Summary
Hier presenteren we een aanpassing van de chromosoomconformatie-capture (3C) -techniek in detail met de nadruk op betrokkenheid en leren van niet-gegradueerden.
Abstract
Chromosoomconformatievangst (3C) is een krachtig hulpmiddel dat een familie van vergelijkbare technieken heeft voortgebracht (bijv. Hi-C, 4C en 5C, hier aangeduid als 3C-technieken) die gedetailleerde informatie bieden over de driedimensionale organisatie van chromatine. De 3C-technieken zijn gebruikt in een breed scala van studies, van het monitoren van de veranderingen in chromatine-organisatie in kankercellen tot het identificeren van versterkercontacten met genpromotors. Hoewel veel van de studies die deze technieken gebruiken grote genoombrede vragen stellen met ingewikkelde monstertypen (d.w.z. eencellige analyse), gaat vaak verloren dat de 3C-technieken zijn gebaseerd op elementaire moleculaire biologiemethoden die van toepassing zijn op een breed scala aan studies. Door strak gerichte vragen van chromatine-organisatie aan te pakken, kan deze geavanceerde techniek worden gebruikt om de niet-gegradueerde onderzoeks- en onderwijslaboratoriumervaring te verbeteren. Dit artikel presenteert een 3C-protocol en biedt aanpassingen en aandachtspunten voor implementatie bij voornamelijk niet-gegradueerde instellingen in niet-gegradueerde onderzoeks- en onderwijservaringen.
Introduction
Het genoom van een organisme bevat niet alleen alle genen die nodig zijn voor de functie, maar ook alle instructies over hoe en wanneer ze te gebruiken. Dit maakt het reguleren van de toegang tot het genoom een van de belangrijkste functies van de cel. Er zijn veel mechanismen om de genfunctie te controleren; op basisniveau komt genregulatie echter neer op het vermogen van regulerende transcriptiefactoren (transfactoren) om te binden aan hun specifieke DNA-sequenties (cis-regulerende sequenties). Dit is geen aangeboren vermogen; In plaats daarvan wordt het bepaald door de organisatie/structuur van het genoom in de kern, die de beschikbaarheid/blootstelling van de cis-regulerende sequenties aan de transfactoren 1,2,3 regelt. Als de transfactoren hun cis-regulerende sequenties niet kunnen vinden, kunnen de transfactoren hun regulerende taken niet uitvoeren. Dit heeft het begrijpen van hoe genomen in de kern zijn georganiseerd tot een belangrijke bron van onderzoek gemaakt.
Het is algemeen aanvaard dat eukaryote chromosomen in de kern tijdens de interfase hun eigen domein bezetten dat verankerd is aan de nucleaire lamina en nucleaire matrix (figuur 1), waardoor het chromosoom meer op een stuk pizza lijkt, in plaats van een noedel op een bord spaghetti. Chromosomen worden gedeeltelijk gecondenseerd door eiwit-DNA-interacties (chromatine) die delen van het chromosoom verdraaien en lussen. Door middel van elektronenmicroscopie, driedimensionale DNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en DNA-taggingtechnieken (d.w.z. fluorescerende en kunstmatige DNA-methylatie), zijn inactieve domeinen van chromatine strak opeengepakt langs de nucleaire periferie 4,5,6, terwijl delen van actief, minder gecondenseerd chromatine worden gevonden in het binnenste van de kern 7,8,9, 10. Deze experimenten bieden een groothoekbeeld van de chromosoomdynamica, maar doen weinig om de veranderingen vast te leggen die lokaal optreden rond de genpromotoren die zijn waargenomen in DNase11,12- en nucleosoom13,14,15-studies.
De sleutel tot het ontsluiten van chromatinedynamica met een hogere resolutie was de formulering van de 3D-chromosoomkarteringstechniek, 3C. De 3C-techniek zelf bestaat uit vier hoofdstappen: crosslinking van chromatine, chromatinevertering door restrictie-enzymen, chromatineligatie en DNA-zuivering (figuur 2). De nieuwe kunstmatige DNA-fragmenten die door dit proces worden gegenereerd, kunnen vervolgens worden gekarakteriseerd om de nauwe fysieke associatie tussen lineair verre stukjes DNAte onthullen 16. De 3C-techniek werd de basis voor het creëren van meerdere spin-off-technieken die de eerste stappen van 3C gebruiken om bredere genoombrede vragen te stellen (bijv. Hi-C, 4C, ChIP-C). Deze familie van 3C-technieken heeft vastgesteld dat chromosomen zijn georganiseerd in meerdere discrete eenheden die topologisch geassocieerde domeinen (TAD's) worden genoemd. TAD's zijn gecodeerd in het genoom en worden gedefinieerd door chromatinelussen geflankeerd door unlooped grenzen16,17,18,19. De TAD-grenzen worden gehandhaafd door twee evolutionair geconserveerde en alomtegenwoordige factoren, waaronder CCCT-bindingsfactor (CTCF) en cohesie, die voorkomen dat lussen binnen afzonderlijke TAD's interageren16,20. De lussen worden gemedieerd door de interactie van transfactoren met hun regulerende sequenties, evenals CTCF en cohesie21.
Hoewel veel studies met behulp van 3C-technologieën brede genoombrede vragen stellen en gecompliceerde monsterverzamelingstechnieken gebruiken, is de formulering van de 3C-techniek gebaseerd op elementaire moleculaire biologietechnieken. Dit maakt 3C intrigerend voor inzet in zowel niet-gegradueerde onderzoeks- als onderwijslaboratoria. De 3C-techniek kan worden gebruikt voor kleinere gerichte vragen en is inherent flexibel voor op- of afschalen (enkele genen22, chromosomen16 en / of genomen18), afhankelijk van de focus en richting van de gestelde vragen. Deze techniek is ook toegepast op een breed scala aan modelsystemen 7,16,19,23 en heeft bewezen veelzijdig te zijn in het gebruik ervan. Dit maakt 3C een uitstekende techniek voor studenten omdat studenten ervaring kunnen opdoen in gemeenschappelijke moleculaire biologietechnieken terwijl ze ook waardevolle ervaring opdoen met het beantwoorden van gerichte vragen.
