Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Få en A med 3Cs: Kromosomkonformasjonsfangst for studenter

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65213
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, 1,2
1Department of Biological and Biomedical Sciences, Bryant University, 2Center of Health and Behavioral Sciences, Bryant University
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en tilpasning av kromosomkonformasjonsfangstteknikken (3C) i detalj med vekt på grunnleggende involvering og læring.

Abstract

Kromosomkonformasjonsfangst (3C) er et kraftig verktøy som har skapt en familie av lignende teknikker (f.eks. Hi-C, 4C og 5C, referert til her som 3C-teknikker) som gir detaljert informasjon om den tredimensjonale organisasjonen av kromatin. 3C-teknikkene har blitt brukt i et bredt spekter av studier, fra overvåking av endringene i kromatinorganisasjonen i kreftceller til å identifisere forsterkerkontakter laget med genpromotorer. Mens mange av studiene som bruker disse teknikkene, stiller store genombrede spørsmål med intrikate prøvetyper (dvs. enkeltcelleanalyse), går det ofte tapt at 3C-teknikkene er forankret i grunnleggende molekylærbiologiske metoder som gjelder for et bredt spekter av studier. Ved å ta opp tett fokuserte spørsmål om kromatinorganisasjon, kan denne banebrytende teknikken brukes til å forbedre grunnforsknings- og undervisningslaboratorieopplevelsen. Dette papiret presenterer en 3C-protokoll og gir tilpasninger og vektpunkter for implementering ved primært lavere institusjoner i grunnforskning og undervisningserfaringer.

Introduction

En organismes genom inneholder ikke bare alle genene som kreves for funksjon, men også alle instruksjonene om hvordan og når de skal brukes. Dette gjør regulering av tilgangen til genomet til en av cellens viktigste funksjoner. Det er mange mekanismer for å kontrollere genfunksjonen; På basisnivå koker imidlertid genregulering ned til evnen til regulatoriske transkripsjonsfaktorer (transfaktorer) til å binde seg til deres spesifikke DNA-sekvenser (CIS-regulatoriske sekvenser). Dette er ikke en medfødt evne; I stedet styres det av organiseringen/strukturen til genomet i kjernen, som styrer tilgjengeligheten/eksponeringen av CIS-regulatoriske sekvenser til transfaktorene 1,2,3. Hvis transfaktorene ikke finner sine cis-regulatoriske sekvenser, kan transfaktorene ikke utføre sine regulatoriske oppgaver. Dette har gjort forståelsen av hvordan genomer er organisert i kjernen til en viktig kilde til undersøkelse.

Det er allment akseptert at eukaryote kromosomer i kjernen under interfase okkuperer sitt eget domene forankret til kjernelamina og nukleær matrise (figur 1), og dermed gjør kromosomet mer som et stykke pizza, i stedet for en nudel på en tallerken spaghetti. Kromosomer kondenseres delvis av protein-DNA-interaksjoner (kromatin) som vrir og sløyfer deler av kromosomet. Gjennom elektronmikroskopi, tredimensjonal DNA-fluorescens in situ hybridisering (FISH) og DNA-merkingsteknikker (dvs. fluorescerende og kunstig DNA-metylering), har inaktive domener av kromatin blitt funnet å være pakket tett langs den nukleære periferien 4,5,6, mens deler av aktivt, mindre kondensert kromatin finnes i det indre av kjernen 7,8,9, 10. Disse eksperimentene gir et vidvinkelbilde av kromosomdynamikk, men gjør lite for å fange opp endringene som skjer lokalt rundt genpromotorene observert i DNase11,12 og nukleosom13,14,15-studier.

Nøkkelen til å låse opp kromatindynamikk med høyere oppløsning var formuleringen av 3D-kromosomkartleggingsteknikken, 3C. Selve 3C-teknikken består av fire hovedtrinn: kryssbinding av kromatin, kromatinfordøyelse ved restriksjonsenzymer, kromatinligering og DNA-rensing (figur 2). De nye kunstige DNA-fragmentene generert av denne prosessen kan deretter karakteriseres for å avsløre den nære fysiske foreningen mellom lineært fjerne biter av DNA16. 3C-teknikken ble grunnlaget for etableringen av flere spin-off-teknikker som bruker de første trinnene i 3C for å stille bredere genombrede spørsmål (f.eks. Hi-C, 4C, ChIP-C). Denne familien av 3C-teknikker har identifisert at kromosomer er organisert i flere diskrete enheter kalt topologisk assosierte domener (TAD). TAD er kodet i genomet og er definert av kromatinløkker flankert av unlooped grenser16,17,18,19. TAD-grensene opprettholdes av to evolusjonært bevarte og allestedsnærværende faktorer, inkludert CCCT-bindingsfaktor (CTCF) og kohesjon, som forhindrer sløyfer i separate TAD-er i å samhandle16,20. Løkkene er formidlet av samspillet mellom transfaktorer og deres regulatoriske sekvenser, samt CTCF og kohesjon21.

Selv om mange studier ved hjelp av 3C-teknologier stiller brede genombrede spørsmål og benytter kompliserte prøveinnsamlingsteknikker, er formuleringen av 3C-teknikken basert på grunnleggende molekylærbiologiske teknikker. Dette gjør 3C spennende for distribusjon i både grunnforskning og undervisningslaboratorier. 3C-teknikken kan brukes til mindre fokuserte spørsmål og er iboende fleksibel til å skalere opp eller ned (enkeltgener22, kromosomer16 og / eller genomer18) avhengig av fokus og retning av spørsmålene som stilles. Denne teknikken har også blitt brukt på et bredt spekter av modellsystemer 7,16,19,23 og har vist seg å være allsidig i bruk. Dette gjør 3C til en utmerket teknikk for studenter ved at studentene kan få erfaring i vanlige molekylærbiologiske teknikker samtidig som de får verdifull erfaring med å svare på rettede spørsmål.

