Summary
Qui, presentiamo un adattamento della tecnica di cattura della conformazione cromosomica (3C) in dettaglio con particolare attenzione al coinvolgimento e all'apprendimento universitario.
Abstract
La cattura della conformazione cromosomica (3C) è un potente strumento che ha generato una famiglia di tecniche simili (ad esempio, Hi-C, 4C e 5C, indicate qui come tecniche 3C) che forniscono informazioni dettagliate sull'organizzazione tridimensionale della cromatina. Le tecniche 3C sono state utilizzate in una vasta gamma di studi, dal monitoraggio dei cambiamenti nell'organizzazione della cromatina nelle cellule tumorali all'identificazione dei contatti enhancer effettuati con i promotori genici. Mentre molti degli studi che utilizzano queste tecniche pongono grandi domande a livello di genoma con tipi di campioni complessi (cioè analisi a singola cellula), ciò che spesso si perde è che le tecniche 3C sono basate su metodi di biologia molecolare di base applicabili a una vasta gamma di studi. Affrontando questioni strettamente focalizzate sull'organizzazione della cromatina, questa tecnica all'avanguardia può essere utilizzata per migliorare l'esperienza di ricerca universitaria e di laboratorio di insegnamento. Questo documento presenta un protocollo 3C e fornisce adattamenti e punti di enfasi per l'implementazione presso istituzioni principalmente universitarie in esperienze di ricerca e insegnamento universitarie.
Introduction
Il genoma di un organismo non solo contiene tutti i geni necessari per la funzione, ma anche tutte le istruzioni su come e quando usarli. Ciò rende la regolazione dell'accesso al genoma una delle funzioni più importanti della cellula. Ci sono molti meccanismi per controllare la funzione genica; tuttavia, al suo livello di base, la regolazione genica si riduce alla capacità dei fattori di trascrizione regolatori (trans-fattori) di legarsi alle loro specifiche sequenze di DNA (sequenze cis-regolatorie). Questa non è un'abilità innata; Invece, è governato dall'organizzazione/struttura del genoma nel nucleo, che controlla la disponibilità/esposizione delle sequenze cis-regolatorie ai trans-fattori 1,2,3. Se i trans-fattori non riescono a trovare le loro sequenze cis-regolatorie, allora i trans-fattori non possono svolgere i loro compiti regolatori. Ciò ha reso la comprensione di come i genomi sono organizzati nel nucleo un'importante fonte di indagine.
È ampiamente accettato che durante l'interfase, i cromosomi eucariotici nel nucleo occupano il proprio dominio ancorato alla lamina nucleare e alla matrice nucleare (Figura 1), rendendo così il cromosoma più simile a una fetta di pizza, piuttosto che a una tagliatella su un piatto di spaghetti. I cromosomi sono parzialmente condensati da interazioni proteina-DNA (cromatina) che torcono e ciclizzano porzioni del cromosoma. Attraverso la microscopia elettronica, l'ibridazione tridimensionale in situ con fluorescenza del DNA (FISH) e le tecniche di marcatura del DNA (cioè metilazione del DNA fluorescente e artificiale), i domini inattivi della cromatina sono stati trovati impacchettati strettamente lungo la periferia nucleare 4,5,6, mentre porzioni di cromatina attiva e meno condensata si trovano all'interno del nucleo 7,8,9, 10. Questi esperimenti forniscono una visione grandangolare della dinamica cromosomica, ma fanno poco per catturare i cambiamenti che si verificano localmente intorno ai promotori genici osservati negli studi DNasi11,12 e nucleosoma13,14,15.
La chiave per sbloccare la dinamica della cromatina ad alta risoluzione è stata la formulazione della tecnica di mappatura cromosomica 3D, 3C. La tecnica 3C comprende quattro fasi principali: reticolazione della cromatina, digestione della cromatina mediante enzimi di restrizione, legatura della cromatina e purificazione del DNA (Figura 2). I nuovi frammenti di DNA artificiale generati da questo processo possono quindi essere caratterizzati per rivelare la stretta associazione fisica tra pezzi linearmente distanti di DNA16. La tecnica 3C è diventata la base per la creazione di molteplici tecniche spin-off che utilizzano i passaggi iniziali di 3C per porre domande più ampie sull'intero genoma (ad esempio, Hi-C, 4C, ChIP-C). Questa famiglia di tecniche 3C ha identificato che i cromosomi sono organizzati in più unità discrete chiamate domini topologicamente associati (TAD). I TAD sono codificati nel genoma e sono definiti da anelli di cromatina affiancati da confini non looped16,17,18,19. I confini del TAD sono mantenuti da due fattori evolutivamente conservati e ubiquitari, tra cui il fattore di legame CCCT (CTCF) e la coesione, che impediscono ai circuiti all'interno di TAD separati di interagire16,20. I loop sono mediati dall'interazione dei fattori trans con le loro sequenze regolatorie, nonché dalla CTCF e dalla coesione21.
Sebbene molti studi che utilizzano tecnologie 3C pongano ampie domande sull'intero genoma e impieghino complicate tecniche di raccolta dei campioni, la formulazione della tecnica 3C si basa su tecniche di biologia molecolare di base. Ciò rende 3C intrigante per l'implementazione sia nella ricerca universitaria che nei laboratori didattici. La tecnica 3C può essere impiegata per domande focalizzate più piccole ed è intrinsecamente flessibile al ridimensionamento verso l'alto o verso il basso (singoli geni22, cromosomi16 e / o genomi18) a seconda del focus e della direzione delle domande poste. Questa tecnica è stata applicata anche a una vasta gamma di sistemi modello 7,16,19,23 e si è dimostrata versatile nel suo utilizzo. Ciò rende 3C una tecnica eccellente per gli studenti universitari in quanto gli studenti possono acquisire esperienza nelle comuni tecniche di biologia molecolare e allo stesso tempo acquisire una preziosa esperienza nel rispondere a domande dirette.