Hier wordt een aangepast protocol voor 3C-bibliotheekvoorbereiding gepresenteerd op basis van eerder gepubliceerde protocollen24,25,26,27. Dit protocol is geoptimaliseerd voor ongeveer 1 × 107 cellen, hoewel het 3C-bibliotheken heeft gegenereerd met slechts 1 × 105 cellen. Dit protocol heeft bewezen veelzijdig te zijn en is gebruikt om 3C-bibliotheken te genereren uit zebravisembryo's, zebraviscellijnen en jongvolwassen (YA) Caenorhabditis elegans (rondworm). Het protocol moet ook geschikt zijn voor cellijnen van zoogdieren en, bij verdere aanpassing, gist.
Het doel van deze aanpassingen is om 3C toegankelijker te maken voor studenten. Er is voor gezorgd dat technieken worden gebruikt die vergelijkbaar zijn met die welke kunnen worden bereikt in een niet-gegradueerd onderwijslaboratorium. De 3C-techniek biedt veel leermogelijkheden voor studenten om elementaire moleculaire biologietechnieken te leren die hun ontwikkeling op de bank, in de klas en in hun inspanningen na het afstuderen ten goede zullen komen.
Protocol
1. Primer ontwerp
OPMERKING: De 3C primers design tools zijn online beschikbaar28. Als alternatief kunnen aangepaste primers worden ontworpen door de studenten (zie hieronder).
- Identificatie van primerlocaties
- Open de UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/), selecteer het onderzoeksorganisme en zoek het gebied van het genoom dat moet worden beoordeeld met behulp van 3C.
- Activeer in het volgende venster de enzymtrack op het tabblad Mapping and Sequencing onder de browser door op Restr Enzymes te klikken.
- Voer de te gebruiken restrictie-enzymen in en stel de weergavemodus in op inpakken. Klik op Verzenden.
- Controleer in Variatie en Herhalingen of RepeatMasker is ingesteld op dicht.
- Gebruik de beperkingssites als leidraad om interessante sites te identificeren die niet binnen de gemaskeerde herhalingsgebieden liggen (zwarte balken). Markeer 300 basenparen (bp) die zowel de stroomopwaartse als stroomafwaartse reeks rond de beperkingsplaats flankeren door op de positie (bovenste track) te klikken en naar de gewenste lengte te slepen (~ 600 bp).
- Laat de muis los en er verschijnt een pop-upvenster. Noteer de genomische locatie, klik op Inzoomen en laat de browser zich aanpassen aan de selectie.
- Plaats de muisaanwijzer op het tabblad Beeld op het bovenste browserlint en selecteer DNA in het vervolgkeuzemenu.
- Laat de standaardoptie staan, let op de aanduiding van gemaskeerde reeksen (er is een optie om ze N's te maken). Klik op DNA ophalen.
- De gemarkeerde volgorde wordt vervolgens in het venster weergegeven. Kopieer en plak deze reeks in Primer3 (https://primer3.ut.ee/).
- Gebruik de standaardinstellingen van Primer3 om primers te genereren door op Primers kiezen te klikken.
- Noteer in de resultaten de locatie van het restrictie-enzym en selecteer primers die een PCR-product van 200-500 bp maken met de restrictieplaats in het midden.
- Volg deze stappen en ontwerp testprimers van 1 kilobase (kb), 2 kb, 5 kb, 10 kb en 20 kb van de betreffende site(s).
- Om de primers voor invoerbesturing te ontwerpen, herhaalt u deze stappen voor een site op 1-2 kB van de betreffende site zonder een beperkingssite, wat betekent dat deze nooit wordt gesneden.
- Functionele primer validatie
- Om de primerfunctionaliteit te valideren, stelt u PCR-reacties in met behulp van getitreerde primerconcentraties en gezuiverd genomisch DNA. Bepaal met kwantitatieve of semikwantitatieve middelen of de primers het verwachte product creëren.
- Herontwerp primers die niet kunnen worden gevalideerd.
2. Dag 1
OPMERKING: Het protocol kan worden gepauzeerd (bevroren bij −20 °C) na chromatine cross-linking en na de kernverzameling. De stappen duren gemiddeld 5-6 uur met studenten.
- Jongvolwassen (YA) C. elegans kernen collectie (aangepast van Han et al.29)
- Chromatine crosslinking
- Verzamel 5.000 YA-wormen in 30 ml M9-medium in een conische buis van 50 ml en draai gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT) op 400 × g .
- Was de wormpellet nog 3x met M9 om bacteriën te verwijderen.
- Verwijder het supernatant, resuspensie van de wormkorrel in 47,3 ml M9 met 2,7 ml 37% formaldehyde (2% definitief) en incubeer met roeren (schommelen of nutteren) gedurende 30 minuten bij RT.
LET OP: Ga voorzichtig om met formaldehyde en werk onder een zuurkast met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM-laboratoriumjas, goede handschoenen en oogbescherming). Formaldehyde is een irriterend middel dat de ogen, neus, keel en longen aantast. - Draai de wormen op 400 × g gedurende 2 minuten bij RT.
- Verwijder het supernatant en resuspensie van de wormkorrel in 50 ml 1 M glycine. Draai de wormen op 400 × g gedurende 2 minuten bij RT.
- Nuclei collectie
- Resuspendeer de wormpellet in 6 ml gekoelde NP-buffer (50 mM HEPES bij pH 7,5, 40 mM NaCl, 90 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1% Tween 20, 0,2 mM DTT, 0,5 mM spermidine, 0,25 mM spermine, 1x complete proteaseremmer).
- Breng de wormsuspensie over in een 7 ml loszittende Dounce op ijs. Gooi het monster 15x en houd het 5 minuten op ijs.
- Breng de wormsuspensie over in een 7 ml nauwsluitende Dounce op ijs. Graaf het monster 20x en houd het 5 minuten op ijs.
- Breng de wormsuspensie over in een schone conische buis van 15 ml en voeg de NP-buffer toe tot 10 ml in totaal (ongeveer 4 ml).
- Vortex de wormsuspensie op een hoge stand gedurende 30 s. Incubeer het monster gedurende 5 minuten op ijs.
- Herhaal de vorige stap.
- Draai de wormsuspensie gedurende 5 minuten op 100 × g bij 4 °C.
- Breng het supernatant over in een verse conische buis van 15 ml.
- Controleer het monster op wormresten. Visualiseer 10 μL van het monster met een lichtmicroscoop. Als er wormresten aanwezig zijn, draait u het monster gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 2.000 × g, suspensie de pellet in een verse NP-buffer van 10 ml en draait u het monster opnieuw bij 100 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi de pellet weg, controleer het supernatant op wormresten en herhaal dit totdat het monster vrij is van wormresten.