Her presenteres en tilpasset protokoll for klargjøring av 3C-bibliotek basert på tidligere publiserte protokoller24,25,26,27. Denne protokollen er optimalisert for omtrent 1 × 107 celler, selv om den har generert 3C-biblioteker med så lite som 1 × 105 celler. Denne protokollen har vist seg å være allsidig og har blitt brukt til å generere 3C-biblioteker fra sebrafiskembryoer, sebrafiskcellelinjer og unge voksne (YA) Caenorhabditis elegans (rundorm). Protokollen bør også være egnet for pattedyrcellelinjer og, med videre tilpasning, gjær.

Målet med disse tilpasningene er å gjøre 3C mer tilgjengelig for studenter. Det er tatt hensyn til å bruke teknikker som ligner de som kan oppnås i et undervisningslaboratorium. 3C-teknikken gir mange læringsmuligheter for studenter å lære grunnleggende molekylærbiologiske teknikker som vil være til nytte for deres utvikling på benken, i klasserommet og i deres bestrebelser etter endt utdanning.

Protocol

1. Primer design

MERK: 3C-primerdesignverktøyene er tilgjengelige online28. Alternativt kan tilpassede primere utformes av studentene (se nedenfor).

  1. Identifisering av primerplasseringer
    1. Åpne UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/), velg studieorganismen, og søk i regionen av genomet som skal vurderes ved hjelp av 3C.
    2. I neste vindu aktiverer du enzymsporet i kategorien Kartlegging og sekvensering under nettleseren ved å klikke på Restr Enzymes.
    3. Angi restriksjonsenzymet/-ene som skal brukes, og angi at visningsmodusen skal pakkes. Klikk på Send inn.
    4. I Variasjon og Gjentakelser kontrollerer du at RepeatMasker er satt til tetthet.
    5. Bruk begrensningsområdene som hjelpelinjer, og identifiser interessante områder som ikke er innenfor de maskerte repetisjonsområdene (svarte stolper). 300 basepar (bp) som flankerer både oppstrøms- og nedstrømssekvensen som omgir begrensningsområdet ved å klikke på posisjonen (øverste spor) og dra til ønsket lengde (~600 bp).
    6. Slipp musen, og en popup-boks vises. Legg merke til den genomiske plasseringen, klikk på Zoom inn, og la nettleseren tilpasse seg utvalget.
    7. Hold musen over Vis-fanen på det øvre nettleserbåndet, og velg DNA i rullegardinmenyen.
    8. La standardalternativet, merk betegnelsen på maskerte sekvenser (det er et alternativ å gjøre dem til N-er). Klikk på få DNA.
    9. Den uthevede sekvensen vil da vises i vinduet. Kopier og lim inn denne sekvensen i Primer3 (https://primer3.ut.ee/).
    10. Bruk standardinnstillingene for Primer3 til å generere primere ved å klikke på Velg primere.
    11. I resultatene, legg merke til plasseringen av restriksjonsenzymet, og velg primere som lager et 200-500 bp PCR-produkt med begrensningsstedet i midten.
    12. Etter disse trinnene, design testprimere 1 kilobase (kb), 2 kb, 5 kb, 10 kb og 20 kb fra stedet (e) av interesse.
    13. For å designe inndatakontrollprimerne, gjenta disse trinnene for et nettsted 1-2 kB fra interessestedet som mangler et begrensningssted, noe som betyr at det aldri blir kuttet.
  2. Validering av funksjonell primer
    1. For å validere primerfunksjonaliteten, sett opp PCR-reaksjoner ved hjelp av titrerte primerkonsentrasjoner og renset genomisk DNA. Enten gjennom kvantitative eller semi-kvantitative midler, avgjøre om primerne lager det forventede produktet.
    2. Redesign primere som ikke består valideringen.

2. Dag 1

MERK: Protokollen kan settes på pause (fryses ved -20 °C) etter kromatin-kryssbinding og etter kjernesamlingen. Trinnene tar i gjennomsnitt 5-6 timer med studenter.

  1. Young-adult (YA) C. elegans nuclei collection (tilpasset fra Han et al.29)
    1. Kromatin tverrbinding
      1. Samle 5000 YA ormer i 30 ml M9 medium i et 50 ml konisk rør, og spinn ved 400 × g i 2 minutter ved romtemperatur (RT).
      2. Vask ormepelleten 3x mer med M9 for å fjerne bakterier.
      3. Fjern supernatanten, resuspender ormepelleten i 47,3 ml M9 inneholdende 2,7 ml 37% formaldehyd (2% endelig), og inkuber med omrøring (gynging eller nutating) i 30 minutter ved RT.
        FORSIKTIG: Håndter formaldehyd med forsiktighet, og arbeid under en avtrekkshette med riktig personlig verneutstyr (PPE-lab-frakk, riktige hansker og øyevern). Formaldehyd er en irritasjon som påvirker øynene, nesen, halsen og lungene.
      4. Spinn ormene på 400 × g i 2 min ved RT.
      5. Fjern supernatanten og resuspender ormepelleten i 50 ml 1 M glycin. Spinn ormene på 400 × g i 2 min ved RT.
    2. Kjerner samling
      1. Resuspender ormepelleten i 6 ml kjølt NP-buffer (50 mM HEPES ved pH 7,5, 40 mM NaCl, 90 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1 % mellom 20, 0,2 mM DTT, 0,5 mM spermidin, 0,25 mM spermin, 1x komplett proteasehemmer).
      2. Overfør snekkeduspensjonen til en 7 ml løstsittende Dounce på is. Sprett prøven 15x, og hold på is i 5 min.
      3. Overfør snekkeduspensjonen til en 7 ml tettsittende Dounce på is. Spounce prøven 20x, og hold på is i 5 min.
      4. Overfør snekkemekanismen til et rent 15 ml konisk rør, og tilsett NP-buffer til totalt 10 ml (ca. 4 ml).
      5. Vortex ormsuspensjonen på høy innstilling i 30 s. Inkuber prøven på is i 5 min.
      6. Gjenta forrige trinn.
      7. Spinn snekkesuspensjonen ved 100 × g i 5 minutter ved 4 °C.
      8. Overfør supernatanten til et nytt 15 ml konisk rør.
      9. Sjekk prøven for ormrester. Visualiser 10 μL av prøven med et lysmikroskop. Hvis det er ormeavfall, spinn prøven ved 2000 × g i 5 minutter ved 4 °C, resuspender pelleten i en frisk 10 ml NP-buffer og spinn prøven igjen ved 100 × g i 5 minutter ved 4 °C. Kast pelleten, kontroller supernatanten for ormrester, og gjenta til prøven er fri for ormrester.
        MERK: Alternativt kan ormrestene også fjernes ved å sile prøven gjennom en 40 μm cellesil (6x) etterfulgt av en 20 μm cellesil (6x).
      10. Hvis prøven er fri for ormrester, ta 5 μL av prøven, tilsett 5 μL metylgrønn pyronin (kjernene blir blå), og telle kjernene med et hemocytometer.
      11. Spinn prøven ved 2000 × g i 5 minutter ved 4 °C
      12. Fjern supernatanten, legg prøvene på is og fortsett; Alternativt kan du knipse og fryse kjernene, og lagre ved -80 °C.
  2. Kromatin fordøyelse
    1. Resuspender kjernene i 450 μL rent vann. Overfør kjernene til et rent 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    2. Til den tverrbundne prøven, tilsett 60 μL 10x DpnII-restriksjonsenzymbuffer og bland godt.
      MERK: Andre restriksjonsenzymer som fortsatt kutter tverrbundet DNA kan brukes.
    3. Tilsett 15 μL 10 % natriumdodecylsulfat (SDS) for å permeabilisere kjernene, og inkuber under omrøring (vugging eller nutating) ved 37 °C i 1 time.
      FORSIKTIG: SDS er irriterende og giftig ved inntak eller absorberes gjennom huden. Håndter med forsiktighet, og bruk riktig PPE (laboratoriefrakk, riktige hansker og øyevern).
    4. Slukk SDS ved å tilsette 75 μL 20% Triton X-100 og inkubere med omrøring ved 37 °C i 1 time.
    5. Ta 10 μL fra prøven som en ufordøyd kontroll. Oppbevares ved 4 °C.
    6. Tilsett 400 U DpnII, og inkuber ved 37 °C over natten med omrøring.

