ सकते हैं। सबसे महत्वपूर्ण विचार यह है कि काम कब पूरा होगा। अक्सर प्रोटोकॉल में, समय-संवेदनशील कदम होते हैं जब रोकना एक विकल्प नहीं होता है। कुछ बिंदुओं (दिन 1 और दिन 2) के बाहर, नमूने को रोकने और फ्रीज करने के लिए कई स्थान हैं। अंडरग्रेजुएट्स के साथ काम करते समय ये महत्वपूर्ण होते हैं जहां प्रयोगशाला के काम के शेड्यूल और समय को लचीला होना चाहिए। प्रोटोकॉल में इन स्टॉप को इंजीनियरिंग करने के अलावा, अंडरग्रेजुएट्स को जोड़े या यहां तक कि तीन या चार के छोटे समूहों में काम करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है। समूह इस प्रोटोकॉल के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, क्योंकि छात्र एक-दूसरे का समर्थन कर सकते हैं और एक दोस्त प्रणाली बना सकते हैं ताकि हर कोई सुरक्षित रूप से काम कर सके। लैब का काम भी शामिल अन्य लोगों के साथ अधिक मजेदार है। समूहों के साथ, छात्र अभी भी एक ही प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते हुए क्रोमैटिन के संगठन पर केंद्रित विभिन्न प्रकार के प्रश्नों पर भी काम कर सकते हैं। इस प्रकार, यहां तक कि जब छात्र अलग-अलग परियोजनाओं पर काम कर रहे हैं, प्रोटोकॉल उनके प्रयासों को जोड़ता है, और इस वजह से, वे एक-दूसरे का समर्थन कर सकते हैं।

अन्य अनुकूलन इस तथ्य के आसपास काम करने के लिए हैं कि कुछ विशेष उपकरण और उपकरण आवश्यक रूप से सभी स्नातक संस्थानों में नहीं पाए जाते हैं। उपकरण के इन टुकड़ों में क्यूपीसीआर थर्मोसाइकलर्स, जेल प्रलेखन प्रणाली और नैनो वॉल्यूम स्पेक्ट्रोमीटर शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं हैं। दरअसल, उपकरण के ये टुकड़े सुविधाजनक हैं लेकिन एक आवश्यकता नहीं है। यहां, 3 सी की क्लासिक विधि को प्राइमर डिजाइन भाग में भी वर्णित किया गया है; इसमें रुचि के जीनोमिक स्थान की पहचान करना और उससे, क्रोमैटिन संपर्क बिंदुओं के लिए अन्य जीनोमिक लोकी का आकलन करना शामिल है। यह तकनीक भी अच्छी तरह से काम करती है यदि एक प्रकाशित डेटासेट का उपयोग किया जाता है, जैसे कि हाई-सी का उपयोग करने वाला डेटासेट, जहां ज्ञात सकारात्मक (कनेक्टिंग) और नकारात्मक (गैर-कनेक्टिंग) लोकी की पहचान की जाती है। इन प्रकाशित डेटा सेटों का उपयोग करके प्रयोगों को डिजाइन करना शिक्षण प्रयोगशालाओं के लिए एक और महान अनुकूलन है, क्योंकि क्रोमैटिन कनेक्शन की सफल पहचान की संभावना आमतौर पर अधिक होती है। इसके अलावा, शोध लेख कक्षा में चर्चा की जा सकती है और एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल 3 सी उत्पाद गठन की कल्पना करने के लिए एक संशोधित क्यूपीसीआर दृष्टिकोण का उपयोग करता है। 3 सी तकनीक की सफलता के लिए नियंत्रण आवश्यक हैं। प्रत्येक प्रयोग 3 सी प्रक्रिया के पूरा होने का निर्धारण करने के लिए नमूना नियंत्रण और प्राइमर नियंत्रण दोनों का उपयोग करता है। नमूना नियंत्रण में एक अनपचा हुआ नियंत्रण (जीनोमिक डीएनए) और पचा हुआ नियंत्रण शामिल है। अनडाइजेस्टेड कंट्रोल प्राइमर सेट के लिए बेसलाइन सिग्नल निर्धारित करता है और पाचन दक्षता निर्धारित करने के लिए क्रॉस-लिंक्ड पाचन नियंत्रण के साथ उपयोग किया जाता है। इस मान की तुलना बिना पचे हुए नियंत्रण से करना इस बात का संकेत देता है कि नमूना कितनी अच्छी तरह पच गया था।