OPMERKING: Als alternatief kan het wormafval ook worden verwijderd door het monster door een 40 μm celzeef (6x) gevolgd door een 20 μm celzeef (6x) te persen. - Als het monster vrij is van wormresten, neem dan 5 μL van het monster, voeg 5 μL methylgroene pyronine toe (de kernen zullen blauw zijn) en tel de kernen met een hemocytometer.
- Draai het monster gedurende 5 minuten bij 2.000 × g bij 4 °C
- Verwijder het supernatant, plaats de monsters op ijs en ga verder; als alternatief, klik-vries de kernen, en bewaar bij −80 °C.
- Chromatine crosslinking
- Chromatine vertering
- Resuspendeer de kernen in 450 μL schoon water. Breng de kernen over in een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Voeg aan het verknoopte monster 60 μL 10x DpnII-restrictie-enzymbuffer toe en meng goed.
OPMERKING: Andere restrictie-enzymen die nog steeds verknoopt DNA knippen, kunnen worden gebruikt. - Voeg 15 μL 10% natriumdodecylsulfaat (SDS) toe om de kernen te permeabiliseren en incubeer met roeren (schommelen of nutateren) bij 37 °C gedurende 1 uur.
LET OP: SDS is irriterend en is giftig als het wordt ingenomen of door de huid wordt opgenomen. Behandel met zorg en gebruik de juiste PBM's (laboratoriumjas, goede handschoenen en oogbescherming). - Blus de SDS door 75 μL 20% Triton X-100 toe te voegen en gedurende 1 uur te broeden met roeren bij 37 °C.
- Neem 10 μL uit het monster als een onverteerde controle. Bewaren bij 4 °C.
- Voeg 400 U DpnII toe en incubeer bij 37 °C gedurende een nacht onder roeren.
3. Dag 2
OPMERKING: Gemiddeld duurt het 5 uur voordat studenten deze stappen voltooien.
- Chromatine vertering
- Voeg nog eens 200 E DpnII toe en incuber de monsters gedurende 4 uur bij 37 °C met roeren om de volledige vertering van het verknoopte monster te garanderen.
- Neem een aliquot van 10 μL uit de monsters als verteringscontrole.
- Warmte inactiveren van het restrictie-enzym door het monster gedurende 20 minuten bij 65 °C (of volgens de instructies van de fabrikant) te incuberen. Ga verder met stap 2.1.3.
- Als het enzym niet door warmte kan worden geïnactiveerd, voeg dan 80 μL 10% SDS toe en incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 65 °C. Voeg vervolgens 375 μL 20% Triton X-100 toe en meng door te draaien. Incubeer het monster gedurende 1 uur bij 37 °C en ga verder met stap 2.2.
- Chromatine ligatie
- Breng het monster over in een schone conische buis van 50 ml, stel het monstervolume in op 5,7 ml met H2O van moleculaire kwaliteit en meng door te draaien.
- Voeg 700 μL 10x T4 Ligase-buffer toe en meng door te draaien.
- Voeg 60 U T4 DNA Ligase toe en meng door te wervelen.
- Incubeer een nacht bij 16 °C.
4. Dag 3
OPMERKING: Gemiddeld duurt het 15-30 minuten voordat studenten deze stappen voltooien. Na de nachtelijke incubatie kunnen de monsters worden ingevroren.
- Eiwitvertering en reverse crosslinking
- Voeg 30 μL proteïnase K (10 mg/ml) toe aan het 3C-monster en incubeer bij 65 °C gedurende een nacht met roeren. Voeg 5 μL proteïnase K (10 mg/ml) toe aan de onverteerde en verteringscontrole en incubeer bij 65 °C gedurende een nacht met roeren.
5. Dag 4
OPMERKING: Gemiddeld duurt het 4-5 uur voordat studenten deze stappen voltooien.
- Zuivering van de 3C-bibliotheek
- Voeg 30 μL RNase A (10 mg/ml) toe aan het 3C-monster en draai om te mengen. Incubeer het monster gedurende 45 minuten bij 37 °C.
- Voeg 7 ml fenol-chloroform toe aan het monster en meng door te schudden.
LET OP: Fenol-chloroform is een huid- en oogirritant en kan brandwonden veroorzaken als contact niet wordt behandeld. Fenol-chloroform moet worden gebruikt in een zuurkast met de juiste oogbescherming en handschoenen (nitril). - Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 3.270 × g bij RT. Verzamel de waterige fase en breng over in een schone conische buis van 50 ml. Voeg gelijke hoeveelheden chloroform toe en meng het monster door te schudden.
- Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 3.270 × g bij RT. Verzamel de waterige fase en breng over in een schone conische buis van 50 ml. Voeg 7,5 ml moleculair H2O, 35 ml 100% ethanol en (optioneel) 7 μl glycogeen (1 mg / ml) toe. Meng door schudden en incubeer bij −80 °C totdat het monster bevroren is.
OPMERKING: Het kan 1 uur of langer duren voordat het monster bevriest. Het protocol kan hier worden gepauzeerd.- Terwijl het 3C-monster bevriest, zuivert u de controlemonsters. Stel aan de controlemonsters het volume in op 500 μL met water van moleculaire kwaliteit en voeg 2 μL RNase A (10 mg / ml) mix toe door op de buis te vegen.
- Draai kort om het monster aan de onderkant van de buis te verzamelen. Incubeer de monsters gedurende 45 minuten bij 37 °C.
- Voeg aan de controlemonsters 1 ml fenol-chloroform toe en meng door de buizen te schudden. Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 3.270 × g bij RT. Verzamel de waterige fase van de bedieningselementen en plaats in een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Voeg gelijke hoeveelheden chloroform toe en meng het monster door te schudden. Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 3.270 × g bij RT. Verzamel de waterige fase van de bedieningselementen en plaats in een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Voeg 1 ml 100% ethanol en 2 μL glycogeen (1 mg/ml) toe. Meng door schudden en incubeer bij −80 °C gedurende 30 min.
- Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 3,270 × g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en voeg 750 μL gekoelde 70% ethanol toe.
- Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 3,270 × g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en droog de monsters aan de lucht. Resuspendeer de pellet in 50 μL van moleculaire kwaliteit H2O. Bevries, of ga verder met stap 6.