Presentato qui è un protocollo adattato per la preparazione della libreria 3C basato sui protocolli precedentemente pubblicati24,25,26,27. Questo protocollo è stato ottimizzato per circa 1 × 107 celle, sebbene abbia generato librerie 3C con un minimo di 1 × 105 celle. Questo protocollo ha dimostrato di essere versatile ed è stato utilizzato per generare librerie 3C da embrioni di zebrafish, linee cellulari di zebrafish e Caenorhabditis elegans (nematodi) giovani adulti (YA). Il protocollo dovrebbe essere appropriato anche per le linee cellulari di mammifero e, con un ulteriore adattamento, per il lievito.
L'obiettivo di questi adattamenti è quello di rendere 3C più accessibile per gli studenti universitari. È stata prestata attenzione a utilizzare tecniche simili a quelle che possono essere realizzate in un laboratorio didattico universitario. La tecnica 3C offre molte opportunità di apprendimento per gli studenti universitari per apprendere tecniche di biologia molecolare di base che andranno a beneficio del loro sviluppo al banco, in classe e nei loro sforzi dopo la laurea.
Protocol
1. Design del primer
NOTA: Gli strumenti di progettazione dei primer 3C sono disponibili online28. In alternativa, i primer personalizzati possono essere progettati dagli studenti (vedi sotto).
- Identificazione delle posizioni dei primer
- Aprire UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/), selezionare l'organismo di studio e cercare la regione del genoma da valutare utilizzando 3C.
- Nella finestra successiva, attiva la traccia enzimatica nella scheda Mappatura e sequenziamento sotto il browser facendo clic su Enzimi Restr.
- Immettere gli enzimi di restrizione da utilizzare e impostare la modalità di visualizzazione su pack. Fai clic su Invia.
- Nelle opzioni Variazione e Ripetizioni, assicuratevi che RepeatMasker sia impostato su Densa.
- Utilizzando i siti di restrizione come guide, identifica i siti di interesse non all'interno delle regioni di ripetizione mascherate (barre nere). Evidenziate 300 coppie di basi (bp) che fiancheggiano sia la sequenza a monte che a valle che circonda il sito di restrizione facendo clic sulla posizione ( traccia più in alto) e trascinando fino alla lunghezza desiderata (~600 bp).
- Rilascia il mouse e apparirà una finestra pop-up. Prendi nota della posizione genomica, fai clic su Ingrandisci e lascia che il browser si adatti nuovamente alla selezione.
- Passare il mouse sulla scheda Visualizza sulla barra multifunzione superiore del browser e, nel menu a discesa, selezionare DNA.
- Lascia l'opzione predefinita, nota la designazione delle sequenze mascherate (c'è un'opzione per renderle N). Clicca su ottieni DNA.
- La sequenza evidenziata verrà quindi visualizzata nella finestra. Copiate e incollate questa sequenza in Primer3 (https://primer3.ut.ee/).
- Utilizzando le impostazioni predefinite di Primer3, generare primer facendo clic su Scegli primer.
- Nei risultati, prendere nota della posizione dell'enzima di restrizione e selezionare primer che creano un prodotto PCR da 200-500 bp con il sito di restrizione situato nel mezzo.
- Seguendo questi passaggi, progetta i primer di prova 1 kilobase (kb), 2 kb, 5 kb, 10 kb e 20 kb dai siti di interesse.
- Per progettare i primer di controllo dell'input, ripetere questi passaggi per un sito a 1-2 kB dal sito di interesse che manca di un sito di restrizione, il che significa che non viene mai tagliato.
- Validazione del primer funzionale
- Per convalidare la funzionalità del primer, impostare le reazioni PCR utilizzando concentrazioni di primer titolate e DNA genomico purificato. Attraverso mezzi quantitativi o semi-quantitativi, determinare se i primer creano il prodotto atteso.
- Riprogettare i primer che non superano la convalida.
2. Giorno 1
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa (congelato a -20 °C) dopo la reticolazione della cromatina e dopo la raccolta dei nuclei. I passi richiedono, in media, 5-6 ore con gli studenti universitari.
- Collezione di nuclei di C. elegans (adattata da Han et al.29)
- Reticolazione della cromatina
- Raccogliere 5.000 vermi YA in 30 ml di terreno M9 in un tubo conico da 50 ml e centrifugare a 400 × g per 2 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Lavare il pellet di verme 3 volte di più con M9 per rimuovere i batteri.
- Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet di verme in 47,3 mL di M9 contenente 2,7 mL di formaldeide al 37% (2% finale) e incubare con agitazione (oscillazione o nutazione) per 30 minuti a RT.
ATTENZIONE: Maneggiare la formaldeide con cura e lavorare sotto una cappa aspirante con adeguati dispositivi di protezione individuale (camice DPI-laboratorio, guanti adeguati e protezione degli occhi). La formaldeide è un irritante che colpisce gli occhi, il naso, la gola e i polmoni. - Girare i vermi a 400 × g per 2 minuti a RT.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di verme in 50 ml di glicina 1 M. Girare i vermi a 400 × g per 2 minuti a RT.
- Collezione Nuclei
- Risospendere il pellet di verme in 6 mL di tampone NP refrigerato (50 mM HEPES a pH 7,5, 40 mM NaCl, 90 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1% Tween 20, 0,2 mM DTT, 0,5 mM spermidina, 0,25 mM spermina, 1x inibitore completo della proteasi).
- Trasferire la sospensione a vite senza fine in un Dounce da 7 mL su ghiaccio. Riduci il campione 15 volte e tieni premuto il ghiaccio per 5 minuti.
- Trasferire la sospensione a vite senza fine in un Dounce aderente da 7 mL su ghiaccio. Riduci il campione 20 volte e tieni premuto il ghiaccio per 5 minuti.
- Trasferire la sospensione a vite senza fine in un tubo conico pulito da 15 mL e aggiungere il tampone NP a 10 mL in totale (circa 4 mL).
- Vortice la sospensione del verme su un'impostazione elevata per 30 s. Incubare il campione su ghiaccio per 5 minuti.
- Ripetere il passaggio precedente.
- Ruotare la sospensione a vite senza fine a 100 × g per 5 minuti a 4 °C.
