Summary
Aquí, presentamos una adaptación de la técnica de captura de conformación cromosómica (3C) en detalle con énfasis en la participación y el aprendizaje de pregrado.
Abstract
La captura de conformación cromosómica (3C) es una herramienta poderosa que ha generado una familia de técnicas similares (por ejemplo, Hi-C, 4C y 5C, denominadas aquí técnicas 3C) que proporcionan información detallada de la organización tridimensional de la cromatina. Las técnicas 3C se han utilizado en una amplia gama de estudios, desde el monitoreo de los cambios en la organización de la cromatina en las células cancerosas hasta la identificación de contactos potenciadores realizados con promotores de genes. Si bien muchos de los estudios que utilizan estas técnicas están haciendo grandes preguntas sobre todo el genoma con tipos de muestras intrincadas (es decir, análisis de células individuales), lo que a menudo se pierde es que las técnicas 3C se basan en métodos básicos de biología molecular que son aplicables a una amplia gama de estudios. Al abordar preguntas estrechamente enfocadas de la organización de la cromatina, esta técnica de vanguardia se puede utilizar para mejorar la investigación de pregrado y la experiencia de laboratorio de enseñanza. Este documento presenta un protocolo 3C y proporciona adaptaciones y puntos de énfasis para la implementación en instituciones principalmente de pregrado en investigación de pregrado y experiencias docentes.
Introduction
El genoma de un organismo no solo contiene todos los genes necesarios para la función, sino también todas las instrucciones sobre cómo y cuándo usarlos. Esto hace que la regulación del acceso al genoma sea una de las funciones más importantes de la célula. Hay muchos mecanismos para controlar la función de los genes; sin embargo, en su nivel base, la regulación génica se reduce a la capacidad de los factores de transcripción reguladores (transfactores) para unirse a sus secuencias específicas de ADN (secuencias reguladoras cis). Esta no es una habilidad innata; En cambio, se rige por la organización/estructura del genoma en el núcleo, que controla la disponibilidad/exposición de las secuencias cis-reguladoras a los trans-factores 1,2,3. Si los transfactores no pueden encontrar sus secuencias cis-reguladoras, entonces los trans-factores no pueden realizar sus tareas regulatorias. Esto ha hecho que comprender cómo se organizan los genomas en el núcleo sea una fuente importante de investigación.
Es ampliamente aceptado que durante la interfase, los cromosomas eucariotas en el núcleo ocupan su propio dominio anclado a la lámina nuclear y la matriz nuclear (Figura 1), lo que hace que el cromosoma se parezca más a una rebanada de pizza, en lugar de un fideo en un plato de espaguetis. Los cromosomas están parcialmente condensados por interacciones proteína-ADN (cromatina) que retuercen y refuerzan porciones del cromosoma. A través de microscopía electrónica, hibridación tridimensional de fluorescencia de ADN in situ (FISH) y técnicas de marcado de ADN (es decir, metilación de ADN fluorescente y artificial), se ha encontrado que los dominios inactivos de la cromatina están empaquetados firmemente a lo largo de la periferia nuclear 4,5,6, mientras que porciones de cromatina activa y menos condensada se encuentran en el interior del núcleo 7,8,9, 10. Estos experimentos proporcionan una visión de gran angular de la dinámica cromosómica, pero hacen poco para capturar los cambios que ocurren localmente alrededor de los promotores de genes observados en los estudios de DNasa11,12 y nucleosoma13,14,15.
La clave para desbloquear la dinámica de la cromatina de mayor resolución fue la formulación de la técnica de mapeo cromosómico 3D, 3C. La técnica 3C en sí comprende cuatro pasos principales: reticulación de la cromatina, digestión de la cromatina por enzimas de restricción, ligadura de la cromatina y purificación del ADN (Figura 2). Los nuevos fragmentos de ADN artificial generados por este proceso pueden ser caracterizados para revelar la estrecha asociación física entre piezas linealmente distantes de ADN16. La técnica 3C se convirtió en la base para la creación de múltiples técnicas derivadas que utilizan los pasos iniciales de 3C para hacer preguntas más amplias sobre todo el genoma (por ejemplo, Hi-C, 4C, ChIP-C). Esta familia de técnicas 3C ha identificado que los cromosomas están organizados en múltiples unidades discretas denominadas dominios topológicamente asociados (TADs). Los TADs están codificados en el genoma y están definidos por bucles de cromatina flanqueados por límites sin bucle16,17,18,19. Los límites de TAD son mantenidos por dos factores evolutivamente conservados y ubicuos, incluyendo el factor de unión CCCT (CTCF) y la cohesión, que evitan que los bucles dentro de TADs separadosinteractúen 16,20. Los bucles están mediados por la interacción de los transfactores con sus secuencias reguladoras, así como CTCF y cohesión21.
Aunque muchos estudios que utilizan tecnologías 3C hacen preguntas amplias sobre todo el genoma y emplean técnicas complicadas de recolección de muestras, la formulación de la técnica 3C se basa en técnicas básicas de biología molecular. Esto hace que 3C sea intrigante para su implementación tanto en la investigación de pregrado como en los laboratorios de enseñanza. La técnica 3C se puede emplear para preguntas enfocadas más pequeñas y es inherentemente flexible para escalar hacia arriba o hacia abajo (genes individuales22, cromosomas16 y / o genomas18) dependiendo del enfoque y la dirección de las preguntas formuladas. Esta técnica también se ha aplicado a una amplia gama de sistemas modelo 7,16,19,23 y ha demostrado ser versátil en su uso. Esto hace que 3C sea una excelente técnica para estudiantes universitarios, ya que los estudiantes pueden adquirir experiencia en técnicas comunes de biología molecular al tiempo que adquieren una valiosa experiencia en responder preguntas dirigidas.
Aquí se presenta un protocolo adaptado para la preparación de bibliotecas 3C basado en protocolos previamente publicados24,25,26,27. Este protocolo ha sido optimizado para aproximadamente 1 × 107 celdas, aunque ha generado bibliotecas 3C con tan solo 1 × 105 celdas. Este protocolo ha demostrado ser versátil y se ha utilizado para generar bibliotecas 3C a partir de embriones de pez cebra, líneas celulares de pez cebra y Caenorhabditis elegans (lombriz intestinal) adulta joven (YA). El protocolo también debe ser apropiado para líneas celulares de mamíferos y, con mayor adaptación, levadura.