- Centrifugeer het monster gedurende 60 minuten bij 3.270 × g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en voeg 10 ml gekoelde 70% ethanol toe. Verstoor en breek de DNA-pellet door het monster te schudden om te mengen.
- Centrifugeer het monster gedurende 30 minuten bij 3,270 × g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en laat het monster gedeeltelijk aan de lucht drogen bij RT. Resuspendeer de pellet in 150 μL van 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) door op en neer te pipetteren. Dit is de '3C-bibliotheek'.
OPMERKING: Bevries het monster of ga verder met de analyse.
6. Dag 5
OPMERKING: Gemiddeld duurt het 1-2 uur voordat studenten deze stappen voltooien.
- Het bepalen van de monsterkwaliteit met behulp van de standaardcurve van de controleprimer
- Kwantificeer de DNA-concentratie voor het 3C-monster en alle controles en pas de monsters aan tot 30 μg / μL (als de concentraties dit toelaten). Serieel worden de verdunde monsters vier keer tweemaal gebruikt, wat resulteert in vijf verdunningen voor elk monster (1x, 0,5x, 0,25x, 0,125x, 0,0625x).
OPMERKING: Als kwantificering niet gemakkelijk kan worden uitgevoerd, verdunt u de monsters serieel zoals hierboven aangegeven en gaat u verder. - Stel PCR-reacties in voor de 3C, genomische controle en verteerde controle voor elk verdund monster met de controleprimers: 1 μL DNA, 10 μL 5x reactiebuffer, 1 μL 10 mM dNTPs, 1 μL 10 mM controleprimer (voorwaarts en omgekeerd gemengd), 1 μL Taq-polymerase en 36 μL water.
- Volg de instructies voor de software die specifiek is voor de PCR-machine en stel het standaard curve PCR-programma in met behulp van fietsomstandigheden als volgt: 30 s bij 98 °C; 30 cycli van 5 s bij 98 °C, 5 s bij 60 °C en 10 s bij 72 °C; 1 min bij 72 °C; 4 °C vasthouden.
- Genereer met behulp van de software de standaardcurven voor de monsters. Nadat de software de curve heeft gegenereerd, let op de PCR-efficiëntie en R2-waarde .
- Kwantificeer de DNA-concentratie voor het 3C-monster en alle controles en pas de monsters aan tot 30 μg / μL (als de concentraties dit toelaten). Serieel worden de verdunde monsters vier keer tweemaal gebruikt, wat resulteert in vijf verdunningen voor elk monster (1x, 0,5x, 0,25x, 0,125x, 0,0625x).
- Bepaling van de DNA-concentratie
- Om de DNA-concentratie van de 3C-monsters te bepalen, vergelijkt u de monsters met een genomisch DNA-monster met een bekende concentratie. Verdun de monsters tot 30 ng/μl en verdun de genomische controle serieel van 10 ng/μl tot 0,01 ng/μl in tweevoudige stappen om een standaardcurve te creëren.
OPMERKING: Als kwantificering niet gemakkelijk kan worden uitgevoerd, verdunt u het monster 1:10 en gaat u verder. - Stel de PCR-reacties in voor de 3C, genomische controle en verteerde controle voor elk verdund monster met de controleprimers: 1 μL DNA, 10 μL 5x reactiebuffer, 1 μL 10 mM dNTPs, 1 μL 10 mM controleprimer (vooruit en achteruit gemengd), 1 μL Taq-polymerase en 36 μL water.
- Volg de instructies voor de software die specifiek is voor de PCR-machine en stel het standaard curve PCR-programma in met behulp van de cyclusomstandigheden als volgt: 30 s bij 98 °C; 30 cycli van 5 s bij 98 °C, 5 s bij 60 °C en 10 s bij 72 °C; 1 min bij 72 °C; 4 °C vasthouden.
- Genereer met behulp van de software de standaardcurven voor de monsters en plot de 3C-monsters op de curve. Vergelijk de positie van de abundantie van het 3C-monster met de standaardcurve die wordt gecreëerd door de reacties van het genomische DNA met een bekende concentratie en pas de 3C-monsters aan tot 30 ng / μL.
- Om de DNA-concentratie van de 3C-monsters te bepalen, vergelijkt u de monsters met een genomisch DNA-monster met een bekende concentratie. Verdun de monsters tot 30 ng/μl en verdun de genomische controle serieel van 10 ng/μl tot 0,01 ng/μl in tweevoudige stappen om een standaardcurve te creëren.
- Bepaling van de aan- of afwezigheid van chromatine-interactie
- Stel qPCR-reacties in met 30 ng van het 3C-monster, genomisch controlemonster en verteerd controlemonster: 1 μL DNA, 10 μL 5x reactiebuffer, 1 μL van 10 mM dNTPs, 1 μL van 10 mM primer (voorwaarts en omgekeerd gemengd), 1 μL Taq-polymerase en 36 μL water.
OPMERKING: De reacties moeten worden ingesteld met behulp van de controleprimer, de testprimers voor individuele genomische loci en de gewenste combinaties van de testprimers (plaats "a" naar voren en plaats "b" omgekeerd) die worden gebruikt om de chromatine-interactie te bepalen (figuur 3). - Volg de instructies voor de software van de PCR-machine en stel het PCR-programma als volgt in: 30 s bij 98 °C; 40 cycli van 5 s bij 98 °C, 5 s bij 60 °C en 10 s bij 72 °C; 1 min bij 72 °C; 4 °C vasthouden.
- Nadat de PCR is uitgevoerd, inspecteert u de versterkingsplot. Zorg ervoor dat de PCR-reacties exponentiële versterking vertonen, waardoor elke cyclus wordt verdubbeld.
OPMERKING: Reacties die geen exponentiële versterking vertonen, kunnen niet verder worden geanalyseerd. - Volg de instructies voor de software van de PCR-machine en definieer de drempel van het qPCR-experiment.
- Exporteer de Ct-waarden voor alle monsters.
- Bepaal de vergistingsefficiëntie met behulp van de testprimer (TP) en control primer (CP) Ct-waarden van de onverteerde controle (UC) en de verteerde controlemonsters (DC) met behulp van vergelijking (1).
Percentage verteerd = 100 -
(1) - Deze waarden moeten in het bereik van 80% -90% vertering liggen. Noteer deze waarden (figuur 4A).
- Bepaal de relatieve chromatine-interactie met behulp van de testprimercombinatie (TPC) en control primer (CP) Ct-waarden van de onverteerde controle (UC) en de 3C (3C) monsters met behulp van vergelijking (2).