- Trasferire il surnatante in un tubo conico fresco da 15 ml.
- Controllare il campione per i detriti del verme. Visualizza 10 μL del campione con un microscopio ottico. Se sono presenti detriti di vermi, ruotare il campione a 2.000 × g per 5 minuti a 4 °C, risospendere il pellet in un nuovo tampone NP da 10 ml e ruotare nuovamente il campione a 100 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il pellet, controllare il surnatante per i detriti di vermi e ripetere fino a quando il campione è privo di detriti di vermi.
NOTA: In alternativa, i detriti del verme possono anche essere rimossi filtrando il campione attraverso un filtro cellulare da 40 μm (6x) seguito da un filtro cellulare da 20 μm (6x). - Se il campione è privo di detriti di vermi, prelevare 5 μL del campione, aggiungere 5 μL di pironina verde metile (i nuclei saranno blu) e contare i nuclei con un emocitometro.
- Centrifugare il campione a 2.000 × g per 5 minuti a 4 °C
- Rimuovere il surnatante, posizionare i campioni sul ghiaccio e procedere; in alternativa, congelare i nuclei e conservare a -80 °C.
- Reticolazione della cromatina
- Digestione della cromatina
- Risospendere i nuclei in 450 μL di acqua pulita. Trasferire i nuclei in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 ml.
- Al campione reticolato, aggiungere 60 μL di tampone enzimatico di restrizione 10x DpnII e mescolare bene.
NOTA: Possono essere utilizzati altri enzimi di restrizione che ancora tagliano il DNA reticolato. - Aggiungere 15 μL di sodio dodecilsolfato (SDS) al 10% per permeabilizzare i nuclei e incubare con agitazione (oscillazione o nutazione) a 37 °C per 1 ora.
ATTENZIONE: SDS è irritante ed è tossico se ingerito o assorbito attraverso la pelle. Maneggiare con cura e utilizzare DPI adeguati (camice da laboratorio, guanti adeguati e protezione per gli occhi). - Dissetare la SDS aggiungendo 75 μL di Triton X-100 al 20% e incubando agitando a 37 °C per 1 ora.
- Prelevare 10 μL dal campione come controllo non digerito. Conservare a 4 °C.
- Aggiungere 400 U di DpnII e incubare a 37 °C per una notte agitando.
3. Giorno 2
NOTA: In media, gli studenti universitari impiegano 5 ore per completare questi passaggi.
- Digestione della cromatina
- Aggiungere altri 200 U di DpnII e incubare i campioni per 4 ore a 37 °C agitando per garantire la completa digestione del campione reticolato.
- Prelevare un'aliquota di 10 μL dai campioni come controllo della digestione.
- Inattivare a caldo l'enzima di restrizione incubando il campione per 20 minuti a 65 °C (o secondo le istruzioni del produttore). Continuare con il passaggio 2.1.3.
- Se l'enzima non può essere inattivato dal calore, aggiungere 80 μL di SDS al 10% e incubare il campione per 30 minuti a 65 °C. Quindi, aggiungere 375 μL di Triton X-100 al 20% e mescolare ruotando. Incubare il campione per 1 ora a 37 °C e continuare con il punto 2.2.
- Legatura della cromatina
- Trasferire il campione in un tubo conico pulito da 50 ml, regolare il volume del campione a 5,7 mL con H2O di grado molecolare e mescolare ruotando.
- Aggiungere 700 μL di tampone 10x T4 ligasi e mescolare agitando.
- Aggiungere 60 U di T4 DNA ligasi e mescolare roteando.
- Incubare per una notte a 16 °C.
4. Giorno 3
NOTA: In media, gli studenti universitari impiegano 15-30 minuti per completare questi passaggi. Dopo l'incubazione notturna, i campioni possono essere congelati.
- Digestione delle proteine e reticolazione inversa
- Aggiungere 30 μL di proteinasi K (10 mg/ml) al campione 3C e incubare a 65 °C durante la notte agitando. Aggiungere 5 μL di proteinasi K (10 mg/ml) al controllo non digerito e digestione e incubare a 65 °C durante la notte agitando.
5. Giorno 4
NOTA: In media, gli studenti universitari impiegano 4-5 ore per completare questi passaggi.
- Purificazione della libreria 3C
- Aggiungere 30 μL di RNasi A (10 mg/ml) al campione 3C e agitare per miscelare. Incubare il campione per 45 minuti a 37 °C.
- Aggiungere 7 ml di fenolo-cloroformio al campione e mescolare agitando.
ATTENZIONE: Il fenolo-cloroformio è irritante per la pelle e gli occhi e può causare ustioni se il contatto non viene trattato. Il fenolo-cloroformio deve essere usato in una cappa aspirante con un'adeguata protezione per gli occhi e guanti (nitrile). - Centrifugare il campione per 15 minuti a 3.270 × g a RT. Raccogliere la fase acquosa e trasferire in un tubo conico pulito da 50 ml. Aggiungere volumi uguali di cloroformio e mescolare il campione agitando.
- Centrifugare il campione per 15 minuti a 3.270 × g a RT. Raccogliere la fase acquosa e trasferire in un tubo conico pulito da 50 ml. Aggiungere 7,5 ml di H2O di grado molecolare, 35 ml di etanolo al 100% e (opzionale) 7 μL di glicogeno (1 mg/ml). Mescolare agitando e incubare a -80 °C fino a congelamento del campione.
NOTA: può richiedere 1 ora o più per il congelamento del campione. Il protocollo può essere messo in pausa qui.- Mentre il campione 3C si congela, purificare i campioni di controllo. Ai campioni di controllo, regolare il volume a 500 μL utilizzando acqua di grado molecolare e aggiungere 2 μL di miscela di RNasi A (10 mg/ml) facendo scorrere il tubo.
- Ruotare brevemente per raccogliere il campione sul fondo del tubo. Incubare i campioni per 45 minuti a 37 °C.
- Ai campioni di controllo, aggiungere 1 mL di fenolo-cloroformio e mescolare agitando i tubetti. Centrifugare il campione per 15 minuti a 3.270 × g a RT. Raccogliere la fase acquosa dei controlli e metterli in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 ml.