El objetivo de estas adaptaciones es hacer que 3C sea más accesible para los estudiantes universitarios. Se ha tenido cuidado de utilizar técnicas que son similares a las que se pueden lograr en un laboratorio de enseñanza de pregrado. La técnica 3C ofrece muchas oportunidades de aprendizaje para que los estudiantes universitarios aprendan técnicas básicas de biología molecular que beneficiarán su desarrollo en el banco, en el aula y en sus esfuerzos después de la graduación.
Protocol
1. Diseño de imprimación
NOTA: Las herramientas de diseño de imprimaciones 3C están disponibles en línea28. Alternativamente, los estudiantes pueden diseñar cartillas personalizadas (ver más abajo).
- Identificación de ubicaciones de imprimación
- Abra el Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/), seleccione el organismo de estudio y busque la región del genoma que se evaluará utilizando 3C.
- En la siguiente ventana, active la pista de enzimas en la pestaña Mapeo y secuenciación debajo del navegador haciendo clic en Restr Enzymes.
- Introduzca la(s) enzima(s) de restricción que se van a utilizar y establezca el modo de visualización en empaquetar. Haga clic en Enviar.
- En Variación y repeticiones, asegúrese de que RepeatMasker esté configurado en denso.
- Usando los sitios de restricción como guías, identifique los sitios de interés que no estén dentro de las regiones de repetición enmascaradas (barras negras). Resalte 300 pares de bases (pb) flanqueando la secuencia aguas arriba y aguas abajo que rodea el sitio de restricción haciendo clic en la posición (pista superior) y arrastrando a la longitud deseada (~600 pb).
- Suelte el ratón y aparecerá un cuadro emergente. Tome nota de la ubicación genómica, haga clic en Acercar y deje que el navegador se reajuste a la selección.
- Pase el mouse sobre la pestaña Ver en la cinta superior del navegador y, en el menú desplegable, seleccione ADN.
- Deje la opción predeterminada, tenga en cuenta la designación de secuencias enmascaradas (hay una opción para convertirlas en N). Haga clic en obtener ADN.
- La secuencia resaltada se mostrará en la ventana. Copie y pegue esta secuencia en Primer3 (https://primer3.ut.ee/).
- Usando la configuración predeterminada de Primer3, genere imprimaciones haciendo clic en Recoger imprimaciones.
- En los resultados, tome nota de la ubicación de la enzima de restricción y seleccione cebadores que creen un producto de PCR de 200-500 pb con el sitio de restricción ubicado en el medio.
- Siguiendo estos pasos, diseñe imprimaciones de prueba de 1 kilobase (kb), 2 kb, 5 kb, 10 kb y 20 kb del sitio o sitios de interés.
- Para diseñar los cebadores de control de entrada, repita estos pasos para un sitio de 1-2 kB del sitio de interés que carece de un sitio de restricción, lo que significa que nunca se corta.
- Validación de imprimación funcional
- Para validar la funcionalidad del cebador, configure reacciones de PCR utilizando concentraciones de cebador tituladas y ADN genómico purificado. Ya sea a través de medios cuantitativos o semicuantitativos, determine si los cebadores crean el producto esperado.
- Rediseñe los cebadores que no superan la validación.
2. Día 1
NOTA: El protocolo puede pausarse (congelarse a -20 °C) después de la reticulación de la cromatina y después de la recolección de núcleos. Los pasos toman, en promedio, 5-6 h con estudiantes universitarios.
- Colección de núcleos de C. elegans para adultos jóvenes (YA) (adaptado de Han et al.29)
- Reticulación de cromatina
- Recolectar 5,000 gusanos YA en 30 ml de medio M9 en un tubo cónico de 50 ml, y girar a 400 × g durante 2 min a temperatura ambiente (RT).
- Lave el pellet de lombriz 3 veces más con M9 para eliminar las bacterias.
- Retirar el sobrenadante, resuspender el gránulo de lombriz en 47,3 ml de M9 que contenga 2,7 ml de formaldehído al 37% (2% final) e incubar con agitación (balanceo o nutación) durante 30 min a RT.
PRECAUCIÓN: Manipule el formaldehído con cuidado y trabaje bajo una campana extractora con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio de EPP, guantes adecuados y protección para los ojos). El formaldehído es un irritante que afecta los ojos, la nariz, la garganta y los pulmones. - Girar los gusanos a 400 × g durante 2 min en RT.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de lombriz en 50 ml de glicina 1 M. Girar los gusanos a 400 × g durante 2 minutos en RT.
- Colección Nuclei
- Resuspender el pellet de lombriz en 6 ml de tampón NP refrigerado (50 mM HEPES a pH 7.5, 40 mM NaCl, 90 mM KCl, 2 mM EDTA, 0.5mM EGTA, 0.1% Tween 20, 0.2 mM DTT, 0.5 mM espermidina, 0.25 mM espermina, 1x inhibidor completo de la proteasa).
- Transfiera la suspensión de tornillo sin fin a un ajuste holgado de 7 ml Rebote en hielo. Rebote la muestra 15 veces y mantenga el hielo durante 5 minutos.
- Transfiera la suspensión de tornillo sin fin a un ajuste ajustado de 7 ml Rebote sobre hielo. Beba la muestra 20 veces y mantenga el hielo durante 5 minutos.
- Transfiera la suspensión de gusanos a un tubo cónico limpio de 15 ml y agregue tampón NP a 10 ml en total (aproximadamente 4 ml).
- Vórtice la suspensión del tornillo sin fin en un ajuste alto durante 30 s. Incubar la muestra en hielo durante 5 min.
- Repita el paso anterior.
- Girar la suspensión de gusanos a 100 × g durante 5 min a 4 °C.
- Transfiera el sobrenadante a un tubo cónico fresco de 15 ml.