पीसीआर के लिए प्राइमरों में एक नियंत्रण प्राइमर और परीक्षण प्राइमर शामिल हैं। नियंत्रण प्राइमर एक प्राइमर सेट है जो जीनोमिक क्षेत्र के पास है और इसमें प्रतिबंध स्थल नहीं है। यह परीक्षण प्राइमर पीसीआर उत्पादों की प्रचुरता का निर्धारण करने के लिए आधार रेखा प्रदान करता है। टेस्ट प्राइमर आगे और रिवर्स प्राइमर होते हैं जो एक विशेष जीनोमिक स्थान के लिए एक प्रतिबंध स्थल को फ्लैंक करते हैं (चित्रा 3)। इन प्राइमर सेटों का उपयोग करने वाली प्रतिक्रियाओं की तुलना पाचन दक्षता निर्धारित करने के लिए की जाती है, क्योंकि प्रतिबंध साइट में कटौती होने पर उत्पाद की बहुतायत कम हो जानी चाहिए। क्रोमैटिन संगठन का निर्धारण करने में, एक लोकस से एक परीक्षण प्राइमर को एक अलग जीनोमिक लोकस से दूसरे परीक्षण प्राइमर के साथ जोड़ा जाता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि ये दो लोकी 3 डी स्पेस में एक साथ करीब हैं या नहीं। उस स्थिति में, उम्मीद यह है कि एक पीसीआर उत्पाद केवल टेम्पलेट के रूप में 3 सी नमूने का उपयोग करके पाया जाएगा।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यहां तक कि मान्य प्राइमरों में भी विफल होने की प्रवृत्ति होती है (चित्रा 4: आर 14 प्राइमर सेट)। इसके अलावा, पीसीआर उत्पादों को अक्सर नियंत्रण प्रतिक्रियाओं में और उन प्रतिक्रियाओं में पहचाना जाता है जिनमें क्रोमैटिन कनेक्शन की भविष्यवाणी नहीं की जाती है (जैसे कि पचा हुआ नियंत्रण, क्योंकि यह लिगेट नहीं है)। ये उदाहरण अनुक्रमित होते हैं और या तो सेंगर क्यूसी को विफल करते हैं या परिभाषित अनुक्रम के बिना वापस आते हैं (चित्रा 5)। इसके अतिरिक्त, पारंपरिक 3 सी प्रयोग एक "नियंत्रण टेम्पलेट" उत्पन्न करते हैं, जो एक अनक्रॉस-लिंक्ड, पचा हुआ और लिगेटेड डीएनए नमूना है, जो सभी संभावित लिगेटेड टुकड़ों का प्रतिनिधित्व करता है जिन्हें डीएनए की दी गई मात्रा के साथ उत्पादित किया जा सकता है। "नियंत्रण टेम्पलेट" दो जीनोमिक लोकी के बीच क्यूपीसीआर संकेतों की तीव्रता की तुलना करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि सिग्नल एक सच्ची बातचीत का प्रतिनिधित्व करता है या सिर्फ एक यादृच्छिक संघ है। "नियंत्रण टेम्पलेट" बनाना समस्याग्रस्त हो सकता है, क्योंकि परख किए जा रहे क्रोमैटिन के एक बड़े हिस्से को कृत्रिम गुणसूत्र के रूप में कैप्चर किया जाना चाहिए और 3 सी नमूनों के साथ संसाधित किया जाना चाहिए। इस तरह के निर्माण को सुरक्षित करना संभव नहीं हो सकता है, और एक बनाना एक सेमेस्टर परियोजना के दायरे से बाहर हो सकता है। इन कठिनाइयों के कारण, हम एक नियंत्रण प्राइमर का उपयोग करने का सुझाव देते हैं। नियंत्रण प्राइमर "नियंत्रण टेम्पलेट" की सभी कार्यक्षमता को प्रतिस्थापित नहीं करता है, लेकिन फिर भी "उपस्थिति" या "अनुपस्थिति" निर्धारण करने के लिए डेटा का विश्लेषण करने का अवसर प्रदान करता है।