- Aggiungere volumi uguali di cloroformio e mescolare il campione agitando. Centrifugare il campione per 15 minuti a 3.270 × g a RT. Raccogliere la fase acquosa dei controlli e metterli in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 ml.
- Aggiungere 1 mL di etanolo al 100% e 2 μL di glicogeno (1 mg/ml). Mescolare agitando e incubare a -80 °C per 30 minuti.
- Centrifugare il campione per 15 minuti a 3.270 × g a 4 °C. Rimuovere il surnatante e aggiungere 750 μL di etanolo refrigerato al 70%.
- Centrifugare il campione per 10 minuti a 3.270 × g a 4 °C. Rimuovere il surnatante e asciugare all'aria i campioni. Risospendere il pellet in 50 μL di H2O di grado molecolare. Congelare o continuare con il punto 6.
- Centrifugare il campione per 60 minuti a 3.270 × g a 4 °C. Rimuovere il surnatante e aggiungere 10 ml di etanolo refrigerato al 70%. Interrompere e rompere il pellet di DNA agitando il campione per mescolare.
- Centrifugare il campione per 30 minuti a 3.270 × g a 4 °C. Rimuovere il surnatante e lasciare asciugare parzialmente il campione all'aria di RT. Risospendere il pellet in 150 μL di 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) mediante pipettaggio su e giù. Questa è la "Libreria 3C".
NOTA: congelare il campione o continuare con l'analisi.
6. Giorno 5
NOTA: In media, gli studenti universitari impiegano 1-2 ore per completare questi passaggi.
- Determinazione della qualità del campione utilizzando la curva standard del primer di controllo
- Quantificare la concentrazione di DNA per il campione 3C e tutti i controlli e regolare i campioni a 30 μg/μL (se le concentrazioni lo consentono). In serie i campioni diluiti due volte quattro volte, ottenendo cinque diluizioni per ciascun campione (1x, 0,5x, 0,25x, 0,125x, 0,0625x).
NOTA: se la quantificazione non può essere eseguita facilmente, diluire in serie i campioni come indicato sopra e procedere. - Impostare le reazioni PCR per il 3C, il controllo genomico e il controllo digerito per ogni campione diluito con i primer di controllo: 1 μL di DNA, 10 μL di tampone di reazione 5x, 1 μL di 10 mM dNTPs, 1 μL di primer di controllo 10 mM (misto avanti e inverso), 1 μL di Taq polimerasi e 36 μL di acqua.
- Seguendo le istruzioni per il software specifico per la macchina PCR, impostare il programma PCR a curva standard utilizzando le condizioni di ciclo come segue: 30 s a 98 °C; 30 cicli di 5 s a 98 °C, 5 s a 60 °C e 10 s a 72 °C; 1 min a 72 °C; Mantenimento a 4 °C.
- Utilizzando il software, generare le curve standard per i campioni. Dopo che il software ha generato la curva, prendere nota dell'efficienza PCR e del valore R2 .
- Quantificare la concentrazione di DNA per il campione 3C e tutti i controlli e regolare i campioni a 30 μg/μL (se le concentrazioni lo consentono). In serie i campioni diluiti due volte quattro volte, ottenendo cinque diluizioni per ciascun campione (1x, 0,5x, 0,25x, 0,125x, 0,0625x).
- Determinazione della concentrazione di DNA
- Per determinare la concentrazione di DNA dei campioni 3C, confrontare i campioni con un campione di DNA genomico di concentrazione nota. Diluire i campioni a 30 ng/μL e diluire serialmente il controllo genomico da 10 ng/μL a 0,01 ng/μL in due fasi per creare una curva standard.
NOTA: se la quantificazione non può essere eseguita facilmente, diluire il campione 1:10 e procedere. - Impostare le reazioni PCR per il 3C, il controllo genomico e il controllo digerito per ogni campione diluito con i primer di controllo: 1 μL di DNA, 10 μL di tampone di reazione 5x, 1 μL di 10 mM dNTPs, 1 μL di primer di controllo 10 mM (misto avanti e inverso), 1 μL di Taq polimerasi e 36 μL di acqua.
- Seguendo le istruzioni per il software specifico per la macchina PCR, impostare il programma PCR a curva standard utilizzando le condizioni di ciclo come segue: 30 s a 98 °C; 30 cicli di 5 s a 98 °C, 5 s a 60 °C e 10 s a 72 °C; 1 min a 72 °C; Mantenimento a 4 °C.
- Utilizzando il software, generare le curve standard per i campioni, tracciando i campioni 3C sulla curva. Confrontare la posizione dell'abbondanza del campione 3C con la curva standard creata dalle reazioni del DNA genomico di concentrazione nota e regolare i campioni 3C a 30 ng / μL.
- Per determinare la concentrazione di DNA dei campioni 3C, confrontare i campioni con un campione di DNA genomico di concentrazione nota. Diluire i campioni a 30 ng/μL e diluire serialmente il controllo genomico da 10 ng/μL a 0,01 ng/μL in due fasi per creare una curva standard.
- Determinazione della presenza o assenza di interazione della cromatina
- Impostare le reazioni qPCR con 30 ng del campione 3C, campione di controllo genomico e campione di controllo digerito: 1 μL di DNA, 10 μL di tampone di reazione 5x, 1 μL di 10 mM dNTPs, 1 μL di 10 mM primer (misto avanti e inverso), 1 μL di Taq polimerasi e 36 μL di acqua.
NOTA: Le reazioni devono essere impostate utilizzando il primer di controllo, i primer di prova per i singoli loci genomici e le combinazioni desiderate dei primer di prova (sito "a" in avanti e sito "b" inverso) utilizzati per determinare l'interazione della cromatina (Figura 3). - Seguendo le istruzioni per il software della macchina PCR, impostare il programma PCR come segue: 30 s a 98 °C; 40 cicli di 5 s a 98 °C, 5 s a 60 °C e 10 s a 72 °C; 1 min a 72 °C; Mantenimento a 4 °C.