- Revise la muestra en busca de restos de gusanos. Visualice 10 μL de la muestra con un microscopio óptico. Si hay restos de lombriz, hilar la muestra a 2.000 × g durante 5 min a 4 °C, resuspender el pellet en un tampón de NP de 10 ml frescos y volver a girar la muestra a 100 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el pellet, revise el sobrenadante en busca de restos de gusanos y repita hasta que la muestra esté libre de restos de gusanos.
NOTA: Alternativamente, los restos de gusanos también se pueden eliminar colando la muestra a través de un filtro de células de 40 μm (6x) seguido de un filtro de células de 20 μm (6x). - Si la muestra está libre de restos de gusanos, tome 5 μL de la muestra, agregue 5 μL de pironina verde de metilo (los núcleos serán azules) y cuente los núcleos con un hemocitómetro.
- Girar la muestra a 2.000 × g durante 5 min a 4 °C
- Retire el sobrenadante, coloque las muestras en hielo y proceda; alternativamente, congele rápidamente los núcleos y guárdelos a -80 °C.
- Reticulación de cromatina
- Digestión de la cromatina
- Resuspender los núcleos en 450 μL de agua limpia. Transfiera los núcleos a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml.
- A la muestra reticulada, agregue 60 μL de tampón de la enzima de restricción DpnII 10x y mezcle bien.
NOTA: Se pueden usar otras enzimas de restricción que aún cortan el ADN reticulado. - Añadir 15 μL de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10% para permeabilizar los núcleos, e incubar con agitación (balanceo o nutación) a 37 °C durante 1 h.
PRECAUCIÓN: SDS es un irritante y es tóxico si se ingiere o absorbe a través de la piel. Manéjelo con cuidado y use el EPP adecuado (bata de laboratorio, guantes adecuados y protección para los ojos). - Apagar la SDS añadiendo 75 μL de Triton X-100 al 20% e incubando con agitación a 37 °C durante 1 h.
- Tomar 10 μL de la muestra como control no digerido. Conservar a 4 °C.
- Añadir 400 U de DpnII, e incubar a 37 °C durante la noche con agitación.
3. Día 2
NOTA: En promedio, los estudiantes universitarios tardan 5 horas en completar estos pasos.
- Digestión de la cromatina
- Añadir 200 U adicionales de DpnII e incubar las muestras durante 4 h a 37 °C con agitación para asegurar la digestión completa de la muestra reticulada.
- Tomar una alícuota de 10 μL de las muestras como control de la digestión.
- Inactivar térmicamente la enzima de restricción incubando la muestra durante 20 minutos a 65 °C (o según las instrucciones del fabricante). Continúe con el paso 2.1.3.
- Si la enzima no puede ser inactivada por calor, añadir 80 μL de SDS al 10% e incubar la muestra durante 30 min a 65 °C. Luego, agregue 375 μL de Triton X-100 al 20% y mezcle girando. Incubar la muestra durante 1 h a 37 °C y continuar hasta el paso 2.2.
- Ligadura de cromatina
- Transfiera la muestra a un tubo cónico limpio de 50 ml, ajuste el volumen de la muestra a 5,7 ml con H2O de grado molecular y mezcle girando.
- Agregue 700 μL de tampón 10x T4 Ligase y mezcle girando.
- Agregue 60 U de T4 DNA Ligasea y mezcle girando.
- Incubar durante la noche a 16 °C.
4. Día 3
NOTA: En promedio, los estudiantes universitarios tardan de 15 a 30 minutos en completar estos pasos. Después de la incubación nocturna, las muestras se pueden congelar.
- Digestión de proteínas y reticulación inversa
- Añadir 30 μL de proteinasa K (10 mg/ml) a la muestra de 3C e incubar a 65 °C durante la noche con agitación. Añadir 5 μL de proteinasa K (10 mg/ml) al control no digerido y de digestión, e incubar a 65 °C durante la noche con agitación.
5. Día 4
NOTA: En promedio, los estudiantes universitarios tardan 4-5 h en completar estos pasos.
- Purificación de la biblioteca 3C
- Agregue 30 μL de RNasa A (10 mg/ml) a la muestra de 3C y agite para mezclar. Incubar la muestra durante 45 min a 37 °C.
- Añadir 7 ml de fenol-cloroformo a la muestra y mezclar agitando.
PRECAUCIÓN: El fenol-cloroformo es un irritante de la piel y los ojos y puede causar quemaduras si no se trata el contacto. El fenol-cloroformo debe usarse en una campana extractora con protección ocular y guantes (nitrilo) adecuados. - Centrifugar la muestra durante 15 min a 3.270 × g a RT. Recoger la fase acuosa y transferir a un tubo cónico limpio de 50 ml. Agregue volúmenes iguales de cloroformo y mezcle la muestra agitándola.
- Centrifugar la muestra durante 15 min a 3.270 × g a RT. Recoger la fase acuosa y transferir a un tubo cónico limpio de 50 ml. Agregue 7.5 ml de H2O de grado molecular, 35 ml de etanol al 100% y (opcional) 7 μL de glucógeno (1 mg / ml). Mezclar agitando e incubar a -80 °C hasta que la muestra esté congelada.
NOTA: La muestra puede tardar 1 h o más en congelarse. El protocolo se puede pausar aquí.- Mientras la muestra 3C se congela, purifique las muestras de control. A las muestras de control, ajustar el volumen a 500 μL con agua de grado molecular y añadir 2 μL de mezcla de RNasa A (10 mg/ml) moviendo el tubo.
- Gire brevemente para recoger la muestra en el fondo del tubo. Incubar las muestras durante 45 min a 37 °C.
- A las muestras de control, añadir 1 mL de fenol-cloroformo, y mezclar agitando los tubos. Centrifugar la muestra durante 15 min a 3.270 × g en RT. Recoger la fase acuosa de los controles, y colocar en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml.
- Agregue volúmenes iguales de cloroformo y mezcle la muestra agitándola. Centrifugar la muestra durante 15 min a 3.270 × g en RT. Recoger la fase acuosa de los controles, y colocar en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml.
- Añadir 1 mL de etanol al 100% y 2 μL de glucógeno (1 mg/mL). Mezclar agitando e incubar a −80 °C durante 30 min.