3. Dag 2

MERK: I gjennomsnitt tar det studenter 5 timer å fullføre disse trinnene.

  1. Kromatin fordøyelse
    1. Tilsett ytterligere 200 U DpnII, og inkuber prøvene i 4 timer ved 37 °C under omrøring for å sikre fullstendig fordøyelse av den tverrbundne prøven.
    2. Ta en 10 μL alikot fra prøvene som fordøyelseskontroll.
    3. Varmeinaktiver restriksjonsenzymet ved å inkubere prøven i 20 minutter ved 65 °C (eller i henhold til produsentens instruksjoner). Gå videre til trinn 2.1.3.
    4. Hvis enzymet ikke kan inaktiveres ved varme, tilsett 80 μL 10 % SDS og inkuber prøven i 30 minutter ved 65 °C. Tilsett deretter 375 μL 20% Triton X-100, og bland ved å virvle. Inkuber prøven i 1 time ved 37 °C, og fortsett til trinn 2,2.
  2. Kromatin ligering
    1. Overfør prøven til et rent 50 ml konisk rør, juster prøvevolumet til 5,7 ml med molekylær H2O, og bland ved å virvle.
    2. Tilsett 700 μL 10x T4 Ligase-buffer, og bland ved å virvle.
    3. Tilsett 60 U T4 DNA Ligase, og bland ved å virvle.
    4. Inkuber over natten ved 16 °C.

4. Dag 3

MERK: I gjennomsnitt tar det studenter 15-30 min å fullføre disse trinnene. Etter inkubasjonen over natten kan prøvene fryses.

  1. Proteinfordøyelse og omvendt tverrbinding
    1. Tilsett 30 μL proteinase K (10 mg/ml) til 3C-prøven, og inkuber ved 65 °C over natten under omrøring. Tilsett 5 μL proteinase K (10 mg/ml) til ufordøyd og fordøyelseskontroll, og inkuber ved 65 °C over natten med omrøring.

5. Dag 4

MERK: I gjennomsnitt tar det studenter 4-5 timer å fullføre disse trinnene.

  1. Rensing av 3C-biblioteket
    1. Tilsett 30 μL RNase A (10 mg / ml) til 3C-prøven, og virvle for å blande. Inkuber prøven i 45 minutter ved 37 °C.
    2. Tilsett 7 ml fenol-kloroform i prøven, og bland ved risting.
      FORSIKTIG: Fenol-kloroform er hud- og øyeirriterende og kan forårsake brannskader hvis kontakt ikke behandles. Fenolkloroform bør brukes i avtrekkshette med riktig øyevern og hansker (nitril).
    3. Sentrifuger prøven i 15 min ved 3,270 × g ved RT. Samle den vandige fasen, og overfør til et rent 50 ml konisk rør. Tilsett like store mengder kloroform, og bland prøven ved risting.
    4. Sentrifuge prøven i 15 min ved 3,270 × g ved RT. Samle den vandige fasen, og overfør til et rent 50 ml konisk rør. Tilsett 7,5 ml molekylærH2O, 35 ml 100 % etanol og (valgfritt) 7 μL glykogen (1 mg/ml). Bland ved risting, og inkuber ved -80 °C til prøven er frossen.
      MERK: Det kan ta 1 time eller mer før prøven fryser. Protokollen kan settes på pause her.
      1. Mens 3C-prøven fryser, rens kontrollprøvene. Til kontrollprøvene, juster volumet til 500 μL ved bruk av molekylært vann, og tilsett 2 μL RNase A (10 mg / ml) blanding ved å bla røret.
      2. Spinn kort for å samle prøven på bunnen av røret. Inkuber prøvene i 45 minutter ved 37 °C.
      3. Til kontrollprøvene, tilsett 1 ml fenol-kloroform, og bland ved å riste rørene. Sentrifuger prøven i 15 minutter ved 3,270 × g ved RT. Samle den vandige fasen av kontrollene, og sett i et rent 1,5 ml mikrosentrifugerør.
      4. Tilsett like store mengder kloroform, og bland prøven ved risting. Sentrifuger prøven i 15 minutter ved 3,270 × g ved RT. Samle den vandige fasen av kontrollene, og sett i et rent 1,5 ml mikrosentrifugerør.
      5. Tilsett 1 ml 100 % etanol og 2 μl glykogen (1 mg/ml). Bland ved risting, og rug ved -80 °C i 30 minutter.
      6. Sentrifuger prøven i 15 min ved 3 270 × g ved 4 °C. Fjern supernatanten, og tilsett 750 μL kjølt 70% etanol.
      7. Sentrifuger prøven i 10 minutter ved 3 270 × g ved 4 °C. Fjern supernatanten og lufttørk prøvene. Resuspender pelleten i 50 μL molekylær H2O. Frys, eller fortsett til trinn 6.
    5. Sentrifuger prøven i 60 min ved 3 270 × g ved 4 °C. Fjern supernatanten, og tilsett 10 ml kjølt 70% etanol. Forstyrr og bryt opp DNA-pelleten ved å riste prøven for å blande.
    6. Sentrifuger prøven i 30 min ved 3 270 × g ved 4 °C. Fjern supernatanten, og la prøven delvis lufttørke ved RT. Resuspender pelleten i 150 μL på 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) ved å pipettere opp og ned. Dette er "3C Library."
      MERK: Frys prøven, eller fortsett til analysen.