Chromatine interactie = 100 -
(2) - Zet de waarden voor elk monster uit in een staafdiagram voor elke testprimercombinatie.
- Vergelijk het signaal van de 3C-monsters met de controlemonsters om te bepalen of het 3C-monster verrijking heeft van een bepaalde chromatine-interactie over de controlemonsters. 3C-monsters die verrijking ten opzichte van de controle laten zien, kunnen als voorwaardelijk positief worden beschouwd en moeten worden gevalideerd met behulp van Sanger-sequencing (figuur 4B).
OPMERKING: Bij het analyseren van de grafiekgegevens is het belangrijk om te onthouden dat tenzij een "controlesjabloon" wordt gebruikt (zie discussie), de overvloed tussen reacties (d.w.z. van de ene set primers naar de volgende) niet kan worden vergeleken.
- Stel qPCR-reacties in met 30 ng van het 3C-monster, genomisch controlemonster en verteerd controlemonster: 1 μL DNA, 10 μL 5x reactiebuffer, 1 μL van 10 mM dNTPs, 1 μL van 10 mM primer (voorwaarts en omgekeerd gemengd), 1 μL Taq-polymerase en 36 μL water.
- Identificatie van de 3C-producten
- Voer de PCR-producten uit op een 1,5% agarose-gel.
- Visualiseer de gel voor de juiste grootte van de PCR-producten met behulp van een UV-lichtbak of geldocumentatiesysteem.
OPMERKING: Goed geconstrueerde 3C-bibliotheken zullen een breed scala aan DNA-fragmenten bevatten, en ondanks eerdere validatie van de primers voor specificiteit, hebben PCR-reacties van 3C-bibliotheken het potentieel om veel banden te bevatten (figuur 5A). Dit staat de analyse van de 3C-bibliotheken niet in de weg. - Snijd de productbanden weg die overeenkomen met de verwachte fragmentgrootte en voer gelextractie van de PCR-producten uit volgens de instructies van een commerciële kit of het zelfgemaakte protocol dat hieronder wordt beschreven.
LET OP: UV-licht is een bekend carcinogeen en er moet grote zorg worden besteed aan het beperken van de tijd die wordt blootgesteld aan UV-licht. UV-bestendige oogbescherming, een monsterschild, handschoenen en een laboratoriumjas moeten worden gedragen.- Om een zelfgemaakte zuiveringspatroon te maken, prikt u met een naald een gat in de bodem van een buis van 0,5 ml.
- Verpak een kleine hoeveelheid katoen van een watje in de bodem van de 0,5 ml buis en vul niet meer dan de helft van de buis.
- Plaats de buis van 0,5 ml in een buis van 1,5 ml; Zorg ervoor dat de kleinere tube op de lip van de grotere tube rust, niet in de tube.
- Snijd een gelfragment voorzichtig in kleinere stukjes en plaats het in de 0,5 ml buis van de patroon.
- Plaats de montage gedurende 5 minuten in een vriezer van −20 °C. Draai de montage gedurende 3 minuten op 13.000 × g bij RT.
- Houd de buis van 1,5 ml met het geëxtraheerde DNA in buffer en gooi de buis van 0,5 ml met het agarose-puin weg.
- Gezuiverd DNA kan worden verzonden voor Sanger-sequencing met behulp van voorwaartse en omgekeerde primers voor het 3C-fragment.
- Identificatie van chromatinecontacten met Blat
- Bepaal na voltooiing van de sequencing of de monsters voldoen aan de kwaliteitscontrolenormen zoals aangegeven in het sequencingrapport.
- Voor reeksen die de QC passeren, opent u .seq- en .ab1-bestanden (traceren) in een sequencingbewerkingsprogramma zoals Another Plasmid Editor (ApE), inspecteert u het .ab1-bestand op duidelijke basisaanroeppieken en bewerkt u de pieken die verkeerd zijn aangeroepen in het .seq-bestand.
- Zoek met het bewerkte SEQ-bestand naar de DpnII-site. Afhankelijk van het resultaat van de sequentie moet dit halverwege de gerapporteerde reeks zijn.
- Om te bepalen of de sequentie de verwachte doelsequentie is, markeert u de DpnII-site en een extra 30-50 bp van de upstream-sequentie die overeenkomt met de voorwaartse primer van de genomische loci getest op 3C. Voer een Blat-zoekopdracht uit van deze reeks tegen de doelsoort. Zorg ervoor dat de genomische loci overeenkomen met die van de primer.
- Herhaal de bovenstaande stap voor de omgekeerde primervolgorde en zorg ervoor dat de genoomlocus die terugkeert overeenkomt met die van de omgekeerde primer.
(1)
(2)Representative Results
Deze procedure zal één experimenteel 3C-monster en twee controlemonsters (onverteerd en verteerd) opleveren. Met behulp van deze drie monsters werd qPCR uitgevoerd. Op basis van deze resultaten werd de verteringsefficiëntie berekend (vergelijking 1) en geregistreerd (tabel 1). Uit deze berekeningen werd vastgesteld dat het 3C-monster een verteringsefficiëntie van ongeveer 88% had (gemiddelde van tabel 1) over de zeven geteste genomische loci.
Vervolgens werden de monsters getest op de aanwezigheid van langeafstandschromatinecontacten tussen de verschillende genomische loci met behulp van combinaties van loci-specifieke primers (tabel 2) en qPCR. Met behulp van deze resultaten werden de productabundanties ten opzichte van een controleprimerset berekend (vergelijking 2) en in een grafiek weergegeven voor vergelijking (figuur 4). Deze gegevens gaven aan dat 8 van de 10 reacties voorwaardelijke positieven waren voor interacties op lange termijn.
De PCR-reacties werden vervolgens uitgevoerd op een agarosegel. Het verwachte PCR-product voor de acht voorwaardelijke positieven en één negatieve reactie werd gelgezuiverd en verzonden voor Sanger-sequencing. De resultaten voor representatieve positieve (blauwe pijl, blauw vak) en negatieve (rode pijl, rood vak) reacties worden getoond (figuur 5).