क्यूपीसीआर करते समय, नमूने की समान मात्रा का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। यह निर्धारित किया जाना चाहिए, भले ही नैनो-स्पेक्ट्रोफोटोमीटर जैसे कि नैनोड्रॉप का उपयोग करके, एक ज्ञात एकाग्रता के जीनोमिक डीएनए से एक मानक वक्र उत्पन्न करके और 3 सी नमूनों को उस लाइन में फिट करके। इन राशियों को दर्ज किया जाना चाहिए और बाद के पीसीआर में उपयोग किया जाना चाहिए। पीसीआर प्रतिक्रिया की गुणवत्ता भी महत्वपूर्ण है। जैसा कि पीसीआर क्यूपीसीआर में चलता है, उत्पाद बहुतायत को प्रतिदीप्ति का उपयोग करके मापा जाता है और दर्ज किया जाता है। यह रिकॉर्डिंग प्रवर्धन प्लॉट में सुलभ है। एक बार कार्यक्रम समाप्त हो जाने के बाद, प्रवर्धन प्लॉट की जांच करना और यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि प्रतिक्रियाओं (नो टेम्प्लेट नियंत्रण को छोड़कर) में तीन चरण हैं: एक बेसलाइन, एक घातीय, और एक पठार / संतृप्ति चरण। यह जांचना महत्वपूर्ण है कि प्रतिक्रियाओं में एक घातीय चरण है, विशेष रूप से दहलीज निर्धारित करने के लिए (नीचे देखें)। इसके अतिरिक्त, क्रमिक रूप से पतला नमूनों के लिए, नमूने के कमजोर पड़ने के अनुरूप सीटी मूल्यों में बदलाव होना चाहिए (उच्चतम एकाग्रता में सबसे कम सीटी मान होंगे, जबकि सबसे कम एकाग्रता में उच्चतम सीटी मान होंगे)। नमूने जो प्रवर्धन प्लॉट में इस परिवर्तन को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं, उन्हें एक नए कमजोर पड़ने की आवश्यकता होती है या 3 सी नमूना गठन के साथ एक बड़े मुद्दे का संकेत मिलता है। अंत में, मानक वक्र उत्पन्न करते समय, पीसीआर सॉफ्टवेयर पीसीआर दक्षता और आर2 मान की गणना करेगा। पीसीआर दक्षता 90% से अधिक होनी चाहिए, और आर2 मान 0.99 से अधिक होना चाहिए। यदि इनमें से कोई भी शर्त पूरी नहीं होती है, तो यह संभावना है कि नमूना या पीसीआर प्राइमरों के साथ कुछ गलत है।

क्यूपीसीआर के बाद, प्रतिशत पाचन और 3 सी इंटरैक्शन की उपस्थिति की गणना प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए क्यूपीसीआर सीटी का उपयोग करके की जा सकती है। इन्हें निर्धारित करने के लिए, सबसे पहले, पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए सीमा निर्धारित की जानी चाहिए। यह आमतौर पर क्यूपीसीआर मशीन के साथ आने वाले सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया जाता है। सीमा निर्धारित करने से पीसीआर उत्पाद की एकाग्रता परिभाषित होगी जिसका उपयोग नमूना सीटी मानों की तुलना करने के लिए किया जाएगा। सीमा को प्रवर्धन के घातीय चरण में पीसीआर प्रतिक्रियाओं के प्रवर्धन वक्रों को विभाजित करना चाहिए। घातीय प्रवर्धन के साथ केवल पीसीआर प्रतिक्रियाओं की तुलना की जा सकती है (इस मामले में, नियंत्रण प्राइमर और परीक्षण प्राइमर प्रतिक्रियाएं), क्योंकि यह सुनिश्चित करने का एकमात्र तरीका है कि प्रतिक्रियाएं डीएनए को एक ही दर से बढ़ा रही हैं और ईमानदारी से तुलना की जा सकती है। 3 सी ग्राफ़ का विश्लेषण करते समय, सशर्त रूप से सकारात्मक प्रतिक्रियाओं को नियंत्रण नमूनों, जीनोमिक नियंत्रण और पाचन नियंत्रण (चित्रा 4 बी) पर अधिक उत्पाद वाले लोगों के रूप में पहचाना जाता है। हालांकि, पीसीआर उत्पाद के जेल शुद्धिकरण के बाद सेंगर अनुक्रमण का उपयोग करके इन नमूनों को और मान्य किया जाना चाहिए।

सेंगर अनुक्रमण के बाद, क्यूसी पास करने वाले नमूनों का विश्लेषण ब्लैट का उपयोग करके किया जा सकता है। इस विश्लेषण का लक्ष्य यह निर्धारित करना है कि क्या नमूने में प्रतिबंध साइट (इस प्रोटोकॉल के मामले में डीपीएनआईआई) के फ्लैंक वाले लक्ष्य जीनोमिक लोकी दोनों का अनुक्रम है। यदि दोनों अनुक्रमों की पहचान की जाती है, तो 3 सी टुकड़े को मान्य माना जा सकता है। यदि ब्लैट के परिणाम अपेक्षित अनुक्रम को वापस नहीं करते हैं, तो यह संकेत दे सकता है कि एक या दोनों प्राइमर इष्टतम नहीं हैं, जिसके परिणामस्वरूप गलत सकारात्मक क्यूपीसीआर परिणाम होता है। झूठे सकारात्मक नमूनों के लिए ट्रेस फ़ाइलों में अपरिभाषित आधार शिखर होंगे, और सेक रिपोर्ट में ज्यादातर "एन" बेस कॉल होंगे।