6. Dag 5

MERK: I gjennomsnitt tar det studenter 1-2 timer å fullføre disse trinnene.

  1. Bestemme prøvekvaliteten ved hjelp av standardkurven til kontrollprimeren
    1. Kvantifiser DNA-konsentrasjonen for 3C-prøven samt alle kontrollene, og juster prøvene til 30 μg / μL (hvis konsentrasjonene tillater det). Serielt de fortynnede prøvene to ganger fire ganger, noe som resulterer i fem fortynninger for hver prøve (1x, 0,5x, 0,25x, 0,125x, 0,0625x).
      MERK: Hvis kvantifisering ikke lett kan gjøres, fortynn prøvene serielt som angitt ovenfor, og fortsett.
    2. Sett opp PCR-reaksjoner for 3C, genomisk kontroll og fordøyd kontroll for hver fortynnet prøve med kontrollprimerne: 1 μL DNA, 10 μL 5x reaksjonsbuffer, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 mM kontrollprimer (fremover og bakover blandet), 1 μL Taq-polymerase og 36 μL vann.
    3. Følg instruksjonene for programvaren som er spesifikk for PCR-maskinen, sett opp PCR-programmet med standardkurve ved hjelp av sykkelforholdene som følger: 30 s ved 98 °C; 30 sykluser på 5 s ved 98 °C, 5 s ved 60 °C og 10 s ved 72 °C; 1 min ved 72 °C; 4 °C hold.
    4. Bruk programvaren til å generere standardkurvene for prøvene. Etter at programvaren har generert kurven, legg merke til PCR-effektiviteten og R2-verdien .
  2. Bestemme DNA-konsentrasjonen
    1. For å bestemme DNA-konsentrasjonen av 3C-prøvene, sammenlign prøvene med en genomisk DNA-prøve med kjent konsentrasjon. Fortynn prøvene til 30 ng / μL, og fortynn den genomiske kontrollen serielt fra 10 ng / μL til 0,01 ng / μL i to trinn for å lage en standardkurve.
      MERK: Hvis kvantifisering ikke lett kan gjøres, fortynn prøven 1:10 og fortsett.
    2. Sett opp PCR-reaksjonene for 3C, genomisk kontroll og fordøyd kontroll for hver fortynnet prøve med kontrollprimerne: 1 μL DNA, 10 μL 5x reaksjonsbuffer, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 mM kontrollprimer (fremover og revers blandet), 1 μL Taq-polymerase og 36 μL vann.
    3. Følg instruksjonene for programvaren som er spesifikk for PCR-maskinen, sett opp standard kurve PCR-programmet ved hjelp av sykkelforholdene som følger: 30 s ved 98 ° C; 30 sykluser på 5 s ved 98 °C, 5 s ved 60 °C og 10 s ved 72 °C; 1 min ved 72 °C; 4 °C hold.
    4. Ved hjelp av programvaren genererer du standardkurvene for prøvene, og plotter 3C-prøvene på kurven. Sammenlign posisjonen til 3C-prøvens overflod med standardkurven opprettet av reaksjonene til det genomiske DNA med kjent konsentrasjon, og juster 3C-prøvene til 30 ng / μL.
  3. Bestemme tilstedeværelsen eller fraværet av kromatininteraksjon
    1. Sett opp qPCR-reaksjoner med 30 ng av 3C-prøven, genomisk kontrollprøve og fordøyd kontrollprøve: 1 μL DNA, 10 μL 5x reaksjonsbuffer, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 mM primer (fremover og bakover blandet), 1 μL Taq-polymerase og 36 μL vann.
      MERK: Reaksjonene skal settes opp ved hjelp av kontrollprimeren, testprimerne for individuelle genomiske loci, og ønskede kombinasjoner av testprimerne (sted "a" fremover og sted "b" bakover) som brukes til å bestemme kromatininteraksjonen (figur 3).
    2. Følg instruksjonene for programvaren til PCR-maskinen, sett opp PCR-programmet som følger: 30 s ved 98 °C; 40 sykluser på 5 s ved 98 °C, 5 s ved 60 °C og 10 s ved 72 °C; 1 min ved 72 °C; 4 °C hold.
    3. Etter at PCR er kjørt, inspiser amplifikasjonsplottet. Sørg for at PCR-reaksjonene viser eksponentiell forsterkning, og dobler hver syklus.
      MERK: Reaksjoner som ikke viser eksponentiell forsterkning, kan ikke analyseres ytterligere.
    4. Følg instruksjonene for programvaren til PCR-maskinen, definer terskelen for qPCR-eksperimentet.
    5. Eksporter Ct-verdiene for alle prøvene.
    6. Bestem fordøyelseseffektiviteten ved hjelp av testprimer (TP) og kontrollprimer (CP) Ct-verdier fra ufordøyd kontroll (UC) og fordøyd kontroll (DC) prøver ved hjelp av ligning (1).