Figuur 1: Chromosoomstructuur in de kern. Hypothetische chromosoomorganisatie in de kern. A) nucleaire enveloppe, zwarte lijnen; B) nucleaire lamina, sinaasappel; C) heterochromatine, verdichte lijnen; D) euchromatine, losse lussen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schema van het 3C-protocol. Verre delen van lineaire chromosomen (blauw, geel en roze) worden dicht bij elkaar gebracht in de kern door middel van regulerende lussen. (A) De lusstructuren worden gemedieerd door transcriptiefactoren (grijze cirkel en zwarte ster); Deze interacties worden behouden door chemische crosslinking. (B) De lussen worden doorbroken door enzymatische vertering (zwarte lijnen). (C) Verre chromatinestukjes worden aan elkaar gehecht door de klevende uiteinden die door de vertering ontstaan. (D) DNA wordt gezuiverd uit eiwitten. (E) De sequentie in de fragmenten wordt geïdentificeerd en teruggekoppeld naar het genoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het 3C primer schema. De 3C-primers zijn ontworpen rond restrictieplaatsen op verschillende afstanden van de genomische locatie van belang. De roze pijlen vertegenwoordigen de experimentele primersets rond een DpnII-site. De experimentele primers kunnen worden gemengd en gematcht om chromatine looping in de regio te beoordelen. De oranje primers vertegenwoordigen een negatieve controle zonder een DpnII-site. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve qPCR-gegevens voor een 3C-experiment. Relatieve abundantie van de 3C test primer sets. (A) Controlegrafiek die de relatieve abundantie van het product in het onverteerde controlemonster (blauw), verteerd controlemonster (grijs) en 3C-monster (oranje) weergeeft. (B) Het 3C-experiment; de relatieve abundantie van het product uit combinaties van testprimers in de onverteerde controle (blauw), verteerde controle (grijs) en 3C-monster (oranje). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Visualisatie van de 3C qPCR producten. Top, gel met de qPCR endpoint producten met de monsters aangegeven. Onderaan, representatieve Sanger sequentie traceerbestanden voor de aangegeven reacties. Het oranje monster is een voorbeeld van een vals positief (zie figuur 4, r38/34), en het blauwe monster is een voorbeeld van een echt positief met de DpnII-site aangegeven boven het spoor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Ligging | % vertering |
| R8 | 86.98 |
| R3 | 88.44 |
| R38 | 89.64 |
| R34 | 87.55 |
| R33 | 87.85 |
| R14 | 86.97 |
| R47 | 89.45 |
Tabel 1: Berekende vergistingsefficiëntie.
| Naam | Volgorde | Genomische loci | ||
| r3 FWD | ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC | chrX:11361475 | ||
| R3 RVS | TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC | chrX:11361561 | ||
| r38 FWD | TTACTTCTGAAGTAATCTTTTTTTTATCCCC | CHRX: 5859700 | ||
| R38 RVS | AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG | chrX:5859775 | ||
| R34 FWD | ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG | chrX:5429702 | ||
| R34 RVS | AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC | chrX:5429777 | ||
| r33 FWD | AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC | chrX:6296704 | ||
| R33 RVS | TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG | chrX:6296807 | ||
| r14 FWD | AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG | chrX:8036367 | ||
| R14 RVS | ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTC | chrX:8036427 | ||
| r47 FWD | ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC | chrX:9464939 | ||
| R47 RVS | AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC | chrX:9465064 | ||
| r8 FWD | GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG | chrX:11094257 | ||
| R8 RVS | TTACGAAATTTGGTAGTTTTGTACC | chrX:11094362 | ||
| Controle primer FWD | CAATCGTCTCGCTCACTTGTC | chrX:7608049 | ||
| Controle primer RVS | GATGTGAGCAACAAGGCACC | chrX:7608166 | ||
Tabel 2: Primers voor het representatieve 3C experiment.
Discussion
De 3C is een krachtige techniek die geworteld is in moleculaire basistechnieken. Het is deze basis van fundamentele hulpmiddelen die 3C zo'n intrigerende techniek maakt om te gebruiken met studenten. Met zoveel recente studies die chromatinedynamica op zo'n grote schaal observeren, heeft het gebruik van deze resultaten om een smal gericht experiment op een enkel gen of genomisch gebied te bedenken, het potentieel om een uniek en impactvol experiment in niet-gegradueerd onderzoek te creëren. Vaak worden experimenten zoals deze als te geavanceerd beschouwd voor studenten, maar met een zorgvuldige planning zijn ze gemakkelijk haalbaar. Het is belangrijk op te merken dat de testen die zijn ontworpen om de chromatineverbindingen te onderzoeken die door de 3C-bibliotheek zijn vastgelegd, kunnen variëren van semi-kwantitatieve eindpunt-PCR tot sequentiebepaling van het hele genoom. In feite werden gegevens van de eerste 3C-paper16 gegenereerd uit qPCR. Dit brede scala aan testen kan allemaal worden gebruikt omdat alle 3C-technologieën hetzelfde product produceren - een bibliotheek van DNA-fragmenten die 3D-verbindingen in de kern vertegenwoordigen.
Hier wordt een aanpassing gepresenteerd van een flexibeler en meegaand protocol dat beter past bij niet-gegradueerde onderzoekers. De hierboven genoemde pauzeperioden impliceren nachtelijke vertragingen; Deze pauzes kunnen zich echter uitstrekken over het weekend en, in het geval van de cellen en kernen, over weken. De meest cruciale overweging is wanneer het werk gedaan zal worden. Vaak zijn er in protocollen tijdgevoelige stappen wanneer pauzeren geen optie is. Buiten een paar punten (dag 1 en dag 2) zijn er veel plaatsen om te stoppen en het monster in te vriezen. Deze zijn van cruciaal belang bij het werken met studenten waarbij de schema's en timings van laboratoriumwerk flexibel moeten zijn. Naast het engineeren van deze stops in het protocol, worden studenten aangemoedigd om in paren of zelfs kleine groepen van drie of vier te werken. Groepen werken goed voor dit protocol, omdat de studenten elkaar kunnen ondersteunen en een buddy-systeem kunnen creëren zodat iedereen veilig werkt. Labwerk is ook leuker met andere betrokkenen. Met groepen kunnen studenten ook werken aan een verscheidenheid aan vragen gericht op de organisatie van chromatine terwijl ze nog steeds hetzelfde protocol uitvoeren. Dus zelfs terwijl studenten aan afzonderlijke projecten werken, koppelt het protocol hun inspanningen en daarom kunnen ze elkaar ondersteunen.