सेंगर सत्यापन आवश्यक है, क्योंकि कृत्रिम पीसीआर उत्पाद गठन से झूठी सकारात्मकता संभव है। इन झूठे सकारात्मक ों की पहचान तब की जा सकती है जब अनुक्रमण उत्पादों में अपेक्षित लक्ष्य अनुक्रम या उचित 3 सी टुकड़े की डीपीएनआईआई साइट विशेषता नहीं होती है (चित्रा 5)। पीसीआर टुकड़ों का अनुक्रमण प्रयोग के लिए एक और डेटा बिंदु भी प्रदान करता है और छात्रों को बताता है कि 3 सी तकनीक दूर के जीनोमिक लोकी की पहचान कर रही है जो नाभिक के भीतर 3 डी स्पेस में एक साथ आ रहे हैं।

3 सी तकनीक एक लचीली, सीधी प्रक्रिया में स्नातक के लिए मूलभूत आणविक तकनीकों का खजाना प्रदान करती है। यह 3 सी तकनीक अन्य 3 सी तकनीकों के लिए एक लॉन्चिंग पॉइंट भी है जिसमें अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) शामिल हैं। इस प्रकार के प्रयोग जैव सूचना विज्ञान के महत्वपूर्ण पहलुओं के लिए स्नातक को उजागर कर सकते हैं और यहां उल्लिखित बुनियादी सिद्धांतों में निहित हैं। स्नातक अनुभव और भागीदारी युवा वैज्ञानिकों के रूप में उनकी सफलता और विकास की कुंजी है। इन अवसरों को प्रदान करके, स्नातक अत्याधुनिक तकनीकों और प्रश्नों से निपटने के लिए अपने आत्मविश्वास का निर्माण करते हुए बुनियादी सिद्धांतों की अपनी समझ को मजबूत कर सकते हैं।

Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को अनुदान संख्या P20GM103430 और ब्रायंट सेंटर ऑफ हेल्थ एंड बिहेवियरल साइंसेज के तहत नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज से रोड आइलैंड इंस्टीट्यूशनल डेवलपमेंट अवार्ड (आईडीईए) नेटवर्क ऑफ बायोमेडिकल रिसर्च एक्सीलेंस द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% Formaldehyde  Millapore-Sigma F8775
100% Ethanol Millapore-Sigma E7023
CaCl2 MP Biomedical 215350280
chloroform Millapore-Sigma C0549
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Millapore-Sigma COEDTAF-RO mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh
Dithiothreitol (DTT) Millapore-Sigma D0632 1 M stock diluted to 500 µM in Sucrose buffer and GB buffer fresh
DpnII NEB R0543M
Glycerol Millapore-Sigma G9012
glycine Millapore-Sigma G8898
glycogen Millapore-Sigma 10901393001
HEPES Millapore-Sigma H3375
KCl Millapore-Sigma P3911
KH2PO4 Millapore-Sigma P5655
methyl green pyronin   Millapore-Sigma HT70116
MgAc2 Thermoscientific 1222530
Na2HPO4 Millapore-Sigma S5136
NaCl Millapore-Sigma S9888
phenol-chloroform  Millapore-Sigma P3803
Pronase Millapore-Sigma 11459643001
Proteinase K IBI Scientific IB05406
qPCR Ready mix (Phire Taq etc) Millapore-Sigma KCQS07
RNase A  Millapore-Sigma R6148
Sodium Acetate Millapore-Sigma S2889
sodium dodecyl sulfate (SDS) Millapore-Sigma L3771
Sucrose Millapore-Sigma S0389
T4 DNA Ligase Promega M1804
Tris-HCl Millapore-Sigma 108319
Triton X-100 Millapore-Sigma T9284
Trypsin-EDTA  Millapore-Sigma T4049

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जेनेटिक्स अंक 195
3 सी के साथ ए प्राप्त करना: अंडरग्रेजुएट्स के लिए क्रोमोसोम अनुरूपता कैप्चर।
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Joniec, A., Leszczynski, J., Ndoye,… More

Joniec, A., Leszczynski, J., Ndoye, S., Sylvia, J., Weicksel, S. E. Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates. J. Vis. Exp. (195), e65213, doi:10.3791/65213 (2023).

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