- Centrifugar la muestra durante 15 min a 3.270 × g a 4 °C. Retire el sobrenadante y agregue 750 μL de etanol refrigerado al 70%.
- Centrifugar la muestra durante 10 min a 3.270 × g a 4 °C. Retire el sobrenadante y seque las muestras al aire. Vuelva a suspender el pellet en 50 μL deH2Ode grado molecular. Congele o continúe con el paso 6.
- Centrifugar la muestra durante 60 min a 3.270 × g a 4 °C. Retire el sobrenadante y agregue 10 ml de etanol refrigerado al 70%. Interrumpa y rompa la bolita de ADN agitando la muestra para mezclarla.
- Centrifugar la muestra durante 30 min a 3.270 × g a 4 °C. Retire el sobrenadante y deje que la muestra se seque parcialmente al aire a RT. Resuspender el pellet en 150 μL de Tris-HCl de 10 mM (pH 7.5) pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Esta es la "Biblioteca 3C".
NOTA: Congele la muestra o continúe con el análisis.
6. Día 5
NOTA: En promedio, los estudiantes universitarios tardan 1-2 h en completar estos pasos.
- Determinación de la calidad de la muestra utilizando la curva estándar del cebador de control
- Cuantificar la concentración de ADN para la muestra de 3C, así como todos los controles, y ajustar las muestras a 30 μg/μL (si las concentraciones lo permiten). En serie, las muestras diluidas se duplican cuatro veces, lo que resulta en cinco diluciones para cada muestra (1x, 0.5x, 0.25x, 0.125x, 0.0625x).
NOTA: Si la cuantificación no se puede hacer fácilmente, diluya en serie las muestras como se indicó anteriormente y proceda. - Configure las reacciones de PCR para el 3C, el control genómico y el control digerido para cada muestra diluida con los cebadores de control: 1 μL de ADN, 10 μL de tampón de reacción 5x, 1 μL de dNTP de 10 mM, 1 μL de cebador de control de 10 mM (mezclado hacia adelante e inverso), 1 μL de polimerasa Taq y 36 μL de agua.
- Siguiendo las instrucciones del software específico de la máquina de PCR, configure el programa de PCR de curva estándar utilizando las siguientes condiciones de ciclismo: 30 s a 98 °C; 30 ciclos de 5 s a 98 °C, 5 s a 60 °C y 10 s a 72 °C; 1 min a 72 °C; Retención a 4 °C.
- Usando el software, genere las curvas estándar para las muestras. Después de que el software genere la curva, tome nota de la eficiencia de PCR y el valor de R2 .
- Cuantificar la concentración de ADN para la muestra de 3C, así como todos los controles, y ajustar las muestras a 30 μg/μL (si las concentraciones lo permiten). En serie, las muestras diluidas se duplican cuatro veces, lo que resulta en cinco diluciones para cada muestra (1x, 0.5x, 0.25x, 0.125x, 0.0625x).
- Determinación de la concentración de ADN
- Para determinar la concentración de ADN de las muestras de 3C, compare las muestras con una muestra de ADN genómico de concentración conocida. Diluir las muestras a 30 ng/μL y diluir en serie el control genómico de 10 ng/μL a 0,01 ng/μL en dos pasos para crear una curva estándar.
NOTA: Si la cuantificación no se puede hacer fácilmente, diluya la muestra 1:10 y continúe. - Configure las reacciones de PCR para el 3C, el control genómico y el control digerido para cada muestra diluida con los cebadores de control: 1 μL de ADN, 10 μL de tampón de reacción 5x, 1 μL de 10 mM dNTPs, 1 μL de cebador de control de 10 mM (mezcla directa e inversa), 1 μL de polimerasa Taq y 36 μL de agua.
- Siguiendo las instrucciones del software específico para la máquina de PCR, configure el programa de PCR de curva estándar utilizando las siguientes condiciones de ciclismo: 30 s a 98 °C; 30 ciclos de 5 s a 98 °C, 5 s a 60 °C y 10 s a 72 °C; 1 min a 72 °C; Retención a 4 °C.
- Usando el software, genere las curvas estándar para las muestras, trazando las muestras 3C en la curva. Compare la posición de la abundancia de muestras de 3C con la curva estándar creada por las reacciones del ADN genómico de concentración conocida, y ajuste las muestras de 3C a 30 ng / μL.
- Para determinar la concentración de ADN de las muestras de 3C, compare las muestras con una muestra de ADN genómico de concentración conocida. Diluir las muestras a 30 ng/μL y diluir en serie el control genómico de 10 ng/μL a 0,01 ng/μL en dos pasos para crear una curva estándar.
- Determinar la presencia o ausencia de interacción cromatina
- Configure reacciones de qPCR con 30 ng de la muestra 3C, la muestra de control genómico y la muestra de control digerida: 1 μL de ADN, 10 μL de tampón de reacción 5x, 1 μL de dNTP de 10 mM, 1 μL de cebador de 10 mM (mezclado hacia adelante e inverso), 1 μL de polimerasa Taq y 36 μL de agua.
NOTA: Las reacciones deben configurarse utilizando el cebador de control, los cebadores de prueba para loci genómicos individuales y las combinaciones deseadas de los cebadores de prueba (sitio "a" hacia adelante y sitio "b" hacia atrás) que se utilizan para determinar la interacción de la cromatina (Figura 3). - Siguiendo las instrucciones para el software de la máquina de PCR, configure el programa de PCR de la siguiente manera: 30 s a 98 °C; 40 ciclos de 5 s a 98 °C, 5 s a 60 °C y 10 s a 72 °C; 1 min a 72 °C; Retención a 4 °C.
- Después de ejecutar la PCR, inspeccione la gráfica de amplificación. Asegúrese de que las reacciones de PCR muestren una amplificación exponencial, duplicando cada ciclo.
NOTA: Las reacciones que no muestran amplificación exponencial no se pueden analizar más a fondo. - Siguiendo las instrucciones para el software de la máquina de PCR, defina el umbral del experimento de qPCR.
- Exporte los valores de Ct para todas las muestras.