Andere aanpassingen zijn bedoeld om het feit te omzeilen dat bepaalde gespecialiseerde gereedschappen en apparatuur niet noodzakelijkerwijs in alle niet-gegradueerde instellingen te vinden zijn. Deze apparatuur omvat maar is niet beperkt tot qPCR-thermocyclers, geldocumentatiesystemen en nanovolumespectrometers. Inderdaad, deze apparaten zijn handig, maar zijn geen vereiste. Hier wordt de klassieke methode van 3C ook beschreven in het primerontwerpgedeelte; Dit omvat het identificeren van een genomische locus van belang en van daaruit het beoordelen van andere genomische loci voor chromatinecontactpunten verder weg. Deze techniek werkt ook goed als een gepubliceerde dataset wordt gebruikt, zoals een dataset met Hi-C, waar bekende positieve (verbindende) en negatieve (niet-verbindende) loci worden geïdentificeerd. Het ontwerpen van experimenten met behulp van deze gepubliceerde datasets is een andere geweldige aanpassing voor onderwijslaboratoria, omdat de kans op de succesvolle identificatie van chromatineverbindingen meestal groter is. Bovendien kan het onderzoeksartikel in de klas worden besproken en als referentie worden gebruikt.
Dit protocol maakt gebruik van een aangepaste qPCR-benadering om de 3C-productvorming te visualiseren. Besturing is essentieel voor het succes van de 3C-techniek. Elk experiment gebruikt zowel monstercontroles als primercontroles om de voltooiing van de 3C-procedure te bepalen. De monstercontroles omvatten een onverteerde controle (genomisch DNA) en verteerde controle. De onverteerde controle bepaalt het basissignaal voor de primersets en wordt gebruikt met de cross-linked digestiecontrole om de verteringsefficiëntie te bepalen Er wordt verwacht dat er een daling van het product zal zijn voor primers die over een restrictieplaats zijn gericht. Door deze waarde te vergelijken met de onverteerde controle wordt een indicatie gegeven van hoe goed het monster is verteerd.
De primers voor de PCR bevatten een control primer en test primers. De controleprimer is een primerset die zich in de buurt van het genomische gebied bevindt dat wordt getest en geen restrictieplaats bevat. Dit vormt de basis voor het bepalen van de abundantie van de PCR-producten van de testprimer. Testprimers zijn voorwaartse en omgekeerde primers die een restrictieplaats flankeren voor een bepaalde genomische locus van belang (figuur 3). Reacties met behulp van deze primersets worden vergeleken om de verteringsefficiëntie te bepalen, omdat de productrijkdom zou moeten dalen als de restrictieplaats is gesneden. Bij het bepalen van de chromatine-organisatie wordt één testprimer van één locus gekoppeld aan een andere testprimer van een andere genomische locus om te bepalen of deze twee loci dicht bij elkaar liggen in de 3D-ruimte. In dat geval is de verwachting dat een PCR-product alleen gevonden zou worden met het 3C-monster als sjabloon.
Het is belangrijk op te merken dat zelfs gevalideerde primers de neiging hebben om te falen (Figuur 4: r14 primer set). Bovendien worden PCR-producten vaak geïdentificeerd in controlereacties en in reacties waarbij een chromatineverbinding niet wordt voorspeld (zoals de verteerde controle, omdat deze niet geligeerd is). Deze instanties worden gesequenced en falen Sanger QC of keren terug zonder een gedefinieerde volgorde (Figuur 5). Bovendien genereren traditionele 3C-experimenten een "controlesjabloon", een niet-gekruist, verteerd en geligeerd DNA-monster, dat alle mogelijke geligeerde fragmenten vertegenwoordigt die met een bepaalde hoeveelheid DNA kunnen worden geproduceerd. De "controlesjabloon" speelt een belangrijke rol bij het vergelijken van de intensiteiten van qPCR-signalen tussen twee genomische loci om te bepalen of het signaal een echte interactie vertegenwoordigt of slechts een willekeurige associatie. Het maken van een "controlesjabloon" kan problematisch zijn, omdat een groot deel van het chromatine dat wordt getest moet worden gevangen in de vorm van een kunstmatig chromosoom en samen met de 3C-monsters moet worden verwerkt. Het beveiligen van een dergelijke constructie is misschien niet haalbaar en het maken ervan kan buiten het bestek van een semesterproject vallen. Vanwege deze problemen raden we aan om een controleprimer te gebruiken. De control primer vervangt niet alle functionaliteit van de "control template" maar biedt nog steeds de mogelijkheid om de data te analyseren om "presence" of "absence" bepalingen te doen.
Bij het uitvoeren van qPCR is het gebruik van gelijke hoeveelheden van het monster belangrijk. Dit moet worden bepaald, zelfs met behulp van een nanospectrofotometer zoals een nanodruppel, door een standaardcurve te genereren uit genomisch DNA van een bekende concentratie en de 3C-monsters op die lijn aan te passen. Deze bedragen moeten worden geregistreerd en gebruikt in volgende PCR's. De kwaliteit van de PCR-reactie is ook belangrijk. Omdat de PCR in qPCR draait, wordt de productrijkdom gemeten met behulp van fluorescentie en geregistreerd. Deze opname is toegankelijk in de versterkingsplot. Zodra het programma is voltooid, is het belangrijk om de versterkingsplot te controleren en ervoor te zorgen dat de reacties (behalve de no template controls) drie fasen hebben: een basislijn, een exponentiële en een plateau / verzadigingsfase. Het is belangrijk om te controleren of de reacties een exponentiële fase hebben, met name voor het instellen van de drempel (zie hieronder). Bovendien moet er voor serieel verdunde monsters een verschuiving in Ct-waarden optreden die consistent is met de verdunning van het monster (de hoogste concentratie heeft de laagste Ct-waarden, terwijl de laagste concentratie de hoogste Ct-waarden heeft). Monsters die deze verandering in de amplificatieplot niet weerspiegelen, vereisen een nieuwe verdunning of wijzen op een groter probleem met de 3C-monstervorming. Ten slotte berekent de PCR-software tijdens het genereren van de standaardcurve de PCR-efficiëntie en de R2-waarde . Het PCR-rendement moet groter zijn dan 90% en de R2-waarde moet groter zijn dan 0,99. Als aan een van deze voorwaarden niet wordt voldaan, is het waarschijnlijk dat er iets mis is met het monster of de PCR-primers.