- Dopo aver eseguito la PCR, ispezionare il grafico di amplificazione. Assicurarsi che le reazioni PCR mostrino un'amplificazione esponenziale, raddoppiando ogni ciclo.
NOTA: Le reazioni che non mostrano amplificazione esponenziale non possono essere analizzate ulteriormente. - Seguendo le istruzioni per il software della macchina PCR, definire la soglia dell'esperimento qPCR.
- Esportare i valori Ct per tutti i campioni.
- Determinare l'efficienza della digestione utilizzando i valori Ct del primer di prova (TP) e del primer di controllo (CP) dai campioni di controllo non digerito (UC) e di controllo digerito (DC) utilizzando l'equazione (1).
Percentuale digerita = 100 -
(1) - Questi valori dovrebbero essere nell'intervallo 80% -90% digestione. Registrare questi valori (Figura 4A).
- Determinare l'interazione relativa della cromatina utilizzando i valori Ct della combinazione di primer di prova (TPC) e del primer di controllo (CP) dal controllo non digerito (UC) e dai campioni 3C (3C) utilizzando l'equazione (2).
Interazione cromatina = 100 -
(2) - Tracciare i valori per ogni campione su un grafico a barre per ogni combinazione di primer di prova.
- Confrontare il segnale dei campioni 3C con i campioni di controllo per determinare se il campione 3C ha arricchimento di una particolare interazione cromatinica rispetto ai campioni di controllo. I campioni 3C che mostrano un arricchimento rispetto al controllo possono essere considerati condizionalmente positivi e richiedono la convalida utilizzando il sequenziamento Sanger (Figura 4B).
NOTA: Quando si analizzano i dati del grafico, è importante ricordare che, a meno che non venga utilizzato un "modello di controllo" (vedi discussione), l'abbondanza tra le reazioni (cioè da una serie di primer all'altra) non può essere confrontata.
- Impostare le reazioni qPCR con 30 ng del campione 3C, campione di controllo genomico e campione di controllo digerito: 1 μL di DNA, 10 μL di tampone di reazione 5x, 1 μL di 10 mM dNTPs, 1 μL di 10 mM primer (misto avanti e inverso), 1 μL di Taq polimerasi e 36 μL di acqua.
- Identificazione dei prodotti 3C
- Eseguire i prodotti PCR su un gel di agarosio all'1,5%.
- Visualizza il gel per le dimensioni corrette dei prodotti PCR utilizzando una scatola di luce UV o un sistema di documentazione del gel.
NOTA: Le librerie 3C ben costruite conterranno una vasta gamma di frammenti di DNA e, nonostante la precedente convalida dei primer per la specificità, le reazioni PCR delle librerie 3C hanno il potenziale per contenere molte bande (Figura 5A). Ciò non impedisce l'analisi delle librerie 3C. - Eliminare le bande di prodotto corrispondenti alla dimensione prevista del frammento ed eseguire l'estrazione in gel dei prodotti PCR seguendo le istruzioni di un kit commerciale o il protocollo fatto in casa descritto di seguito.
ATTENZIONE: la luce UV è un noto cancerogeno e occorre prestare molta attenzione per limitare il tempo di esposizione alla luce UV. È necessario indossare una protezione per gli occhi resistente ai raggi UV, uno scudo per campioni, guanti e un camice da laboratorio.- Per costruire una cartuccia di purificazione fatta in casa, praticare un foro sul fondo di un tubo da 0,5 ml con un ago.
- Imballare una piccola quantità di cotone da un batuffolo di cotone sul fondo del tubo da 0,5 ml, riempiendo non più della metà del tubo.
- Posizionare il tubo da 0,5 mL in un tubo da 1,5 ml; Assicurarsi che il tubo più piccolo poggi sul labbro del tubo più grande, non nel tubo.
- Tagliare con cura un frammento di gel in pezzi più piccoli e posizionarlo nel tubo da 0,5 ml della cartuccia.
- Mettere il gruppo in un congelatore a -20 °C per 5 minuti. Ruotare l'assieme per 3 minuti a 13.000 × g a RT.
- Conservare il tubo da 1,5 ml con il DNA estratto in tampone e smaltire il tubo da 0,5 ml contenente i detriti di agarosio.
- Il DNA purificato può essere inviato per il sequenziamento Sanger utilizzando primer avanti e indietro per il frammento 3C.
- Identificazione dei contatti della cromatina mediante Blat
- Al termine del sequenziamento, determinare se i campioni soddisfano gli standard di controllo della qualità indicati nel rapporto di sequenziamento.
- Per le sequenze che passano il controllo qualità, aprite i file .seq e .ab1 (trace) in un programma di editing di sequenziazione come Another Plasmid Editor (ApE), controllate il file .ab1 per rilevare la presenza di picchi di chiamata di base chiari e modificate i picchi erroneamente richiamati nel file .seq.
- Utilizzando il file .seq modificato, cercare il sito DpnII. A seconda del risultato della sequenza, questo dovrebbe essere a metà della sequenza riportata.
- Per determinare se la sequenza è la sequenza target attesa, evidenziare il sito DpnII e ulteriori 30-50 bp della sequenza a monte corrispondenti al primer in avanti dei loci genomici testati per 3C. Eseguire una ricerca Blat di questa sequenza contro la specie bersaglio. Assicurati che i loci genomici corrispondano a quelli del primer.
- Ripeti il passaggio precedente per la sequenza di primer inverso, assicurandoti che il locus genomico restituito corrisponda a quello del primer inverso.
(1)
(2)Representative Results
Questa procedura produrrà un campione sperimentale 3C e due campioni di controllo (non digeriti e digeriti). Utilizzando questi tre campioni, è stata eseguita la qPCR. Da questi risultati, l'efficienza della digestione è stata calcolata (equazione 1) e registrata (Tabella 1). Da questi calcoli, è stato determinato che il campione 3C aveva un'efficienza di digestione di circa l'88% (media della Tabella 1) nei sette loci genomici testati.