      Prosent fordøyd = 100 - Equation 1 (1)
    7. Disse verdiene bør ligge i området 80% -90% fordøyelse. Registrer disse verdiene (figur 4A).
    8. Bestem den relative kromatininteraksjonen ved hjelp av testprimerkombinasjonen (TPC) og kontrollprimeren (CP) Ct-verdiene fra ufordøyd kontroll (UC) og 3C (3C) prøvene ved hjelp av ligning (2).
      Kromatininteraksjon = 100 - Equation 2 (2)
    9. Plott verdiene for hver prøve på et søylediagram for hver testprimerkombinasjon.
    10. Sammenlign signalet fra 3C-prøvene med kontrollprøvene for å avgjøre om 3C-prøven har anrikning av en bestemt kromatininteraksjon over kontrollprøvene. 3C-prøver som viser anrikning over kontrollen kan betraktes som betinget positive og krever validering ved hjelp av Sanger-sekvensering (figur 4B).
      MERK: Når du analyserer grafdataene, er det viktig å huske at med mindre en "kontrollmal" brukes (se diskusjon), kan overflod mellom reaksjoner (dvs. fra ett sett med primere til neste) ikke sammenlignes.
  4. Identifisering av 3C-produktene
    1. Kjør PCR-produktene på en 1,5% agarosegel.
    2. Visualiser gelen for riktig størrelse på PCR-produktene ved hjelp av en UV-lysboks eller geldokumentasjonssystem.
      MERK: Godt konstruerte 3C-biblioteker vil inneholde et mangfoldig utvalg av DNA-fragmenter, og til tross for tidligere validering av primerne for spesifisitet, har PCR-reaksjoner fra 3C-biblioteker potensial til å inneholde mange bånd (figur 5A). Dette hindrer ikke analysen av 3C-bibliotekene.
    3. Excise produktbåndene som tilsvarer den forventede fragmentstørrelsen, og utfør gelekstraksjon av PCR-produktene i henhold til instruksjonene i et kommersielt sett eller den hjemmelagde protokollen som er beskrevet nedenfor.
      FORSIKTIG: UV-lys er et kjent kreftfremkallende middel, og det bør utvises stor forsiktighet for å begrense tiden som utsettes for UV-lys. UV-bestandig øyevern, et prøveskjold, hansker og en laboratoriefrakk skal brukes.
      1. For å konstruere en hjemmelaget rensepatron, stikk et hull i bunnen av et 0,5 ml rør med en nål.
      2. Pakk en liten mengde bomull fra en bomullsdott inn i bunnen av 0,5 ml røret, og fyll ikke mer enn halvparten av røret.
      3. Plasser 0,5 ml røret i et 1,5 ml rør; Sørg for at det mindre røret hviler på leppen til det større røret, ikke i røret.
      4. Skjær forsiktig et gelfragment i mindre biter, og legg det i 0,5 ml røret på patronen.
      5. Plasser enheten i en fryser på −20 °C i 5 minutter. Spinn monteringen i 3 min ved 13 000 × g ved RT.
      6. Hold 1,5 ml røret med ekstrahert DNA i buffer, og kast 0,5 ml røret som inneholder agaroserester.
      7. Renset DNA kan sendes til Sanger-sekvensering ved hjelp av forover- og reversprimere for 3C-fragmentet.
    4. Identifisering av kromatinkontakter ved bruk av Blat
      1. Når sekvenseringen er fullført, må du avgjøre om prøvene oppfyller kvalitetskontrollstandardene som angitt i sekvenseringsrapporten.
      2. For sekvenser som passerer QC, åpner du SEQ- og AB1-filer (sporfiler) i et sekvenseringsredigeringsprogram, for eksempel Another Plasmid Editor (ApE), undersøker AB1-filen for klare basekalletoppringingstopper og redigerer toppene som kalles feil i SEQ-filen.
      3. Bruk den redigerte .seq-filen, og søk etter DpnII-nettstedet. Avhengig av sekvensresultatet, bør dette være halvveis inn i den rapporterte sekvensen.
      4. For å avgjøre om sekvensen er den forventede målsekvensen, DpnII-stedet og ytterligere 30-50 bp av oppstrømssekvensen som tilsvarer den fremre primeren til det genomiske loci testet for 3C. Utfør et Blat-søk av denne sekvensen mot målarten. Forsikre deg om at de genomiske loci samsvarer med primeren.
      5. Gjenta trinnet ovenfor for omvendt primersekvens, og sørg for at det genomiske lokuset som returneres samsvarer med omvendt primer.