- Determine la eficiencia de digestión utilizando los valores de Ct del cebador de prueba (TP) y del cebador de control (CP) de las muestras de control no digerido (UC) y control digerido (DC) utilizando la ecuación (1).
Porcentaje digerido = 100 -
(1) - Estos valores deben estar en el rango de 80% -90% de digestión. Registre estos valores (Figura 4A).
- Determine la interacción relativa de la cromatina utilizando la combinación de cebador de prueba (TPC) y los valores de Ct del cebador de control (CP) de las muestras de control no digerido (UC) y 3C (3C) utilizando la ecuación (2).
Interacción cromatina = 100 -
(2) - Trazar los valores de cada muestra en un gráfico de barras para cada combinación de cebador de prueba.
- Compare la señal de las muestras 3C con las muestras de control para determinar si la muestra de 3C tiene enriquecimiento de una interacción de cromatina particular sobre las muestras de control. Las muestras de 3C que muestran enriquecimiento sobre el control pueden considerarse condicionalmente positivas y requieren validación mediante secuenciación de Sanger (Figura 4B).
NOTA: Al analizar los datos del gráfico, es importante recordar que a menos que se use una "plantilla de control" (ver discusión), la abundancia entre reacciones (es decir, de un conjunto de cebadores al siguiente) no se puede comparar.
- Configure reacciones de qPCR con 30 ng de la muestra 3C, la muestra de control genómico y la muestra de control digerida: 1 μL de ADN, 10 μL de tampón de reacción 5x, 1 μL de dNTP de 10 mM, 1 μL de cebador de 10 mM (mezclado hacia adelante e inverso), 1 μL de polimerasa Taq y 36 μL de agua.
- Identificación de los productos 3C
- Ejecute los productos de PCR en un gel de agarosa al 1,5%.
- Visualice el gel para el tamaño correcto de los productos de PCR utilizando una caja de luz UV o un sistema de documentación de gel.
NOTA: Las bibliotecas 3C bien construidas contendrán una amplia gama de fragmentos de ADN, y a pesar de la validación previa de los cebadores para la especificidad, las reacciones de PCR de las bibliotecas 3C tienen el potencial de contener muchas bandas (Figura 5A). Esto no impide el análisis de las bibliotecas 3C. - Extirpar las bandas de producto correspondientes al tamaño de fragmento esperado, y realizar la extracción en gel de los productos de PCR siguiendo las instrucciones de un kit comercial o el protocolo casero que se describe a continuación.
PRECAUCIÓN: La luz UV es un carcinógeno conocido, y se debe tener mucho cuidado para limitar el tiempo expuesto a la luz UV. Se debe usar protección ocular resistente a los rayos UV, un protector de muestras, guantes y una bata de laboratorio.- Para construir un cartucho de purificación casero, haga un agujero en el fondo de un tubo de 0,5 ml con una aguja.
- Empaque una pequeña cantidad de algodón de una bola de algodón en el fondo del tubo de 0.5 ml, llenando no más de la mitad del tubo.
- Coloque el tubo de 0.5 ml en un tubo de 1.5 ml; Asegúrese de que el tubo más pequeño descanse sobre el borde del tubo más grande, no en el tubo.
- Corte con cuidado un fragmento de gel en trozos más pequeños y colóquelo en el tubo de 0,5 ml del cartucho.
- Coloque el conjunto en un congelador de −20 °C durante 5 min. Gire el conjunto durante 3 minutos a 13.000 × g a RT.
- Mantenga el tubo de 1,5 ml con el ADN extraído en tampón y deseche el tubo de 0,5 ml que contiene los restos de agarosa.
- El ADN purificado se puede enviar para la secuenciación de Sanger utilizando cebadores directos e inversos para el fragmento 3C.
- Identificación de contactos de cromatina mediante Blat
- Una vez completada la secuenciación, determinar si las muestras cumplen con los estándares de control de calidad indicados en el informe de secuenciación.
- Para las secuencias que pasan el control de calidad, abra los archivos .seq y .ab1 (seguimiento) en un programa de edición de secuenciación como Another Plasmid Editor (ApE), inspeccione el archivo .ab1 en busca de picos de llamada base claros y edite los picos mal llamados en el archivo .seq.
- Con el archivo .seq editado, busque el sitio DpnII. Dependiendo del resultado de la secuencia, esto debería estar a mitad de camino en la secuencia reportada.
- Para determinar si la secuencia es la secuencia objetivo esperada, resalte el sitio DpnII y un adicional de 30-50 pb de la secuencia aguas arriba correspondiente al cebador directo de los loci genómicos probados para 3C. Realice una búsqueda Blat de esta secuencia contra la especie objetivo. Asegúrese de que los loci genómicos coincidan con los del cebador.
- Repita el paso anterior para la secuencia inversa del cebador, asegurándose de que el locus genómico devuelto coincida con el del cebador inverso.
(1)
(2)Representative Results
Este procedimiento producirá una muestra experimental de 3C y dos muestras de control (no digeridas y digeridas). Utilizando estas tres muestras, se realizó qPCR. A partir de estos resultados, se calculó la eficiencia digestiva (ecuación 1) y se registró (Tabla 1). A partir de estos cálculos, se determinó que la muestra 3C tenía una eficiencia de digestión de aproximadamente el 88% (promedio de la Tabla 1) en los siete loci genómicos probados.
A continuación, las muestras se analizaron para detectar la presencia de contactos de cromatina de largo alcance entre los diferentes loci genómicos utilizando combinaciones de cebadores específicos de loci (Tabla 2) y qPCR. Usando estos resultados, se calcularon las abundancias de productos en relación con un conjunto de cebadores de control (ecuación 2) y se graficaron para la comparación (Figura 4). Estos datos indicaron que 8 de las 10 reacciones fueron positivas condicionales para interacciones de largo alcance.
Las reacciones de PCR se ejecutaron en un gel de agarosa. El producto de PCR esperado para los ocho positivos condicionales y una reacción negativa se purificaron en gel y se enviaron para la secuenciación de Sanger. Se muestran los resultados de reacciones representativas positivas (flecha azul, cuadro azul) y negativas (flecha roja, cuadro rojo) (Figura 5).