Successivamente, i campioni sono stati testati per la presenza di contatti cromatinici a lungo raggio tra i diversi loci genomici utilizzando combinazioni di primer loci-specifici (Tabella 2) e qPCR. Utilizzando questi risultati, sono state calcolate le abbondanze del prodotto relative a un set di primer di controllo (equazione 2) e rappresentate graficamente per il confronto (Figura 4). Questi dati hanno indicato che 8 delle 10 reazioni erano positive condizionali per interazioni a lungo raggio.
Le reazioni PCR sono state quindi eseguite su un gel di agarosio. Il prodotto PCR atteso per gli otto positivi condizionali e una reazione negativa è stato purificato con gel e inviato per il sequenziamento Sanger. Vengono mostrati i risultati per le reazioni rappresentative positive (freccia blu, riquadro blu) e negative (freccia rossa, riquadro rosso) (Figura 5).
Figura 1: Struttura cromosomica nel nucleo. Ipotetica organizzazione cromosomica all'interno del nucleo. (A) Involucro nucleare, linee nere; B) lamina nucleare, arancione; C) eterocromatina, linee compattate; D) eucromatina, anelli sciolti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Schema del protocollo 3C. Porzioni distanti di cromosomi lineari (blu, giallo e rosa) sono avvicinate all'interno del nucleo attraverso cicli regolatori. (A) Le strutture ad anello sono mediate da fattori di trascrizione (cerchio grigio e stella nera); Queste interazioni sono preservate attraverso la reticolazione chimica. (B) I loop sono interrotti attraverso la digestione enzimatica (linee nere). (C) I pezzi di cromatina distanti sono legati insieme attraverso le estremità attaccanti create dalla digestione. (D) Il DNA è purificato dalle proteine. (E) La sequenza all'interno dei frammenti viene identificata e mappata fino al genoma. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Lo schema di primer 3C. I primer 3C sono progettati attorno a siti di restrizione a distanze variabili dalla posizione genomica di interesse. Le frecce rosa rappresentano i set di primer sperimentali che circondano un sito DpnII. I primer sperimentali possono essere miscelati e abbinati per valutare il ciclo della cromatina nella regione. I primer arancioni rappresentano un controllo negativo senza un sito DpnII. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Dati qPCR rappresentativi per un esperimento 3C. Abbondanza relativa dei set di primer per test 3C. (A) Grafico di controllo che mostra l'abbondanza relativa del prodotto nel campione di controllo non digerito (blu), di controllo digerito (grigio) e 3C (arancione). (B) L'esperimento 3C; l'abbondanza relativa del prodotto da combinazioni di primer di prova nel controllo non digerito (blu), controllo digerito (grigio) e campione 3C (arancione). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Visualizzazione dei prodotti 3C qPCR. In alto, gel con i prodotti endpoint qPCR con i campioni indicati. In basso, file di traccia della sequenza Sanger rappresentativi per le reazioni indicate. Il campione arancione è un esempio di falso positivo (vedi Figura 4, r38/34), e il campione blu è un esempio di un vero positivo con il sito DpnII indicato sopra la traccia. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Sito | % digestione |
| R8 · | 86.98 |
| R3 | 88.44 |
| R38 | 89.64 |
| R34 | 87.55 |
| R33 | 87.85 |
| R14 | 86.97 |
| R47 | 89.45 |
Tabella 1: Efficienza di digestione calcolata.
| Nome | Sequenza | Loci genomici | ||
| r3 FWD | ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC | chrX:11361475 | ||
| R3 RVS | TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC | chrX:11361561 | ||
| r38 FWD | TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC | chrX:5859700 | ||
| R38 RVS | AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG | chrX:5859775 | ||
| r34 FWD | ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG | chrX:5429702 | ||
| R34 RVS | AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC | chrX:5429777 | ||
| r33 FWD | AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC | chrX:6296704 | ||
| R33 RVS | TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG | chrX:6296807 | ||
| r14 FWD | AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG | chrX:8036367 | ||
| r14 RVS | ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTC | chrX:8036427 | ||
| r47 FWD | ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC | chrX:9464939 | ||
| r47 RVS | AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC | chrX:9465064 | ||
| r8 FWD | GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG | chrX:11094257 | ||
| R8 RVS | TTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACC | chrX:11094362 | ||
| Primer di controllo FWD | CAATCGTCTCGCTCACTTGTC | chrX:7608049 | ||
| Primer di controllo RVS | GATGTGAGCAACAAGGCACC | chrX:7608166 | ||
Tabella 2: Primer per l'esperimento rappresentativo 3C.
Discussion
Il 3C è una tecnica potente che affonda le sue radici nelle tecniche molecolari di base. È questa base di strumenti fondamentali che rende 3C una tecnica così intrigante da utilizzare con gli studenti universitari. Con così tanti studi recenti che osservano la dinamica della cromatina su una scala così ampia, l'utilizzo di questi risultati per ideare un esperimento focalizzato su un singolo gene o regione genomica ha il potenziale per creare un esperimento unico e di impatto nella ricerca universitaria. Spesso, esperimenti come questi sono considerati troppo avanzati per gli studenti universitari, ma con un'attenta pianificazione, sono facilmente realizzabili. È importante notare che i saggi progettati per sondare le connessioni della cromatina catturate dalla libreria 3C possono variare dalla PCR semi-quantitativa dell'endpoint al sequenziamento dell'intero genoma. Infatti, i dati del primo documento 3C16 sono stati generati da qPCR. Questa vasta gamma di saggi può essere utilizzata perché tutte le tecnologie 3C producono lo stesso prodotto: una libreria di frammenti di DNA che rappresentano le connessioni 3D nel nucleo.