Na qPCR kunnen het percentage vertering en de aanwezigheid van 3C-interacties worden berekend met behulp van de qPCR Ct voor elke reactie. Om deze te bepalen, moet eerst de drempel voor de PCR-reactie worden ingesteld. Dit wordt normaal gesproken gedaan met behulp van de software die bij de qPCR-machine wordt geleverd. Door de drempel in te stellen, wordt de concentratie van het PCR-product gedefinieerd die zal worden gebruikt om de ct-waarden van het monster te vergelijken. De drempel moet de amplificatiecurven van de PCR-reacties in de exponentiële fase van amplificatie doorsnijden. Alleen PCR-reacties met exponentiële amplificatie kunnen worden vergeleken (in dit geval de controleprimers en de testprimerreacties), omdat dit de enige manier is om ervoor te zorgen dat de reacties DNA met dezelfde snelheid versterken en getrouw kunnen worden vergeleken. Bij het analyseren van de 3C-grafieken worden voorwaardelijk positieve reacties geïdentificeerd als die met meer product dan de controlemonsters, genomische controle en de verteringscontrole (figuur 4B). Deze monsters moeten echter verder worden gevalideerd met behulp van Sanger-sequencing na de gelzuivering van het PCR-product.
Na Sanger-sequencing kunnen monsters die de QC passeren, worden geanalyseerd met Blat. Het doel van deze analyse is om te bepalen of het monster de sequentie heeft van beide doelgenomische loci die de restrictieplaats flankeren (DpnII in het geval van dit protocol). Als beide sequenties worden geïdentificeerd, kan het 3C-fragment als gevalideerd worden beschouwd. Als de resultaten van de Blat niet de verwachte volgorde opleveren, kan dit erop wijzen dat een of beide primers niet optimaal zijn, wat resulteert in een vals positief qPCR-resultaat. De traceerbestanden voor de fout-positieve monsters hebben ongedefinieerde basispieken en de Seq-rapporten bevatten meestal "n" basisaanroepen.
Sanger-validatie is essentieel, omdat valse positieven van artefactuele PCR-productvorming mogelijk zijn. Deze fout-positieven kunnen worden geïdentificeerd wanneer de sequencingproducten niet de verwachte doelsequentie of een DpnII-locatie hebben die kenmerkend is voor een goed 3C-fragment (figuur 5). De sequencing van de PCR-fragmenten biedt ook een ander gegevenspunt voor het experiment en maakt de studenten duidelijk dat de 3C-techniek verre genomische loci identificeert die samenkomen in de 3D-ruimte in de kernen.
De 3C-techniek biedt een schat aan fundamentele moleculaire technieken voor studenten in een flexibele, eenvoudige procedure. Deze 3C-techniek is ook een startpunt voor de andere 3C-technieken die next-generation sequencing (NGS) bevatten. Dit soort experimenten kunnen studenten blootstellen aan belangrijke aspecten van bio-informatica en zijn geworteld in de basisprincipes die hier worden beschreven. Undergraduate ervaring en betrokkenheid zijn de sleutel tot hun succes en ontwikkeling als jonge wetenschappers. Door deze kansen te bieden, kunnen studenten hun begrip van basisprincipes versterken en tegelijkertijd hun zelfvertrouwen opbouwen om geavanceerde technieken en vragen aan te pakken.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder subsidienummer P20GM103430 en het Bryant Center of Health and Behavioral Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Millapore-Sigma | F8775 | |
| 100% Ethanol | Millapore-Sigma | E7023 | |
| CaCl2 | MP Biomedical | 215350280 | |
| chloroform | Millapore-Sigma | C0549 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millapore-Sigma | COEDTAF-RO | mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh |
| Dithiothreitol (DTT) | Millapore-Sigma | D0632 | 1 M stock diluted to 500 µM in Sucrose buffer and GB buffer fresh |
| DpnII | NEB | R0543M | |
| Glycerol | Millapore-Sigma | G9012 | |
| glycine | Millapore-Sigma | G8898 | |
| glycogen | Millapore-Sigma | 10901393001 | |
| HEPES | Millapore-Sigma | H3375 | |
| KCl | Millapore-Sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | Millapore-Sigma | P5655 | |
| methyl green pyronin | Millapore-Sigma | HT70116 | |
| MgAc2 | Thermoscientific | 1222530 | |
| Na2HPO4 | Millapore-Sigma | S5136 | |
| NaCl | Millapore-Sigma | S9888 | |
| phenol-chloroform | Millapore-Sigma | P3803 | |
| Pronase | Millapore-Sigma | 11459643001 | |
| Proteinase K | IBI Scientific | IB05406 | |
| qPCR Ready mix (Phire Taq etc) | Millapore-Sigma | KCQS07 | |
| RNase A | Millapore-Sigma | R6148 | |
| Sodium Acetate | Millapore-Sigma | S2889 | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Millapore-Sigma | L3771 | |
| Sucrose | Millapore-Sigma | S0389 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1804 | |
| Tris-HCl | Millapore-Sigma | 108319 | |
| Triton X-100 | Millapore-Sigma | T9284 | |
| Trypsin-EDTA | Millapore-Sigma | T4049 |
References
- McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C.
- Nalabothula, N., et al. The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation. BMC Genomics. 15, 92 (2014).
- John, S., et al. Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns. Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).
- Fawcett, D. W. On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates. The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).
- Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina. Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).
- Finlan, L. E., et al. Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells. PLoS Genetics. 4 (3), e1000039 (2008).
- Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development. Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).
- Chambeyron, S., Bickmore, W. A. Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription. Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).
- Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories. The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).
- Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH. The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).
- Li, B., Carey, M., Workman, J. L.
- Chen, A., Chen, D., Chen, Y. Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals. Gene. 667, 83-94 (2018).
- Hughes, A. L., Rando, O. J. Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo. Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).
- Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging. Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).
- Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern. Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N.
- van Berkum, N. L., Dekker, J. Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology. Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).
- Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus. American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).
- Crane, E. E. Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2. University of California, Berkeley. , PhD thesis (2012).
- Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell. 98 (3), 387-396 (1999).
- Cuadrado, A., et al. Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells. Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).
- Sarro, R., et al. Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development. Development. 145 (7), (2018).
- Tolhuis, B., et al. Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture. PLoS Genetics. 7 (3), e1001343 (2011).
- Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
- Fernández-Miñán, A., Bessa, J., Tena, J. J., Gómez-Skarmeta, J. L. Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish. Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).
- Dekker, J. The three "C" s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).
- Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).
- Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies. Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).
- Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression. BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).