Representative Results

Denne prosedyren vil produsere en eksperimentell 3C-prøve og to kontrollprøver (ufordøyd og fordøyd). Ved hjelp av disse tre prøvene ble det utført qPCR. Fra disse resultatene ble fordøyelseseffektiviteten beregnet (ligning 1) og registrert (tabell 1). Fra disse beregningene ble det bestemt at 3C-prøven hadde en omtrent 88% fordøyelseseffektivitet (gjennomsnitt av tabell 1) på tvers av de syv genomiske stedene som ble testet.

Deretter ble prøvene testet for tilstedeværelse av langtrekkende kromatinkontakter mellom de forskjellige genomiske loci ved bruk av kombinasjoner av loci-spesifikke primere (tabell 2) og qPCR. Ved hjelp av disse resultatene ble produktmengdene i forhold til et kontrollprimersett beregnet (ligning 2) og grafet for sammenligning (figur 4). Disse dataene indikerte at 8 av de 10 reaksjonene var betingede positive for langdistanseinteraksjoner.

PCR-reaksjonene ble deretter kjørt på en agarosegel. Det forventede PCR-produktet for de åtte betingede positive og en negativ reaksjon ble gelrenset og sendt til Sanger-sekvensering. Resultatene for representative positive (blå pil, blå boks) og negative (rød pil, rød boks) reaksjoner er vist (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Kromosomstruktur i kjernen. Hypotetisk kromosomorganisasjon inne i kjernen. (A) Kjernefysisk konvolutt, svarte linjer; (B) kjernefysisk lamina, oransje; (C) heterokromatin, komprimerte linjer; (D) eukromatin, løse løkker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk av 3C-protokollen. Fjerne deler av lineære kromosomer (blå, gul og rosa) bringes tett sammen i kjernen gjennom regulatoriske løkker. (A) Sløyfestrukturene medieres av transkripsjonsfaktorer (grå sirkel og svart stjerne); Disse interaksjonene er bevart gjennom kjemisk tverrbinding. (B) Løkkene brytes gjennom enzymatisk fordøyelse (svarte linjer). (C) Fjerne kromatinbiter er ligert sammen gjennom de stikkende endene skapt av fordøyelsen. (D) DNA renses fra protein. (E) Sekvensen i fragmentene identifiseres og kartlegges tilbake til genomet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: 3C-grunningsskjemaet. 3C-primerne er designet rundt restriksjonssteder på varierende avstander fra den genomiske plasseringen av interesse. De rosa pilene representerer de eksperimentelle primersettene som omgir et DpnII-sted. De eksperimentelle primerne kan blandes og matches for å vurdere kromatinsløyfing i regionen. De oransje primerne representerer en negativ kontroll uten et DpnII-nettsted. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative qPCR-data for et 3C-eksperiment. Relativ overflod av 3C test primer sett. (A) Kontrollgraf som viser produktets relative overflod i ufordøyd kontroll (blå), fordøyd kontroll (grå) og 3C-prøve (oransje). (B) 3C-eksperimentet; den relative overflod av produktet fra kombinasjoner av testprimere i ufordøyd kontroll (blå), fordøyd kontroll (grå) og 3C-prøve (oransje). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Visualisering av 3C qPCR-produktene. Topp, gel med qPCR-endepunktproduktene med prøvene angitt. Nederst, representative Sanger-sekvenssporingsfiler for de angitte reaksjonene. Den oransje prøven er et eksempel på en falsk positiv (se figur 4, r38/34), og den blå prøven er et eksempel på en sann positiv med DpnII-stedet angitt over sporet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tomt % fordøyelse
R8 86.98
R3 88.44
R38 89.64
R34 87.55
R33 87.85
R14 86.97
R47 89.45

Tabell 1: Beregnet fordøyelseseffektivitet.

Navn Sekvens Genomiske loci
r3 FWD ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC chrX:11361475
r3 RVS TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC chrX:11361561
r38 FWD TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC chrX:5859700
r38 RVS AGACGAGCTGATTAAAGTAGTTGAG chrX:5859775
r34 FWD ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG chrX:5429702
r34 RVS AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC chrX:5429777
r33 FWD AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC chrX:6296704
r33 RVS TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG chrX:6296807
r14 FWD AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG chrX:8036367
r14 RVS ATTTCAATGAAAATGTAAAATGTTCCTTC chrX:8036427
r47 FWD ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC chrX:9464939
r47 RVS AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC chrX:9465064
r8 FWD GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG chrX:11094257
r8 RVS TTACGAAATTTGGTTTTGGACC chrX:11094362
Kontroll primer FWD CAATCGTCTCGCTCACTTGTC chrX:7608049
Kontroll primer RVS GATGTGAGCAACAAGGCACC chrX:7608166

Tabell 2: Primere for det representative 3C-eksperimentet.

Discussion

3C er en kraftig teknikk som er forankret i grunnleggende molekylære teknikker. Det er dette grunnlaget for grunnleggende verktøy som gjør 3C til en så spennende teknikk å bruke med studenter. Med så mange nyere studier som observerer kromatindynamikk på en så bred skala, har bruk av disse resultatene til å utarbeide et smalt fokusert eksperiment på et enkelt gen eller genomisk region potensialet til å skape et unikt og virkningsfullt eksperiment i grunnforskning. Ofte anses eksperimenter som disse for avanserte for studenter, men med nøye planlegging er de lett oppnåelige. Det er viktig å merke seg at analysene designet for å undersøke kromatinforbindelsene fanget av 3C-biblioteket, kan variere fra semi-kvantitativ endepunkt-PCR til helgenomsekvensering. Faktisk ble data fra det første 3C-papiret16 generert fra qPCR. Dette brede spekteret av analyser kan alle brukes fordi alle 3C-teknologier produserer det samme produktet - et bibliotek med DNA-fragmenter som representerer 3D-forbindelser i kjernen.

Presentert her er en tilpasning av en mer fleksibel og imøtekommende protokoll som passer bedre for bachelorforskere. Pauseperiodene som er oppført ovenfor, innebærer forsinkelser over natten; Imidlertid kan disse pausene strekke seg over helger og, når det gjelder celler og kjerner, i flere uker. Det mest avgjørende hensynet er når arbeidet skal bli gjort. Ofte i protokoller er det tidsfølsomme trinn når pause ikke er et alternativ. Utenom noen få punkter (dag 1 og dag 2) er det mange steder å stoppe og fryse prøven. Disse er kritiske når du arbeider med studenter der tidsplanene og tidspunktene for laboratoriearbeid må være fleksible. I tillegg til å konstruere disse stoppene i protokollen, oppfordres studenter til å jobbe i par eller til og med små grupper på tre eller fire. Grupper fungerer bra for denne protokollen, da studentene kan støtte hverandre og lage et kompissystem slik at alle jobber trygt. Labarbeid er også morsommere med andre involverte. Med grupper kan studentene også jobbe med en rekke spørsmål som er fokusert på organisering av kromatin mens de fortsatt utfører den samme protokollen. Således, selv mens studentene jobber med separate prosjekter, knytter protokollen deres innsats, og på grunn av dette kan de støtte hverandre.