Presentato qui è un adattamento di un protocollo più flessibile e accomodante che si adatta meglio ai ricercatori universitari. I periodi di pausa sopra elencati implicano ritardi notturni; Tuttavia, queste pause possono estendersi durante i fine settimana e, nel caso delle cellule e dei nuclei, per settimane. La considerazione più cruciale è quando il lavoro sarà fatto. Spesso nei protocolli, ci sono passaggi sensibili al tempo quando la pausa non è un'opzione. Al di fuori di alcuni punti (giorno 1 e giorno 2), ci sono molti posti dove fermarsi e congelare il campione. Questi sono fondamentali quando si lavora con studenti universitari in cui gli orari e i tempi del lavoro di laboratorio devono essere flessibili. Oltre a progettare queste fermate nel protocollo, gli studenti universitari sono incoraggiati a lavorare in coppia o anche in piccoli gruppi di tre o quattro. I gruppi funzionano bene per questo protocollo, poiché gli studenti possono sostenersi a vicenda e creare un sistema di amicizia in modo che tutti lavorino in sicurezza. Il lavoro di laboratorio è anche più divertente con gli altri coinvolti. Con i gruppi, gli studenti possono anche lavorare su una varietà di domande incentrate sull'organizzazione della cromatina pur eseguendo lo stesso protocollo. Pertanto, anche mentre gli studenti stanno lavorando su progetti separati, il protocollo collega i loro sforzi e, per questo motivo, possono sostenersi a vicenda.
Altri adattamenti hanno lo scopo di aggirare il fatto che alcuni strumenti e attrezzature specializzati non si trovano necessariamente in tutte le istituzioni universitarie. Queste apparecchiature includono, ma non sono limitate a, termociclatori qPCR, sistemi di documentazione su gel e spettrometri di volume nano. In effetti, questi pezzi di equipaggiamento sono convenienti ma non sono un requisito. Qui, il metodo classico di 3C è anche descritto nella parte di progettazione del primer; Ciò comporta l'identificazione di un locus genomico di interesse e, da questo, la valutazione di altri loci genomici per i punti di contatto della cromatina più lontani. Questa tecnica funziona bene anche se viene utilizzato un set di dati pubblicato, ad esempio un set di dati che utilizza Hi-C, in cui vengono identificati loci positivi (di connessione) e negativi (non di connessione) noti. La progettazione di esperimenti utilizzando questi set di dati pubblicati è un altro grande adattamento per i laboratori didattici, poiché la possibilità di identificare con successo le connessioni della cromatina è solitamente maggiore. Inoltre, l'articolo di ricerca può essere discusso in classe ed essere utilizzato come riferimento.
Questo protocollo utilizza un approccio qPCR modificato per visualizzare la formazione del prodotto 3C. I controlli sono essenziali per il successo della tecnica 3C. Ogni esperimento utilizza sia controlli di esempio che controlli di base per determinare il completamento della procedura 3C. I controlli del campione includono un controllo non digerito (DNA genomico) e un controllo digerito. Il controllo non digerito determina il segnale di base per i set di primer e viene utilizzato con il controllo della digestione reticolato per determinare l'efficienza della digestione Si prevede che ci sarà un calo del prodotto per qualsiasi primer diretto attraverso un sito di restrizione. Il confronto di questo valore con il controllo non digerito fornisce un'indicazione di quanto bene il campione è stato digerito.
I primer per la PCR includono un primer di controllo e primer di prova. Il primer di controllo è un set di primer che si trova vicino alla regione genomica da analizzare e non contiene un sito di restrizione. Ciò fornisce la linea di base per determinare l'abbondanza dei prodotti PCR primer di prova. I primer di prova sono primer avanti e indietro che fiancheggiano un sito di restrizione per un particolare locus genomico di interesse (Figura 3). Le reazioni che utilizzano questi set di primer vengono confrontate per determinare l'efficienza della digestione, poiché l'abbondanza di prodotto dovrebbe diminuire se il sito di restrizione è stato tagliato. Nel determinare l'organizzazione della cromatina, un primer di prova da un locus è accoppiato con un altro primer di prova da un altro locus genomico per determinare se questi due loci sono vicini nello spazio 3D. In tal caso, l'aspettativa è che un prodotto PCR venga trovato solo utilizzando il campione 3C come modello.
È importante notare che anche i primer convalidati hanno la tendenza a fallire (Figura 4: set di primer r14). Inoltre, i prodotti PCR sono spesso identificati nelle reazioni di controllo e nelle reazioni in cui non è prevista una connessione della cromatina (come il controllo digerito, poiché non è legato). Queste istanze vengono sequenziate e non superano il controllo qualità Sanger o restituiscono senza una sequenza definita (Figura 5). Inoltre, gli esperimenti 3C tradizionali generano un "modello di controllo", un campione di DNA non reticolato, digerito e legato, che rappresenta tutti i possibili frammenti legati che possono essere prodotti con una data quantità di DNA. Il "modello di controllo" svolge un ruolo importante nel confrontare le intensità dei segnali qPCR tra due loci genomici per determinare se il segnale rappresenta una vera interazione o solo un'associazione casuale. La creazione di un "modello di controllo" può essere problematica, poiché gran parte della cromatina da analizzare deve essere catturata sotto forma di cromosoma artificiale ed elaborata insieme ai campioni 3C. Garantire un tale costrutto potrebbe non essere fattibile e crearne uno potrebbe essere al di fuori dell'ambito di un progetto semestrale. A causa di queste difficoltà, si consiglia di utilizzare un primer di controllo. Il primer di controllo non sostituisce tutte le funzionalità del "modello di controllo", ma offre comunque l'opportunità di analizzare i dati per effettuare determinazioni di "presenza" o "assenza".