Figura 1: Estructura cromosómica en el núcleo. Organización cromosómica hipotética dentro del núcleo. A) Envoltura nuclear, líneas negras; B) lámina nuclear, naranja; (C) heterocromatina, líneas compactadas; (D) eucromatina, bucles sueltos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema del protocolo 3C. Las porciones distantes de cromosomas lineales (azul, amarillo y rosa) se acercan dentro del núcleo a través de bucles reguladores. (A) Las estructuras de bucle están mediadas por factores de transcripción (círculo gris y estrella negra); Estas interacciones se conservan a través de la reticulación química. (B) Los bucles se rompen a través de la digestión enzimática (líneas negras). (C) Las piezas de cromatina distantes se unen entre sí a través de los extremos adherentes creados por la digestión. (D) El ADN se purifica a partir de proteínas. (E) La secuencia dentro de los fragmentos se identifica y se mapea de nuevo al genoma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El esquema de cebador 3C. Los cebadores 3C están diseñados alrededor de sitios de restricción a distancias variables de la ubicación genómica de interés. Las flechas rosadas representan los conjuntos de cebadores experimentales que rodean un sitio DpnII. Los cebadores experimentales se pueden mezclar y combinar para evaluar el bucle de cromatina en la región. Las imprimaciones naranjas representan un control negativo sin un sitio DpnII. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Datos representativos de qPCR para un experimento 3C. Abundancia relativa de los juegos de cebadores de prueba 3C. (A) Gráfico de control que muestra la abundancia relativa del producto en la muestra de control no digerido (azul), control digerido (gris) y 3C (naranja). b) El experimento 3C; la abundancia relativa del producto a partir de combinaciones de cebadores de prueba en la muestra de control no digerido (azul), control digerido (gris) y 3C (naranja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Visualización de los productos de qPCR 3C. Top, gel con los productos de punto final de qPCR con las muestras indicadas. Archivos de trazas de secuencia de Sanger representativos e inferiores para las reacciones indicadas. La muestra naranja es un ejemplo de un falso positivo (ver Figura 4, r38/34), y la muestra azul es un ejemplo de un verdadero positivo con el sitio DpnII indicado encima de la traza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Sitio | % digestión |
| R8 | 86.98 |
| r3 | 88.44 |
| R38 | 89.64 |
| R34 | 87.55 |
| R33 | 87.85 |
| R14 | 86.97 |
| R47 | 89.45 |
Tabla 1: Eficiencia digestiva calculada.
| Nombre | Secuencia | Loci genómicos | ||
| r3 FWD | ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC | chrX:11361475 | ||
| r3 RVS | TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC | chrX:11361561 | ||
| r38 FWD | TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC | chrX:5859700 | ||
| r38 RVS | AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG | chrX:5859775 | ||
| r34 FWD | ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG | chrX:5429702 | ||
| r34 RVS | AATAATCCTTAACAAACGTGGCC | chrX:5429777 | ||
| r33 FWD | AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC | chrX:6296704 | ||
| r33 RVS | TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG | chrX:6296807 | ||
| r14 FWD | AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG | chrX:8036367 | ||
| r14 RVS | ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTC | chrX:8036427 | ||
| r47 FWD | ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC | chrX:9464939 | ||
| r47 RVS | AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC | chrX:9465064 | ||
| r8 FWD | GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG | chrX:11094257 | ||
| r8 RVS | TTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACC | chrX:11094362 | ||
| Cebador de control FWD | CAATCGTCTCGCTCACTTGTC | chrX:7608049 | ||
| Cebador de control RVS | GATGTGAGCAACAAGGCACC | chrX:7608166 | ||
Tabla 2: Cebadores para el experimento representativo 3C.
Discussion
El 3C es una técnica poderosa que tiene sus raíces en técnicas moleculares básicas. Es esta base de herramientas fundamentales lo que hace que 3C sea una técnica tan intrigante para usar con estudiantes universitarios. Con tantos estudios recientes que observan la dinámica de la cromatina a una escala tan amplia, el uso de estos resultados para diseñar un experimento enfocado en un solo gen o región genómica tiene el potencial de crear un experimento único e impactante en la investigación de pregrado. A menudo, experimentos como estos se consideran demasiado avanzados para los estudiantes universitarios, pero con una planificación cuidadosa, son fácilmente alcanzables. Es importante tener en cuenta que los ensayos diseñados para sondear las conexiones de cromatina capturadas por la biblioteca 3C pueden variar desde la PCR semicuantitativa de punto final hasta la secuenciación del genoma completo. De hecho, los datos del primer artículo 3C16 se generaron a partir de qPCR. Esta amplia gama de ensayos se puede utilizar porque todas las tecnologías 3C producen el mismo producto: una biblioteca de fragmentos de ADN que representan conexiones 3D en el núcleo.
Aquí se presenta una adaptación de un protocolo más flexible y complaciente que se ajusta mejor a los investigadores de pregrado. Los períodos de pausa enumerados anteriormente implican retrasos nocturnos; Sin embargo, estas pausas pueden extenderse durante los fines de semana y, en el caso de las células y los núcleos, durante semanas. La consideración más importante es cuándo se realizará el trabajo. A menudo, en los protocolos, hay pasos sensibles al tiempo cuando la pausa no es una opción. Fuera de algunos puntos (día 1 y día 2), hay muchos lugares para detenerse y congelar la muestra. Estos son críticos cuando se trabaja con estudiantes universitarios donde los horarios y horarios del trabajo de laboratorio deben ser flexibles. Además de diseñar estas paradas en el protocolo, se alienta a los estudiantes universitarios a trabajar en parejas o incluso en pequeños grupos de tres o cuatro. Los grupos funcionan bien para este protocolo, ya que los estudiantes pueden apoyarse mutuamente y crear un sistema de compañeros para que todos trabajen de manera segura. El trabajo de laboratorio también es más divertido con otros involucrados. Con los grupos, los estudiantes también pueden trabajar en una variedad de preguntas centradas en la organización de la cromatina mientras realizan el mismo protocolo. Por lo tanto, incluso mientras los estudiantes están trabajando en proyectos separados, el protocolo vincula sus esfuerzos y, debido a esto, pueden apoyarse mutuamente.
Otras adaptaciones están destinadas a evitar el hecho de que ciertas herramientas y equipos especializados no se encuentran necesariamente en todas las instituciones de pregrado. Estos equipos incluyen, entre otros, termocicladores qPCR, sistemas de documentación de gel y espectrómetros de nanovolumen. De hecho, estos equipos son convenientes pero no son un requisito. Aquí, el método clásico de 3C también se describe en la parte de diseño de imprimación; Esto implica identificar un locus genómico de interés y, a partir de eso, evaluar otros loci genómicos para los puntos de contacto de la cromatina más lejanos. Esta técnica también funciona bien si se utiliza un conjunto de datos publicado, como un conjunto de datos que utiliza Hi-C, donde se identifican los loci positivos (conectados) y negativos (no conectados) conocidos. El diseño de experimentos utilizando estos conjuntos de datos publicados es otra gran adaptación para los laboratorios de enseñanza, ya que la posibilidad de identificar con éxito las conexiones de la cromatina suele ser mayor. Además, el artículo de investigación puede ser discutido en clase y ser utilizado como referencia.
Este protocolo utiliza un enfoque de qPCR modificado para visualizar la formación del producto 3C. Los controles son esenciales para el éxito de la técnica 3C. Cada experimento utiliza controles de muestra y controles de cebador para determinar la finalización del procedimiento 3C. Los controles de la muestra incluyen un control no digerido (ADN genómico) y un control digerido. El control no digerido determina la señal de referencia para los juegos de cebadores y se utiliza con el control de digestión reticulado para determinar la eficiencia de digestión Se espera que haya una caída en el producto para cualquier cebador dirigido a través de un sitio de restricción. La comparación de este valor con el control no digerido proporciona una indicación de qué tan bien se digirió la muestra.
Los cebadores para la PCR incluyen un cebador de control y cebadores de prueba. El cebador de control es un conjunto de cebadores que está cerca de la región genómica que se está ensayando y no contiene un sitio de restricción. Esto proporciona la línea de base para determinar la abundancia de los productos de PCR de imprimación de prueba. Los cebadores de prueba son cebadores directos e inversos que flanquean un sitio de restricción para un locus genómico particular de interés (Figura 3). Las reacciones que utilizan estos juegos de imprimación se comparan para determinar la eficiencia de digestión, ya que la abundancia de producto debe disminuir si se ha cortado el sitio de restricción. Al determinar la organización de la cromatina, un cebador de prueba de un locus se empareja con otro cebador de prueba de un locus genómico diferente para determinar si estos dos loci están muy juntos en el espacio 3D. En ese caso, la expectativa es que un producto de PCR solo se encuentre utilizando la muestra 3C como plantilla.
Es importante tener en cuenta que incluso los cebadores validados tienen la tendencia a fallar (Figura 4: juego de cebadores r14). Además, los productos de PCR se identifican con frecuencia en reacciones de control y en reacciones en las que no se predice una conexión de cromatina (como el control digerido, ya que no está ligado). Estas instancias están secuenciadas y fallan en el control de calidad de Sanger o regresan sin una secuencia definida (Figura 5). Además, los experimentos tradicionales de 3C generan una "plantilla de control", una muestra de ADN no entrecruzada, digerida y ligada, que representa todos los posibles fragmentos ligados que se pueden producir con una cantidad dada de ADN. La "plantilla de control" juega un papel importante en la comparación de las intensidades de las señales de qPCR entre dos loci genómicos para determinar si la señal representa una verdadera interacción o simplemente una asociación aleatoria. Crear una "plantilla de control" puede ser problemático, ya que una gran parte de la cromatina que se está ensayando debe capturarse en forma de un cromosoma artificial y procesarse junto con las muestras 3C. Asegurar tal construcción puede no ser factible, y crear uno podría estar fuera del alcance de un proyecto semestral. Debido a estas dificultades, sugerimos usar un cebador de control. El manual de control no reemplaza toda la funcionalidad de la "plantilla de control", pero aún brinda la oportunidad de analizar los datos para hacer determinaciones de "presencia" o "ausencia".
Al realizar qPCR, es importante utilizar cantidades iguales de la muestra. Esto debe determinarse, incluso si se utiliza un nanoespectrofotómetro como una nanogota, generando una curva estándar a partir del ADN genómico de una concentración conocida y ajustando las muestras 3C a esa línea. Estas cantidades deben registrarse y utilizarse en PCR posteriores. La calidad de la reacción de PCR también es importante. Como la PCR se ejecuta en qPCR, la abundancia del producto se mide mediante fluorescencia y se registra. Esta grabación es accesible en la gráfica de amplificación. Una vez finalizado el programa, es importante comprobar la gráfica de amplificación y asegurarse de que las reacciones (excepto los controles sin plantilla) tienen tres fases: una línea base, una exponencial y una fase de meseta/saturación. Es importante comprobar que las reacciones tienen una fase exponencial, en particular para establecer el umbral (véase más adelante). Además, para las muestras diluidas en serie, debe haber un cambio en los valores de Ct consistente con la dilución de la muestra (la concentración más alta tendrá los valores de Ct más bajos, mientras que la concentración más baja tendrá los valores de Ct más altos). Las muestras que no reflejan este cambio en la gráfica de amplificación requieren una nueva dilución o indican un problema mayor con la formación de la muestra 3C. Finalmente, al generar la curva estándar, el software de PCR calculará la eficiencia de PCR y el valor de R2 . La eficiencia de PCR debe ser superior al 90% y el valor deR2 debe ser superior a 0,99. Si no se cumple alguna de estas condiciones, es probable que algo esté mal con la muestra o los cebadores de PCR.
Después de la qPCR, el porcentaje de digestión y la presencia de interacciones 3C se pueden calcular utilizando la qPCR Ct para cada reacción. Para determinarlos, primero, se debe establecer el umbral para la reacción de PCR. Esto se hace normalmente utilizando el software que viene con la máquina qPCR. El establecimiento del umbral definirá la concentración del producto de PCR que se utilizará para comparar los valores de Ct de la muestra. El umbral debe dividir las curvas de amplificación de las reacciones de PCR en la fase exponencial de amplificación. Solo se pueden comparar las reacciones de PCR con amplificación exponencial (en este caso, los cebadores de control y las reacciones del cebador de prueba), ya que esta es la única forma de garantizar que las reacciones amplifiquen el ADN a la misma velocidad y se puedan comparar fielmente. Al analizar los gráficos 3C, las reacciones condicionalmente positivas se identifican como aquellas con más producto sobre las muestras de control, control genómico y control de digestión (Figura 4B). Sin embargo, estas muestras deben validarse aún más mediante la secuenciación de Sanger después de la purificación en gel del producto de PCR.
Después de la secuenciación de Sanger, las muestras que pasan el control de calidad se pueden analizar utilizando Blat. El objetivo de este análisis es determinar si la muestra tiene la secuencia de ambos loci genómicos diana que flanquean el sitio de restricción (DpnII en el caso de este protocolo). Si se identifican ambas secuencias, entonces el fragmento 3C puede considerarse validado. Si los resultados del Blat no devuelven la secuencia esperada, esto puede indicar que uno o ambos cebadores no son óptimos, lo que resulta en un resultado de qPCR falso positivo. Los archivos de seguimiento para las muestras de falsos positivos tendrán picos base indefinidos, y los informes Seq contendrán principalmente "n" llamadas base.
La validación de Sanger es esencial, ya que son posibles los falsos positivos de la formación de productos de PCR artificial. Estos falsos positivos se pueden identificar cuando los productos de secuenciación no tienen la secuencia objetivo esperada o un sitio DpnII característico de un fragmento 3C adecuado (Figura 5). La secuenciación de los fragmentos de PCR también proporciona otro punto de datos para el experimento y lleva a los estudiantes a casa que la técnica 3C está identificando loci genómicos distantes que se están uniendo en el espacio 3D dentro de los núcleos.
La técnica 3C proporciona una gran cantidad de técnicas moleculares fundamentales para estudiantes universitarios en un procedimiento flexible y sencillo. Esta técnica 3C es también un punto de partida para las otras técnicas 3C que incorporan secuenciación de próxima generación (NGS). Este tipo de experimentos pueden exponer a los estudiantes universitarios a aspectos importantes de la bioinformática y se basan en los principios básicos descritos aquí. La experiencia y la participación de pregrado son clave para su éxito y desarrollo como jóvenes científicos. Al proporcionar estas oportunidades, los estudiantes universitarios pueden fortalecer su comprensión de los principios básicos mientras desarrollan su confianza para abordar técnicas y preguntas de vanguardia.
Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por la Red de Excelencia en Investigación Biomédica del Premio al Desarrollo Institucional de Rhode Island (IDeA) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de subvención P20GM103430 y el Centro Bryant de Salud y Ciencias del Comportamiento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Millapore-Sigma | F8775 | |
| 100% Ethanol | Millapore-Sigma | E7023 | |
| CaCl2 | MP Biomedical | 215350280 | |
| chloroform | Millapore-Sigma | C0549 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millapore-Sigma | COEDTAF-RO | mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh |
| Dithiothreitol (DTT) | Millapore-Sigma | D0632 | 1 M stock diluted to 500 µM in Sucrose buffer and GB buffer fresh |
| DpnII | NEB | R0543M | |
| Glycerol | Millapore-Sigma | G9012 | |
| glycine | Millapore-Sigma | G8898 | |
| glycogen | Millapore-Sigma | 10901393001 | |
| HEPES | Millapore-Sigma | H3375 | |
| KCl | Millapore-Sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | Millapore-Sigma | P5655 | |
| methyl green pyronin | Millapore-Sigma | HT70116 | |
| MgAc2 | Thermoscientific | 1222530 | |
| Na2HPO4 | Millapore-Sigma | S5136 | |
| NaCl | Millapore-Sigma | S9888 | |
| phenol-chloroform | Millapore-Sigma | P3803 | |
| Pronase | Millapore-Sigma | 11459643001 | |
| Proteinase K | IBI Scientific | IB05406 | |
| qPCR Ready mix (Phire Taq etc) | Millapore-Sigma | KCQS07 | |
| RNase A | Millapore-Sigma | R6148 | |
| Sodium Acetate | Millapore-Sigma | S2889 | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Millapore-Sigma | L3771 | |
| Sucrose | Millapore-Sigma | S0389 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1804 | |
| Tris-HCl | Millapore-Sigma | 108319 | |
| Triton X-100 | Millapore-Sigma | T9284 | |
| Trypsin-EDTA | Millapore-Sigma | T4049 |
References
- McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C.
- Nalabothula, N., et al. The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation. BMC Genomics. 15, 92 (2014).
- John, S., et al. Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns. Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).
- Fawcett, D. W. On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates. The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).
- Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina. Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).
- Finlan, L. E., et al. Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells. PLoS Genetics. 4 (3), e1000039 (2008).
- Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development. Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).
- Chambeyron, S., Bickmore, W. A. Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription. Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).
- Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories. The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).
- Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH. The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).
- Li, B., Carey, M., Workman, J. L.
- Chen, A., Chen, D., Chen, Y. Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals. Gene. 667, 83-94 (2018).
- Hughes, A. L., Rando, O. J. Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo. Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).
- Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging. Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).
- Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern. Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N.
- van Berkum, N. L., Dekker, J. Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology. Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).
- Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus. American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).
- Crane, E. E. Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2. University of California, Berkeley. , PhD thesis (2012).
- Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell. 98 (3), 387-396 (1999).
- Cuadrado, A., et al. Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells. Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).
- Sarro, R., et al. Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development. Development. 145 (7), (2018).
- Tolhuis, B., et al. Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture. PLoS Genetics. 7 (3), e1001343 (2011).
- Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
- Fernández-Miñán, A., Bessa, J., Tena, J. J., Gómez-Skarmeta, J. L. Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish. Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).
- Dekker, J. The three "C" s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).
- Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).
- Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies. Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).
- Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression. BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).