Andre tilpasninger er ment å omgå det faktum at visse spesialiserte verktøy og utstyr ikke nødvendigvis finnes i alle lavere institusjoner. Disse utstyrene inkluderer, men er ikke begrenset til, qPCR-termosyklister, geldokumentasjonssystemer og nanovolumspektrometre. Faktisk er disse utstyrene praktiske, men er ikke et krav. Her er den klassiske metoden for 3C også beskrevet i primerdesigndelen; Dette innebærer å identifisere et genomisk lokus av interesse og derfra vurdere andre genomiske loci for kromatinkontaktpunkter lenger unna. Denne teknikken fungerer også bra hvis et publisert datasett brukes, for eksempel et datasett som bruker Hi-C, der kjente positive (tilkobling) og negative (ikke-koblende) loci identifiseres. Å designe eksperimenter ved hjelp av disse publiserte datasettene er en annen flott tilpasning for undervisningslaboratorier, da sjansen for vellykket identifisering av kromatinforbindelser vanligvis er større. I tillegg kan forskningsartikkelen diskuteres i klassen og brukes som referanse.

Denne protokollen bruker en modifisert qPCR-tilnærming for å visualisere 3C-produktdannelsen. Kontroller er avgjørende for suksessen til 3C-teknikken. Hvert eksperiment bruker både prøvekontroller og primerkontroller for å bestemme fullføringen av 3C-prosedyren. Prøvekontrollene inkluderer en ufordøyd kontroll (genomisk DNA) og fordøyd kontroll. Den ufordøyde kontrollen bestemmer baselinesignalet for primersettene og brukes sammen med den tverrbundne fordøyelseskontrollen for å bestemme fordøyelseseffektiviteten Det forventes at det vil være et fall i produktet for eventuelle primere rettet over et restriksjonssted. Sammenligning av denne verdien med den ufordøyde kontrollen gir en indikasjon på hvor godt prøven ble fordøyd.

Primerne for PCR inkluderer en kontrollprimer og testprimere. Kontrollprimeren er et primersett som er nær den genomiske regionen som analyseres og inneholder ikke et restriksjonssted. Dette gir grunnlinjen for å bestemme overflod av testprimer-PCR-produktene. Testprimere er forover- og reversprimere som flankerer et restriksjonssted for et bestemt genomisk lokus av interesse (figur 3). Reaksjoner ved bruk av disse primersettene sammenlignes for å bestemme fordøyelseseffektiviteten, da produktets overflod bør falle hvis restriksjonsstedet er kuttet. Ved bestemmelse av kromatinorganisasjonen er en testprimer fra ett locus parret med en annen testprimer fra et annet genomisk locus for å avgjøre om disse to loci er tett sammen i 3D-rom. I så fall er forventningen at et PCR-produkt bare vil bli funnet med 3C-prøven som mal.

Det er viktig å merke seg at selv validerte primere har en tendens til å mislykkes (figur 4: r14 primer set). I tillegg identifiseres PCR-produkter ofte i kontrollreaksjoner og i reaksjoner der en kromatinforbindelse ikke forutsies (for eksempel fordøyd kontroll, siden den ikke er ligert). Disse forekomstene sekvenseres og mislykkes enten i Sanger QC eller returneres uten en definert sekvens (figur 5). I tillegg genererer tradisjonelle 3C-eksperimenter en "kontrollmal", en ukryssbundet, fordøyd og ligert DNA-prøve, som representerer alle mulige ligerte fragmenter som kan produseres med en gitt mengde DNA. "Kontrollmalen" spiller en viktig rolle i å sammenligne intensiteten til qPCR-signaler mellom to genomiske loci for å avgjøre om signalet representerer en sann interaksjon eller bare en tilfeldig forening. Å lage en "kontrollmal" kan være problematisk, da en stor del av kromatinet som analyseres, må fanges i form av et kunstig kromosom og behandles sammen med 3C-prøvene. Å sikre en slik konstruksjon er kanskje ikke gjennomførbart, og å lage en kan være utenfor rammen av et semesterprosjekt. På grunn av disse vanskelighetene foreslår vi at du bruker en kontrollprimer. Kontrollprimeren erstatter ikke all funksjonaliteten til "kontrollmalen", men gir likevel muligheten til å analysere dataene for å gjøre "tilstedeværelse" eller "fravær" bestemmelser.

Når du utfører qPCR, er det viktig å bruke like mengder av prøven. Dette bør bestemmes, selv om du bruker et nano-spektrofotometer som en nanodrop, ved å generere en standardkurve fra genomisk DNA med en kjent konsentrasjon og montere 3C-prøvene til den linjen. Disse beløpene skal registreres og brukes i senere PCR. Kvaliteten på PCR-reaksjonen er også viktig. Når PCR kjører i qPCR, måles produktmengden ved hjelp av fluorescens og registreres. Dette opptaket er tilgjengelig i forsterkningsplottet. Når programmet er ferdig, er det viktig å kontrollere forsterkningsplottet og sørge for at reaksjonene (unntatt kontrollene uten mal) har tre faser: en grunnlinje, en eksponentiell og en platå/metningsfase. Det er viktig å kontrollere at reaksjonene har en eksponentiell fase, spesielt for å sette terskelen (se nedenfor). I tillegg, for serielt fortynnede prøver, bør det være en forskyvning i Ct-verdier konsistent med fortynningen av prøven (den høyeste konsentrasjonen vil ha de laveste Ct-verdiene, mens den laveste konsentrasjonen vil ha de høyeste Ct-verdiene). Prøver som ikke reflekterer denne endringen i amplifikasjonsplottet, krever en ny fortynning eller indikerer et større problem med 3C-prøvedannelsen. Til slutt, mens du genererer standardkurven, vil PCR-programvaren beregne PCR-effektiviteten og R2-verdien . PCR-effektiviteten skal være større enn 90%, og R2-verdien skal være større enn 0, 99. Hvis en av disse betingelsene ikke er oppfylt, er det sannsynlig at noe er galt med prøven eller PCR-primerne.