Quando si esegue la qPCR, è importante utilizzare quantità uguali di campione. Questo dovrebbe essere determinato, anche se si utilizza un nano-spettrofotometro come un nanodrop, generando una curva standard dal DNA genomico di una concentrazione nota e adattando i campioni 3C a quella linea. Queste quantità devono essere registrate e utilizzate nelle PCR successive. Anche la qualità della reazione PCR è importante. Poiché la PCR viene eseguita in qPCR, l'abbondanza del prodotto viene misurata utilizzando la fluorescenza e registrata. Questa registrazione è accessibile nel grafico di amplificazione. Una volta terminato il programma, è importante controllare il grafico di amplificazione e assicurarsi che le reazioni (ad eccezione dei controlli no template) abbiano tre fasi: una baseline, una esponenziale e una fase plateau/saturazione. È importante verificare che le reazioni abbiano una fase esponenziale, in particolare per la definizione della soglia (vedi sotto). Inoltre, per i campioni diluiti in serie, dovrebbe esserci uno spostamento dei valori di Ct coerente con la diluizione del campione (la concentrazione più alta avrà i valori di Ct più bassi, mentre la concentrazione più bassa avrà i valori di Ct più alti). I campioni che non riflettono questo cambiamento nel grafico di amplificazione richiedono una nuova diluizione o indicano un problema più ampio con la formazione del campione 3C. Infine, durante la generazione della curva standard, il software PCR calcolerà l'efficienza della PCR e il valore R2 . L'efficienza della PCR dovrebbe essere superiore al 90% e il valore di R2 dovrebbe essere maggiore di 0,99. Se una di queste condizioni non è soddisfatta, è probabile che qualcosa non vada nel campione o nei primer PCR.
Dopo la qPCR, la percentuale di digestione e la presenza di interazioni 3C possono essere calcolate utilizzando la qPCR Ct per ogni reazione. Per determinarli, in primo luogo, deve essere impostata la soglia per la reazione PCR. Questo viene normalmente fatto utilizzando il software fornito con la macchina qPCR. L'impostazione della soglia definirà la concentrazione del prodotto PCR che verrà utilizzato per confrontare i valori di Ct del campione. La soglia dovrebbe dividere in due le curve di amplificazione delle reazioni PCR nella fase esponenziale di amplificazione. Solo le reazioni PCR con amplificazione esponenziale possono essere confrontate (in questo caso, i primer di controllo e le reazioni di primer del test), poiché questo è l'unico modo per garantire che le reazioni stiano amplificando il DNA alla stessa velocità e possano essere confrontate fedelmente. Quando si analizzano i grafici 3C, le reazioni condizionatamente positive sono identificate come quelle con più prodotto rispetto ai campioni di controllo, al controllo genomico e al controllo della digestione (Figura 4B). Tuttavia, questi campioni devono essere ulteriormente convalidati utilizzando il sequenziamento Sanger dopo la purificazione del gel del prodotto PCR.
Dopo il sequenziamento Sanger, i campioni che superano il controllo qualità possono essere analizzati utilizzando Blat. L'obiettivo di questa analisi è determinare se il campione ha la sequenza di entrambi i loci genomici bersaglio che fiancheggiano il sito di restrizione (DpnII nel caso di questo protocollo). Se vengono identificate entrambe le sequenze, il frammento 3C può essere considerato convalidato. Se i risultati del Blat non restituiscono la sequenza prevista, ciò potrebbe indicare che uno o entrambi i primer non sono ottimali, con conseguente risultato qPCR falso positivo. I file di traccia per i campioni falsi positivi avranno picchi di base indefiniti e i report Seq conterranno principalmente "n" chiamate di base.
La convalida con metodo Sanger è essenziale, poiché sono possibili falsi positivi dalla formazione di prodotti PCR artifattuali. Questi falsi positivi possono essere identificati quando i prodotti di sequenziamento non hanno la sequenza target prevista o una caratteristica del sito DpnII di un frammento 3C appropriato (Figura 5). Il sequenziamento dei frammenti di PCR fornisce anche un altro punto dati per l'esperimento e fa capire agli studenti che la tecnica 3C sta identificando loci genomici distanti che si stanno unendo nello spazio 3D all'interno dei nuclei.
La tecnica 3C fornisce una vasta gamma di tecniche molecolari fondamentali per gli studenti universitari in una procedura flessibile e semplice. Questa tecnica 3C è anche un punto di partenza per le altre tecniche 3C che incorporano il sequenziamento di nuova generazione (NGS). Questi tipi di esperimenti possono esporre gli studenti universitari ad aspetti importanti della bioinformatica e sono radicati nei principi di base qui delineati. L'esperienza universitaria e il coinvolgimento sono fondamentali per il loro successo e sviluppo come giovani scienziati. Fornendo queste opportunità, gli studenti universitari possono rafforzare la loro comprensione dei principi di base mentre costruiscono la loro fiducia per affrontare tecniche e domande all'avanguardia.
Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence del National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health con il numero di sovvenzione P20GM103430 e dal Bryant Center of Health and Behavioral Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Millapore-Sigma | F8775 | |
| 100% Ethanol | Millapore-Sigma | E7023 | |
| CaCl2 | MP Biomedical | 215350280 | |
| chloroform | Millapore-Sigma | C0549 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millapore-Sigma | COEDTAF-RO | mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh |
| Dithiothreitol (DTT) | Millapore-Sigma | D0632 | 1 M stock diluted to 500 µM in Sucrose buffer and GB buffer fresh |
| DpnII | NEB | R0543M | |
| Glycerol | Millapore-Sigma | G9012 | |
| glycine | Millapore-Sigma | G8898 | |
| glycogen | Millapore-Sigma | 10901393001 | |
| HEPES | Millapore-Sigma | H3375 | |
| KCl | Millapore-Sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | Millapore-Sigma | P5655 | |
| methyl green pyronin | Millapore-Sigma | HT70116 | |
| MgAc2 | Thermoscientific | 1222530 | |
| Na2HPO4 | Millapore-Sigma | S5136 | |
| NaCl | Millapore-Sigma | S9888 | |
| phenol-chloroform | Millapore-Sigma | P3803 | |
| Pronase | Millapore-Sigma | 11459643001 | |
| Proteinase K | IBI Scientific | IB05406 | |
| qPCR Ready mix (Phire Taq etc) | Millapore-Sigma | KCQS07 | |
| RNase A | Millapore-Sigma | R6148 | |
| Sodium Acetate | Millapore-Sigma | S2889 | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Millapore-Sigma | L3771 | |
| Sucrose | Millapore-Sigma | S0389 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1804 | |
| Tris-HCl | Millapore-Sigma | 108319 | |
| Triton X-100 | Millapore-Sigma | T9284 | |
| Trypsin-EDTA | Millapore-Sigma | T4049 |
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