Etter qPCR kan prosentvis fordøyelse og tilstedeværelse av 3C-interaksjoner beregnes ved hjelp av qPCR Ct for hver reaksjon. For å bestemme disse må først terskelen for PCR-reaksjonen settes. Dette gjøres normalt ved hjelp av programvaren som følger med qPCR-maskinen. Innstilling av terskelen vil definere konsentrasjonen av PCR-produkt som skal brukes til å sammenligne Ct-prøveverdiene. Terskelen skal krysse amplifikasjonskurvene til PCR-reaksjonene i eksponentiell amplifikasjonsfase. Bare PCR-reaksjoner med eksponentiell amplifikasjon kan sammenlignes (i dette tilfellet kontrollprimerne og testprimerreaksjonene), da dette er den eneste måten å sikre at reaksjonene forsterker DNA i samme hastighet og kan sammenlignes trofast. Ved analyse av 3C-grafene identifiseres betinget positive reaksjoner som de med mer produkt over kontrollprøvene, genomisk kontroll og fordøyelseskontroll (figur 4B). Imidlertid må disse prøvene valideres ytterligere ved hjelp av Sanger-sekvensering etter gelrensing av PCR-produktet.

Etter Sanger-sekvensering kan prøver som passerer QC analyseres ved hjelp av Blat. Målet med denne analysen er å avgjøre om prøven har sekvensen av begge målgenomiske loci som flankerer restriksjonsstedet (DpnII i tilfelle av denne protokollen). Hvis begge sekvensene er identifisert, kan 3C-fragmentet betraktes som validert. Hvis resultatene av Blat ikke returnerer den forventede sekvensen, kan dette indikere at en eller begge primere ikke er optimale, noe som resulterer i et falskt positivt qPCR-resultat. Sporingsfilene for de falske positive prøvene vil ha udefinerte basetopper, og Seq-rapportene vil for det meste inneholde "n" basekall.

Sanger-validering er viktig, da falske positiver fra kunstig PCR-produktdannelse er mulig. Disse falske positivene kan identifiseres når sekvenseringsproduktene ikke har den forventede målsekvensen eller et DpnII-stedskarakteristikk for et riktig 3C-fragment (figur 5). Sekvenseringen av PCR-fragmentene gir også et annet datapunkt for eksperimentet og kjører hjem til studentene at 3C-teknikken identifiserer fjerne genomiske loci som kommer sammen i 3D-rom i kjernene.

3C-teknikken gir et vell av grunnleggende molekylære teknikker for studenter i en fleksibel og enkel prosedyre. Denne 3C-teknikken er også et startpunkt for de andre 3C-teknikkene som inneholder neste generasjons sekvensering (NGS). Disse typer eksperimenter kan utsette studenter til viktige aspekter ved bioinformatikk og er forankret i de grunnleggende prinsippene som er skissert her. Lavere erfaring og engasjement er nøkkelen til deres suksess og utvikling som unge forskere. Ved å gi disse mulighetene, kan studenter styrke sin forståelse av grunnleggende prinsipper samtidig bygge sin tillit til å takle banebrytende teknikker og spørsmål.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet delvis av Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence fra National Institute of General Medical Sciences ved National Institutes of Health under tilskuddsnummer P20GM103430 og Bryant Center of Health and Behavioral Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% Formaldehyde  Millapore-Sigma F8775
100% Ethanol Millapore-Sigma E7023
CaCl2 MP Biomedical 215350280
chloroform Millapore-Sigma C0549
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Millapore-Sigma COEDTAF-RO mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh
Dithiothreitol (DTT) Millapore-Sigma D0632 1 M stock diluted to 500 µM in Sucrose buffer and GB buffer fresh
DpnII NEB R0543M
Glycerol Millapore-Sigma G9012
glycine Millapore-Sigma G8898
glycogen Millapore-Sigma 10901393001
HEPES Millapore-Sigma H3375
KCl Millapore-Sigma P3911
KH2PO4 Millapore-Sigma P5655
methyl green pyronin   Millapore-Sigma HT70116
MgAc2 Thermoscientific 1222530
Na2HPO4 Millapore-Sigma S5136
NaCl Millapore-Sigma S9888
phenol-chloroform  Millapore-Sigma P3803
Pronase Millapore-Sigma 11459643001
Proteinase K IBI Scientific IB05406
qPCR Ready mix (Phire Taq etc) Millapore-Sigma KCQS07
RNase A  Millapore-Sigma R6148
Sodium Acetate Millapore-Sigma S2889
sodium dodecyl sulfate (SDS) Millapore-Sigma L3771
Sucrose Millapore-Sigma S0389
T4 DNA Ligase Promega M1804
Tris-HCl Millapore-Sigma 108319
Triton X-100 Millapore-Sigma T9284
Trypsin-EDTA  Millapore-Sigma T4049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C. Chromatin architectural proteins. Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).
  2. Nalabothula, N., et al. The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation. BMC Genomics. 15, 92 (2014).
  3. John, S., et al. Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns. Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).
  4. Fawcett, D. W. On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates. The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).
  5. Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina. Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).
  6. Finlan, L. E., et al. Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells. PLoS Genetics. 4 (3), e1000039 (2008).
  7. Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development. Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).
  8. Chambeyron, S., Bickmore, W. A. Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription. Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).
  9. Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories. The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).
  10. Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH. The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).
  11. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The role of chromatin during transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  12. Chen, A., Chen, D., Chen, Y. Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals. Gene. 667, 83-94 (2018).
  13. Hughes, A. L., Rando, O. J. Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo. Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).
  14. Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging. Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).
  15. Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern. Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).
  16. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  17. van Berkum, N. L., Dekker, J. Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology. Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).
  18. Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus. American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).
  19. Crane, E. E. Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2. University of California, Berkeley. , PhD thesis (2012).
  20. Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell. 98 (3), 387-396 (1999).
  21. Cuadrado, A., et al. Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells. Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).
  22. Sarro, R., et al. Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development. Development. 145 (7), (2018).
  23. Tolhuis, B., et al. Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture. PLoS Genetics. 7 (3), e1001343 (2011).
  24. Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
  25. Fernández-Miñán, A., Bessa, J., Tena, J. J., Gómez-Skarmeta, J. L. Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish. Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).
  26. Dekker, J. The three "C" s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).
  27. Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).
  28. Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies. Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).
  29. Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression. BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).

Tags

Genetikk utgave 195
Få en A med 3Cs: Kromosomkonformasjonsfangst for studenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Joniec, A., Leszczynski, J., Ndoye,… More

Joniec, A., Leszczynski, J., Ndoye, S., Sylvia, J., Weicksel, S. E. Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates. J. Vis. Exp. (195), e65213, doi:10.3791/65213 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter