Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Få ett A med 3Cs: Kromosomkonformationsfångst för studenter

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65213
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, 1,2
1Department of Biological and Biomedical Sciences, Bryant University, 2Center of Health and Behavioral Sciences, Bryant University
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi en anpassning av kromosomkonformationstekniken (3C) i detalj med tonvikt på grundutbildning och lärande.

Abstract

Kromosomkonformationsfångst (3C) är ett kraftfullt verktyg som har gett upphov till en familj av liknande tekniker (t.ex. Hi-C, 4C och 5C, här kallade 3C-tekniker) som ger detaljerad information om den tredimensionella organisationen av kromatin. 3C-teknikerna har använts i ett brett spektrum av studier, från att övervaka förändringarna i kromatinorganisationen i cancerceller till att identifiera förstärkare som gjorts med genpromotorer. Medan många av studierna som använder dessa tekniker ställer stora genomomfattande frågor med invecklade provtyper (dvs. encellsanalys), är det ofta förlorat att 3C-teknikerna är grundade i grundläggande molekylärbiologiska metoder som är tillämpliga på ett brett spektrum av studier. Genom att ta itu med tätt fokuserade frågor om kromatinorganisation kan denna banbrytande teknik användas för att förbättra grundforskningen och undervisningslaboratorieupplevelsen. Detta dokument presenterar ett 3C-protokoll och ger anpassningar och tyngdpunkter för implementering vid främst grundutbildningsinstitutioner i grundforskning och undervisningserfarenheter.

Introduction

En organisms genom innehåller inte bara alla gener som krävs för funktion utan också alla instruktioner om hur och när de ska användas. Detta gör reglering av tillgången till genomet till en av cellens viktigaste funktioner. Det finns många mekanismer för att kontrollera genfunktionen; Men på basnivå kommer genreglering ner till förmågan hos regulatoriska transkriptionsfaktorer (transfaktorer) att binda till sina specifika DNA-sekvenser (cis-regulatoriska sekvenser). Detta är inte en medfödd förmåga; Istället styrs den av organisationen/strukturen av genomet i kärnan, som styr tillgängligheten/exponeringen av de cis-regulatoriska sekvenserna för transfaktorerna 1,2,3. Om transfaktorerna inte kan hitta sina cis-regulatoriska sekvenser, kan transfaktorerna inte utföra sina reglerande uppgifter. Detta har gjort förståelse för hur genomer är organiserade i kärnan en viktig källa till undersökning.

Det är allmänt accepterat att eukaryota kromosomer i kärnan under interfas upptar sin egen domän förankrad i kärnlamina och kärnmatris (figur 1), vilket gör kromosomen mer som en skiva pizza, snarare än en nudel på en tallrik spagetti. Kromosomer kondenseras delvis av protein-DNA-interaktioner (kromatin) som vrider och slingar delar av kromosomen. Genom elektronmikroskopi, tredimensionell DNA-fluorescens in situ hybridisering (FISH) och DNA-märkningstekniker (dvs. fluorescerande och artificiell DNA-metylering) har inaktiva domäner av kromatin visat sig vara tätt packade längs kärnperiferin 4,5,6, medan delar av aktivt, mindre kondenserat kromatin finns i kärnans inre 7,8,9, 10. Dessa experiment ger en vidvinkelbild av kromosomdynamiken men gör lite för att fånga de förändringar som sker lokalt runt genpromotorerna som observerats i DNas11,12 och nukleosom13,14,15 studier.

Nyckeln till att låsa upp kromatindynamik med högre upplösning var formuleringen av 3D-kromosomkartläggningstekniken, 3C. 3C-tekniken i sig består av fyra huvudsteg: tvärbindning av kromatin, kromatinuppslutning genom restriktionsenzymer, kromatinligering och DNA-rening (figur 2). De nya artificiella DNA-fragmenten som genereras av denna process kan sedan karakteriseras för att avslöja den nära fysiska kopplingen mellan linjärt avlägsna bitar av DNA16. 3C-tekniken blev grunden för skapandet av flera spin-off-tekniker som utnyttjar de första stegen i 3C för att ställa bredare genomomfattande frågor (t.ex. Hi-C, 4C, ChIP-C). Denna familj av 3C-tekniker har identifierat att kromosomer är organiserade i flera diskreta enheter som kallas topologiskt associerade domäner (TADs). TADs kodas i genomet och definieras av kromatinslingor flankerade av oloopade gränser16,17,18,19. TAD-gränserna upprätthålls av två evolutionärt bevarade och allestädes närvarande faktorer, inklusive CCCT-bindningsfaktor (CTCF) och kohesion, som förhindrar att slingor inom separata TAD interagerar16,20. Slingorna medieras av transfaktorernas interaktion med deras regulatoriska sekvenser, liksom CTCF och kohesion21.

Även om många studier som använder 3C-teknik ställer breda genomomfattande frågor och använder komplicerade provinsamlingstekniker, är formuleringen av 3C-tekniken baserad på grundläggande molekylärbiologiska tekniker. Detta gör 3C spännande för distribution i både grundforskning och undervisningslaboratorier. 3C-tekniken kan användas för mindre fokuserade frågor och är i sig flexibel för uppskalning eller nedskalning (enstaka gener22, kromosomer16 och / eller genom18) beroende på fokus och riktning för de frågor som ställs. Denna teknik har också tillämpats på ett brett spektrum av modellsystem 7,16,19,23 och har visat sig vara mångsidig i sin användning. Detta gör 3C till en utmärkt teknik för studenter genom att eleverna kan få erfarenhet av vanliga molekylärbiologiska tekniker samtidigt som de får värdefull erfarenhet av att svara på riktade frågor.

Här presenteras ett anpassat protokoll för 3C-biblioteksberedning baserat på tidigare publicerade protokoll24,25,26,27. Detta protokoll har optimerats för ungefär 1 × 107 celler, även om det har genererat 3C-bibliotek med så lite som 1 × 105 celler. Detta protokoll har visat sig vara mångsidigt och har använts för att generera 3C-bibliotek från zebrafiskembryon, zebrafiskcellinjer och unga vuxna (YA) Caenorhabditis elegans (rundmask). Protokollet bör också vara lämpligt för cellinjer från däggdjur och, med ytterligare anpassning, jäst.

Målet med dessa anpassningar är att göra 3C mer tillgängligt för studenter. Försiktighet har vidtagits för att använda tekniker som liknar dem som kan åstadkommas i ett grundutbildningslaboratorium. 3C-tekniken ger många inlärningsmöjligheter för studenter att lära sig grundläggande molekylärbiologiska tekniker som kommer att gynna deras utveckling vid bänken, i klassrummet och i deras ansträngningar efter examen.

Protocol

1. Primer design

OBS: 3C-primers designverktyg finns tillgängliga online28. Alternativt kan anpassade primers designas av eleverna (se nedan).

  1. Identifiering av primerns placering
    1. Öppna UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/), välj organismen för studien och sök i regionen av genomet som ska bedömas med hjälp av 3C.
    2. I nästa fönster aktiverar du enzymspåret i fliken Mappning och sekvensering under webbläsaren genom att klicka på Restr Enzymes.
    3. Ange det eller de restriktionsenzymer som ska användas och ställ in visningsläget på förpackning. Klicka på Skicka.
    4. I Variation och Upprepningar kontrollerar du att RepeatMasker är inställd på tät.
    5. Använd begränsningsplatserna som guider för att identifiera intressanta platser som inte ligger inom de maskerade upprepade regionerna (svarta staplar). Markera 300 baspar (bp) som flankerar både uppströms och nedströms sekvensen som omger begränsningsplatsen genom att klicka på positionen (översta spåret) och dra till önskad längd (~ 600 bp).
    6. Släpp musen så visas en popup-ruta. Notera den genomiska platsen, klicka på Zooma in och låt webbläsaren justera till valet.
    7. Håll muspekaren över fliken Visa i det övre menyfliksområdet i webbläsaren och välj DNA i rullgardinsmenyn.
    8. Lämna standardalternativet, notera beteckningen av maskerade sekvenser (det finns ett alternativ att göra dem N). Klicka på hämta DNA.
    9. Den markerade sekvensen visas sedan i fönstret. Kopiera och klistra in den här sekvensen i Primer3 (https://primer3.ut.ee/).
    10. Använd standardinställningarna för Primer3 och generera primers genom att klicka på Pick primers.
    11. I resultaten, notera placeringen av restriktionsenzymet och välj primers som skapar en 200-500 bp PCR-produkt med begränsningsstället i mitten.
    12. Följ dessa steg, designtesta primers 1 kilobas (kb), 2 kb, 5 kb, 10 kb och 20 kb från den eller de intressanta platserna.
    13. För att designa primrarna för ingångskontroll, upprepa dessa steg för en plats 1-2 kB från den intressanta platsen som saknar en begränsningsplats, vilket innebär att den aldrig skärs.
  2. Funktionell primervalidering
    1. För att validera primerfunktionaliteten, ställ in PCR-reaktioner med titrerade primerkoncentrationer och renat genomiskt DNA. Antingen genom kvantitativa eller semikvantitativa medel, bestäm om primers skapar den förväntade produkten.
    2. Omforma primers som inte valideras.

2. Dag 1

OBS: Protokollet kan pausas (frysas vid −20 °C) efter kromatintvärbindning och efter kärnuppsamlingen. Stegen tar i genomsnitt 5-6 h med studenter.

  1. Young-adult (YA) C. elegans nuclei collection (anpassad från Han et al.29)
    1. Kromatin tvärbindning
      1. Samla 5 000 YA-maskar i 30 ml M9-medium i ett 50 ml koniskt rör och snurra vid 400 × g i 2 minuter vid rumstemperatur (RT).
      2. Tvätta maskpelleten 3 gånger mer med M9 för att ta bort bakterier.
      3. Ta bort supernatanten, suspendera maskpelleten igen i 47,3 ml M9 innehållande 2,7 ml 37 % formaldehyd (2 % slutlig) och inkubera under omrörning (gungning eller nutering) i 30 minuter vid rumstemperatur.
        VARNING: Hantera formaldehyd med försiktighet och arbeta under dragskåp med korrekt personlig skyddsutrustning (PPE-labrock, lämpliga handskar och ögonskydd). Formaldehyd är irriterande som påverkar ögon, näsa, hals och lungor.
      4. Snurra maskarna vid 400 × g i 2 min vid rumstemperatur.
      5. Ta bort supernatanten och suspendera maskpelleten igen i 50 ml 1 M glycin. Snurra maskarna vid 400 × g i 2 min vid rumstemperatur.
    2. Nuclei samling
      1. Återsuspendera maskpelleten i 6 ml kyld NP-buffert (50 mM HEPES vid pH 7,5, 40 mM NaCl, 90 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1% Tween 20, 0,2 mM DTT, 0,5 mM spermidin, 0,25 mM spermin, 1x komplett proteashämmare).
      2. Överför snäcksuspensionen till en 7 ml löst sittande Dounce på is. Släpp provet 15x och håll isen i 5 minuter.
      3. Överför masksuspensionen till en 7 ml tätt passande Dounce på is. Släpp provet 20x och håll på is i 5 minuter.
      4. Överför snäcksuspensionen till ett rent 15 ml koniskt rör och tillsätt NP-buffert till totalt 10 ml (cirka 4 ml).
      5. Virvel masksuspensionen på hög inställning i 30 sekunder. Inkubera provet på is i 5 minuter.
      6. Upprepa föregående steg.
      7. Snurra snäcksuspensionen vid 100 × g i 5 min vid 4 °C.
      8. Överför supernatanten till ett nytt 15 ml koniskt rör.
      9. Kontrollera provet för maskskräp. Visualisera 10 μL av provet med ett ljusmikroskop. Om maskrester förekommer, snurra provet vid 2 000 × g i 5 min vid 4 °C, suspendera pelleten på nytt i en ny 10 ml NP-buffert och snurra provet igen vid 100 × g i 5 minuter vid 4 °C. Kassera pelleten, kontrollera supernatanten för maskskräp och upprepa tills provet är fritt från maskskräp.
        OBS: Alternativt kan maskskräpet också avlägsnas genom att spänna provet genom en 40 μm cellsil (6x) följt av en 20 μm cellsil (6x).
      10. Om provet är fritt från maskrester, ta 5 μL av provet, tillsätt 5 μL metylgrönt pyronin (kärnorna blir blåa) och räkna kärnorna med en hemocytometer.
      11. Snurra provet vid 2 000 × g i 5 min vid 4 °C
      12. Ta bort supernatanten, lägg proverna på is och fortsätt; alternativt kan du snäppfrysa kärnorna och förvara vid -80 °C.
  2. Matsmältning av kromatin
    1. Återsuspendera kärnorna i 450 μL rent vatten. Överför kärnorna till ett rent 1,5 ml mikrocentrifugrör.
    2. Tillsätt 60 μL 10x DpnII-restriktionsenzymbuffert till det tvärbundna provet och blanda väl.
      OBS: Andra restriktionsenzymer som fortfarande skär tvärbundet DNA kan användas.
    3. Tillsätt 15 μl 10 % natriumdodecylsulfat (SDS) för att permeabilisera kärnorna och inkubera under omrörning (gungning eller nutering) vid 37 °C i 1 timme.
      VARNING: SDS är irriterande och är giftigt vid förtäring eller absorption genom huden. Hantera försiktigt och använd korrekt personlig skyddsutrustning (labbrock, lämpliga handskar och ögonskydd).
    4. Släck SDS genom tillsats av 75 μl 20 % Triton X-100 och inkubera under omrörning vid 37 °C i 1 timme.
    5. Ta 10 μl från provet som en osmält kontroll. Förvaras vid 4 °C.
    6. Tillsätt 400 U DpnII och inkubera vid 37 °C över natten under omrörning.

3. Dag 2

OBS: I genomsnitt tar det studenter 5 timmar att slutföra dessa steg.

  1. Matsmältning av kromatin
    1. Tillsätt ytterligare 200 U DpnII och inkubera proverna i 4 timmar vid 37 °C under omrörning för att säkerställa fullständig uppslutning av det tvärbundna provet.
    2. Ta en alikvot på 10 μl från proverna som rötningskontroll.
    3. Värmeinaktivera restriktionsenzymet genom att inkubera provet i 20 minuter vid 65 °C (eller enligt tillverkarens anvisningar). Fortsätt till steg 2.1.3.
    4. Om enzymet inte kan inaktiveras genom värme, tillsätt 80 μl 10 % SDS och inkubera provet i 30 minuter vid 65 °C. Tillsätt sedan 375 μL 20% Triton X-100 och blanda genom att virvla. Inkubera provet i 1 timme vid 37 °C och fortsätt till steg 2.2.
  2. Kromatinligering
    1. Överför provet till ett rent 50 ml koniskt rör, justera provvolymen till 5,7 ml med molekylärt H2O och blanda genom att virvla.
    2. Tillsätt 700 μL 10x T4-ligasbuffert och blanda genom att virvla.
    3. Tillsätt 60 U T4 DNA-ligas och blanda genom att virvla.
    4. Inkubera över natten vid 16 °C.

4. Dag 3

OBS: I genomsnitt tar det studenter 15-30 minuter att slutföra dessa steg. Efter inkubationen över natten kan proverna frysas.

  1. Proteinnedbrytning och omvänd tvärbindning
    1. Tillsätt 30 μl proteinas K (10 mg/ml) till 3C-provet och inkubera vid 65 °C över natten under omrörning. Tillsätt 5 μl proteinas K (10 mg/ml) till den osmälta kontrollen och digestionskontrollen och inkubera vid 65 °C över natten under omrörning.

5. Dag 4

OBS: I genomsnitt tar det studenter 4-5 timmar att slutföra dessa steg.

  1. Rening av 3C-biblioteket
    1. Tillsätt 30 μl RNas A (10 mg/ml) till 3C-provet och snurra runt för att blanda. Inkubera provet i 45 minuter vid 37 °C.
    2. Tillsätt 7 ml fenolkloroform till provet och blanda genom skakning.
      VARNING: Fenolkloroform är hud- och ögonirriterande och kan orsaka brännskador om kontakt inte behandlas. Fenolkloroform ska användas i en dragskåp med korrekt ögonskydd och handskar (nitril).
    3. Centrifugera provet i 15 minuter vid 3,270 × g vid rumstemperatur. Samla upp vattenfasen och överför till ett rent 50 ml koniskt rör. Tillsätt lika stora volymer kloroform och blanda provet genom skakning.
    4. Centrifugera provet i 15 minuter vid 3,270 × g vid rumstemperatur. Samla upp vattenfasen och överför till ett rent 50 ml koniskt rör. Tillsätt 7,5 ml molekylär kvalitet H2O, 35 ml 100% etanol och (valfritt) 7 μL glykogen (1 mg / ml). Blanda genom skakning och inkubera vid −80 °C tills provet är fryst.
      OBS: Det kan ta 1 timme eller mer för provet att frysa. Protokollet kan pausas här.
      1. Medan 3C-provet fryser, rena kontrollproverna. Justera volymen till 500 μl med vatten av molekylkvalitet till kontrollproverna och tillsätt 2 μL RNas A (10 mg/ml) blandning genom att vrida på röret.
      2. Snurra kort för att samla provet längst ner på röret. Inkubera proverna i 45 minuter vid 37 °C.
      3. Tillsätt 1 ml fenolkloroform till kontrollproverna och blanda genom att skaka rören. Centrifugera provet i 15 minuter vid 3,270 × g vid rumstemperatur. Samla upp kontrollernas vattenfas och placera i ett rent 1,5 ml mikrocentrifugrör.
      4. Tillsätt lika stora volymer kloroform och blanda provet genom skakning. Centrifugera provet i 15 minuter vid 3,270 × g vid rumstemperatur. Samla upp kontrollernas vattenfas och placera i ett rent 1,5 ml mikrocentrifugrör.
      5. Tillsätt 1 ml 100% etanol och 2 μL glykogen (1 mg/ml). Blanda genom skakning och inkubera vid −80 °C i 30 minuter.
      6. Centrifugera provet i 15 minuter vid 3,270 × g vid 4 °C. Ta bort supernatanten och tillsätt 750 μl kyld 70% etanol.
      7. Centrifugera provet i 10 minuter vid 3,270 × g vid 4 °C. Ta bort supernatanten och lufttorka proverna. Återsuspendera pelleten i 50 μl molekylärt H2O. Frys eller fortsätt till steg 6.
    5. Centrifugera provet i 60 minuter vid 3,270 × g vid 4 °C. Ta bort supernatanten och tillsätt 10 ml kyld 70% etanol. Stör och bryt upp DNA-pelleten genom att skaka provet för att blanda.
    6. Centrifugera provet i 30 minuter vid 3,270 × g vid 4 °C. Ta bort supernatanten och låt provet delvis lufttorka vid rumstemperatur. Återsuspendera pelleten i 150 μl 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) genom pipettering upp och ner. Detta är "3C-biblioteket."
      OBS: Frys provet eller fortsätt till analysen.

6. Dag 5

OBS: I genomsnitt tar det studenter 1-2 timmar att slutföra dessa steg.

  1. Bestämning av provkvaliteten med hjälp av kontrollprimerns standardkurva
    1. Kvantifiera DNA-koncentrationen för 3C-provet samt alla kontroller och justera proverna till 30 μg/μl (om koncentrationerna tillåter det). Seriellt späds de utspädda proverna två gånger fyra gånger, vilket resulterar i fem utspädningar för varje prov (1x, 0,5x, 0,25x, 0,125x, 0,0625x).
      Anmärkning: Om kvantifiering inte lätt kan göras, späd proverna seriellt enligt ovan och fortsätt.
    2. Ställ in PCR-reaktioner för 3C, genomisk kontroll och smält kontroll för varje utspätt prov med kontrollprimrarna: 1 μL DNA, 10 μL 5x reaktionsbuffert, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 mM kontrollprimer (framåt och bakåt blandad), 1 μL Taq-polymeras och 36 μL vatten.
    3. Följ instruktionerna för programvaran som är specifik för PCR-maskinen, ställ in PCR-programmet för standardkurva med cykelförhållanden enligt följande: 30 s vid 98 °C; 30 cykler om 5 s vid 98 °C, 5 s vid 60 °C och 10 s vid 72 °C, 1 min vid 72 °C; 4 °C håll.
    4. Använd programvaran för att generera standardkurvorna för proverna. När programvaran har genererat kurvan, notera PCR-effektiviteten och R2-värdet .
  2. Bestämning av DNA-koncentrationen
    1. För att bestämma DNA-koncentrationen i 3C-proverna, jämför proverna med ett genomiskt DNA-prov med känd koncentration. Späd proverna till 30 ng/μl och späd den genomiska kontrollen serievis från 10 ng/μL till 0,01 ng/μL i tvåfaldiga steg för att skapa en standardkurva.
      OBS: Om kvantifiering inte lätt kan göras, späd provet 1:10 och fortsätt.
    2. Ställ in PCR-reaktionerna för 3C, genomisk kontroll och smält kontroll för varje utspätt prov med kontrollprimrarna: 1 μL DNA, 10 μL 5x reaktionsbuffert, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 mM kontrollprimer (framåt och bakåt blandad), 1 μL Taq-polymeras och 36 μL vatten.
    3. Följ instruktionerna för programvaran som är specifik för PCR-maskinen, ställ in PCR-programmet för standardkurvan med hjälp av cykelförhållandena enligt följande: 30 s vid 98 °C; 30 cykler om 5 s vid 98 °C, 5 s vid 60 °C och 10 s vid 72 °C, 1 min vid 72 °C; 4 °C håll.
    4. Med hjälp av programvaran genererar du standardkurvorna för proverna och plottar 3C-proverna på kurvan. Jämför positionen för 3C-provets överflöd med standardkurvan som skapas av reaktionerna av det genomiska DNA med känd koncentration och justera 3C-proverna till 30 ng / μL.
  3. Bestämning av närvaron eller frånvaron av kromatininteraktion
    1. Ställ in qPCR-reaktioner med 30 ng av 3C-provet, genomiskt kontrollprov och smält kontrollprov: 1 μL DNA, 10 μL 5x reaktionsbuffert, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 mM primer (framåt och bakåtblandad), 1 μL Taq-polymeras och 36 μL vatten.
      Anmärkning: Reaktionerna bör ställas in med hjälp av kontrollprimern, testprimrarna för enskilda genomiska loci och önskade kombinationer av testprimrarna (plats "a" framåt och plats "b" bakåt) som används för att bestämma kromatininteraktionen (figur 3).
    2. Följ instruktionerna för PCR-maskinens programvara, ställ in PCR-programmet enligt följande: 30 s vid 98 °C; 40 cykler om 5 s vid 98 °C, 5 s vid 60 °C och 10 s vid 72 °C, 1 min vid 72 °C; 4 °C håll.
    3. När PCR har körts, inspektera förstärkningsdiagrammet. Se till att PCR-reaktionerna visar exponentiell förstärkning och fördubblar varje cykel.
      OBS: Reaktioner som inte visar exponentiell amplifiering kan inte analyseras ytterligare.
    4. Följ instruktionerna för PCR-maskinens programvara och definiera tröskelvärdet för qPCR-experimentet.
    5. Exportera Ct-värdena för alla exempel.
    6. Bestäm digestionseffektiviteten med hjälp av testprimern (TP) och kontrollprimern (CP) Ct-värdena från de osmälta kontrollproverna (UC) och de smälta kontrollproverna (DC) med hjälp av ekvation (1).
      Procent smält = 100 - Equation 1 (1)
    7. Dessa värden bör ligga i intervallet 80% -90% matsmältning. Registrera dessa värden (figur 4A).
    8. Bestäm den relativa kromatininteraktionen med hjälp av testprimerkombinationen (TPC) och kontrollprimerns (CP) Ct-värden från den osmälta kontrollen (UC) och 3C (3C) proverna med hjälp av ekvation (2).
      Kromatininteraktion = 100 - Equation 2 (2)
    9. Plotta värdena för varje prov i ett stapeldiagram för varje testprimerkombination.
    10. Jämför signalen från 3C-proverna med kontrollproverna för att avgöra om 3C-provet har anrikning av en viss kromatininteraktion över kontrollproverna. 3C-prover som visar anrikning över kontrollen kan betraktas som villkorligt positiva och kräver validering med Sanger-sekvensering (figur 4B).
      OBS: När du analyserar grafdata är det viktigt att komma ihåg att om inte en "kontrollmall" används (se diskussion) kan överflödet mellan reaktioner (dvs. från en uppsättning primers till nästa) inte jämföras.
  4. Identifiering av 3C-produkterna
    1. Kör PCR-produkterna på en 1,5% agarosgel.
    2. Visualisera gelen för rätt storlek på PCR-produkterna med hjälp av en UV-ljuslåda eller geldokumentationssystem.
      OBS: Välkonstruerade 3C-bibliotek kommer att innehålla ett varierat utbud av DNA-fragment, och trots tidigare validering av primrarna för specificitet har PCR-reaktioner från 3C-bibliotek potential att innehålla många band (figur 5A). Detta hindrar inte analysen av 3C-biblioteken.
    3. Punktbeskatta de produktband som motsvarar den förväntade fragmentstorleken och utför gelextraktion av PCR-produkterna enligt instruktionerna i ett kommersiellt kit eller det hemlagade protokollet som beskrivs nedan.
      VARNING: UV-ljus är ett känt cancerframkallande ämne, och stor försiktighet bör vidtas för att begränsa den tid som utsätts för UV-ljus. UV-beständigt ögonskydd, en provsköld, handskar och en labbrock ska bäras.
      1. För att konstruera en hemlagad reningspatron, sticka ett hål i botten av ett 0,5 ml rör med en nål.
      2. Packa en liten mängd bomull från en bomullstuss i botten av 0,5 ml röret och fyll inte mer än hälften av röret.
      3. Placera 0,5 ml röret i ett 1,5 ml rör; Se till att det mindre röret vilar på läppen på det större röret, inte i röret.
      4. Skär försiktigt ett gelfragment i mindre bitar och placera det i patronens 0,5 ml rör.
      5. Placera aggregatet i en −20 °C frys i 5 min. Snurra enheten i 3 minuter vid 13 000 × g vid rumstemperatur.
      6. Håll 1,5 ml röret med extraherat DNA i buffert och kassera 0,5 ml röret som innehåller agarosskräpet.
      7. Renat DNA kan skickas för Sanger-sekvensering med hjälp av framåt- och bakåtprimers för 3C-fragmentet.
    4. Identifiering av kromatinkontakter med Blat
      1. När sekvenseringen är klar, kontrollera om proverna uppfyller de kvalitetskontrollstandarder som anges i sekvenseringsrapporten.
      2. För sekvenser som passerar QC öppnar du .seq- och .ab1-filer (spår) i ett sekvensredigeringsprogram som en annan plasmidredigerare (ApE), inspekterar .ab1-filen för tydliga basanropstoppar och redigerar topparna som felaktigt anropas i .seq-filen.
      3. Använd den redigerade .seq-filen och sök efter DpnII-webbplatsen. Beroende på sekvensresultatet bör detta vara halvvägs in i den rapporterade sekvensen.
      4. För att bestämma om sekvensen är den förväntade målsekvensen, markera DpnII-platsen och ytterligare 30-50 bp av uppströmssekvensen som motsvarar den främre primern för de genomiska loci som testats för 3C. Utför en Blat-sökning av denna sekvens mot målarten. Se till att de genomiska loci matchar primerns.
      5. Upprepa steget ovan för den omvända primersekvensen och se till att den returnerade genomiska locus matchar den för den omvända primern.

Representative Results

Denna procedur kommer att producera ett experimentellt 3C-prov och två kontrollprover (osmält och smält). Med hjälp av dessa tre prover utfördes qPCR. Från dessa resultat beräknades rötningseffektiviteten (ekvation 1) och registrerades (tabell 1). Från dessa beräkningar bestämdes att 3C-provet hade en cirka 88% matsmältningseffektivitet (genomsnitt av tabell 1) över de sju testade genomiska locierna.

Därefter testades proverna för förekomst av långväga kromatinkontakter mellan de olika genomiska loci med kombinationer av loci-specifika primers (tabell 2) och qPCR. Med hjälp av dessa resultat beräknades produktmängderna i förhållande till en kontrollprimeruppsättning (ekvation 2) och graferades för jämförelse (figur 4). Dessa data indikerade att 8 av de 10 reaktionerna var villkorade positiva för långväga interaktioner.

PCR-reaktionerna kördes sedan på en agarosgel. Den förväntade PCR-produkten för de åtta villkorade positiva och en negativ reaktion gelrenades och skickades för Sanger-sekvensering. Resultaten för representativa positiva (blå pil, blå ruta) och negativa reaktioner (röd pil, röd ruta) visas (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Kromosomstruktur i kärnan. Hypotetisk kromosomorganisation inuti kärnan. a) Kärnhölje, svarta linjer. b) Nukleärt lamina, orange. c) Heterokromatin, komprimerade linjer. d) Eukromatin, lösa slingor. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Schematisk bild av 3C-protokollet. Avlägsna delar av linjära kromosomer (blå, gul och rosa) förs nära varandra i kärnan genom regulatoriska slingor. (A) Slingstrukturerna förmedlas av transkriptionsfaktorer (grå cirkel och svart stjärna); Dessa interaktioner bevaras genom kemisk tvärbindning. (B) Slingorna bryts genom enzymatisk nedbrytning (svarta linjer). (C) Avlägsna kromatinbitar ligeras samman genom de klibbande ändarna som skapas av matsmältningen. (D) DNA renas från protein. (E) Sekvensen i fragmenten identifieras och mappas tillbaka till genomet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: 3C-primerschemat. 3C-primrarna är utformade runt restriktionsställen på varierande avstånd från den genomiska platsen av intresse. De rosa pilarna representerar de experimentella primeruppsättningarna som omger en DpnII-plats. De experimentella primrarna kan blandas och matchas för att bedöma kromatinslingning i regionen. De orange primrarna representerar en negativ kontroll utan en DpnII-plats. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Representativa qPCR-data för ett 3C-experiment. Relativ överflöd av 3C-testprimeruppsättningarna. (A) Kontrolldiagram som visar produktens relativa förekomst i den osmälta kontrollen (blå), den rötade kontrollen (grå) och 3C-provet (orange). b) 3C-experimentet. Produktens relativa förekomst från kombinationer av testprimers i den osmälta kontrollen (blå), den rötade kontrollen (grå) och 3C-provet (orange). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Visualisering av 3C qPCR-produkter. Överst, gel med qPCR-slutpunktsprodukterna med de angivna proverna. Nederst, representativa Sanger-sekvensspårningsfiler för de angivna reaktionerna. Det orange provet är ett exempel på ett falskt positivt resultat (se figur 4, r38/34) och det blå provet är ett exempel på ett sant positivt med DpnII-platsen som anges ovanför spåret. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Plats % matsmältning
R8 86.98
R3 88.44
R38 89.64
R34 87.55
R33 87.85
R14 86.97
R47 89.45

Tabell 1: Beräknad rötningseffektivitet.

Namn Sekvens Genomiska loci
r3 FWD ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC chrX:11361475
r3 RVS TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC chrX:11361561
r38 FWD TTACTTCTGAAGTAATCTTTTTTTCCCC chrX:5859700
r38 RVS AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG chrX:5859775
r34 FWD ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG chrX:5429702
r34 RVS AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC chrX:5429777
r33 FWD AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC chrX:6296704
r33 RVS TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG chrX:6296807
r14 FWD AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG chrX:8036367
r14 RVS ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTC chrX:8036427
r47 FWD ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC chrX:9464939
r47 RVS AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC chrX:9465064
r8 FWD GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG chrX:11094257
r8 RVS TTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACC chrX:11094362
Kontroll primer FWD CAATCGTCTCGCTCACTTGTC chrX:7608049
Kontrollera primer RVS GATGTGAGCAACAAGGCACC chrX:7608166

Tabell 2: Primers för det representativa 3C-experimentet.

Discussion

3C är en kraftfull teknik som är förankrad i grundläggande molekylära tekniker. Det är denna grund för grundläggande verktyg som gör 3C till en så spännande teknik att använda med studenter. Med så många nya studier som observerar kromatindynamik i så stor skala, har användningen av dessa resultat för att utforma ett smalfokuserat experiment på en enda gen eller genomisk region potential att skapa ett unikt och effektfullt experiment i grundforskning. Ofta anses experiment som dessa vara för avancerade för studenter, men med noggrann planering är de lätt att uppnå. Det är viktigt att notera att analyserna som är utformade för att undersöka kromatinanslutningarna som fångas av 3C-biblioteket kan variera från semikvantitativ slutpunkt PCR till helgenomsekvensering. Faktum är att data från det första 3C-papperet16 genererades från qPCR. Detta breda spektrum av analyser kan alla användas eftersom alla 3C-tekniker producerar samma produkt - ett bibliotek av DNA-fragment som representerar 3D-anslutningar i kärnan.

Här presenteras en anpassning av ett mer flexibelt och tillmötesgående protokoll som passar bättre för grundforskare. De pausperioder som anges ovan innebär förseningar över natten. Dessa pauser kan dock sträcka sig över helger och, när det gäller celler och kärnor, i veckor. Det viktigaste övervägandet är när arbetet kommer att bli gjort. Ofta i protokoll finns det tidskänsliga steg när paus inte är ett alternativ. Utanför några punkter (dag 1 och dag 2) finns det många ställen att stanna och frysa provet. Dessa är kritiska när man arbetar med studenter där scheman och tidpunkter för laboratoriearbete måste vara flexibla. Förutom att konstruera dessa stopp i protokollet uppmuntras studenter att arbeta i par eller till och med små grupper om tre eller fyra. Grupper fungerar bra för detta protokoll, eftersom eleverna kan stödja varandra och skapa ett kompissystem så att alla arbetar säkert. Laborationer är också roligare med andra inblandade. Med grupper kan eleverna också arbeta med en mängd olika frågor med fokus på organisationen av kromatin medan de fortfarande utför samma protokoll. Således, även när eleverna arbetar med separata projekt, länkar protokollet sina ansträngningar, och på grund av detta kan de stödja varandra.

Andra anpassningar är avsedda att fungera runt det faktum att vissa specialverktyg och utrustning inte nödvändigtvis finns i alla grundutbildningsinstitutioner. Dessa utrustningar inkluderar men är inte begränsade till qPCR-termocykler, geldokumentationssystem och nanovolymspektrometrar. Faktum är att dessa utrustningar är praktiska men är inte ett krav. Här beskrivs den klassiska metoden för 3C också i primerdesigndelen; Detta innebär att identifiera en genomisk plats av intresse och utifrån det bedöma andra genomiska loci för kromatinkontaktpunkter längre bort. Den här tekniken fungerar också bra om en publicerad datauppsättning används, till exempel en datauppsättning som använder Hi-C, där kända positiva (anslutande) och negativa (icke-anslutande) lokus identifieras. Att utforma experiment med hjälp av dessa publicerade dataset är en annan stor anpassning för undervisningslaboratorier, eftersom chansen för framgångsrik identifiering av kromatinanslutningar vanligtvis är större. Dessutom kan forskningsartikeln diskuteras i klassen och användas som referens.

Detta protokoll använder en modifierad qPCR-metod för att visualisera 3C-produktbildningen. Kontroller är avgörande för framgången med 3C-tekniken. Varje experiment använder både provkontroller och primerkontroller för att bestämma slutförandet av 3C-proceduren. Provkontrollerna inkluderar en osmält kontroll (genomiskt DNA) och smält kontroll. Den osmälta kontrollen bestämmer baslinjesignalen för primeruppsättningarna och används med den tvärbundna matsmältningskontrollen för att bestämma matsmältningseffektiviteten Det förväntas att det kommer att finnas en minskning av produkten för alla primers riktade över ett restriktionsställe. Att jämföra detta värde med den osmälta kontrollen ger en indikation på hur väl provet smältes.

Primers för PCR inkluderar en kontrollprimer och testprimers. Kontrollprimern är en primeruppsättning som ligger nära den genomiska regionen som analyseras och inte innehåller ett restriktionsställe. Detta ger baslinjen för att bestämma överflödet av testprimerns PCR-produkter. Testprimers är framåt- och bakåtprimers som flankerar ett restriktionsställe för en viss genomisk plats av intresse (figur 3). Reaktioner som använder dessa primeruppsättningar jämförs för att bestämma matsmältningseffektiviteten, eftersom produktens överflöd bör sjunka om begränsningsstället har skurits. Vid bestämning av kromatinorganisationen paras en testprimer från en locus ihop med en annan testprimer från en annan genomisk locus för att bestämma om dessa två loci är nära varandra i 3D-rymden. I så fall är förväntningen att en PCR-produkt endast skulle hittas med 3C-provet som mall.

Det är viktigt att notera att även validerade primers har en tendens att misslyckas (Figur 4: r14 primeruppsättning). Dessutom identifieras PCR-produkter ofta i kontrollreaktioner och i reaktioner där en kromatinanslutning inte förutsägs (såsom den smälta kontrollen, eftersom den inte ligeras). Dessa instanser sekvenseras och misslyckas antingen med Sanger QC eller returneras utan en definierad sekvens (figur 5). Dessutom genererar traditionella 3C-experiment en "kontrollmall", ett otvärbundet, smält och ligerat DNA-prov, som representerar alla möjliga ligerade fragment som kan produceras med en given mängd DNA. "Kontrollmallen" spelar en viktig roll för att jämföra intensiteten hos qPCR-signaler mellan två genomiska loci för att avgöra om signalen representerar en sann interaktion eller bara en slumpmässig association. Att skapa en "kontrollmall" kan vara problematisk, eftersom en stor del av kromatinet som analyseras måste fångas i form av en artificiell kromosom och bearbetas tillsammans med 3C-proverna. Att säkra en sådan konstruktion kanske inte är genomförbar, och att skapa en kan ligga utanför ramen för ett terminsprojekt. På grund av dessa svårigheter föreslår vi att du använder en kontrollprimer. Kontrollprimern ersätter inte alla funktioner i "kontrollmallen" men ger fortfarande möjlighet att analysera data för att göra "närvaro" eller "frånvaro" -bestämningar.

Vid utförande av qPCR är det viktigt att använda lika stora mängder av provet. Detta bör bestämmas, även om man använder en nanospektrofotometer såsom en nanodroppe, genom att generera en standardkurva från genomiskt DNA med en känd koncentration och anpassa 3C-proverna till den linjen. Dessa mängder bör registreras och användas i efterföljande PCR-rapporter. Kvaliteten på PCR-reaktionen är också viktig. Eftersom PCR körs i qPCR mäts produktens överflöd med fluorescens och registreras. Denna inspelning är tillgänglig i förstärkningsdiagrammet. När programmet är klart är det viktigt att kontrollera förstärkningsdiagrammet och se till att reaktionerna (förutom kontrollerna utan mall) har tre faser: en baslinje, en exponentiell och en platå/mättnadsfas. Det är viktigt att kontrollera att reaktionerna har en exponentiell fas, särskilt för att fastställa tröskelvärdet (se nedan). För serieutspädda prover bör dessutom Ct-värdena ändras i överensstämmelse med utspädningen av provet (den högsta koncentrationen har de lägsta Ct-värdena, medan den lägsta koncentrationen har de högsta Ct-värdena). Prover som inte återspeglar denna förändring i amplifieringskurvan kräver en ny utspädning eller indikerar ett större problem med 3C-provbildningen. Slutligen, medan standardkurvan genereras, beräknar PCR-programvaran PCR-effektiviteten och R2-värdet . PCR-effektiviteten bör vara större än 90 % ochR2-värdet bör vara större än 0,99. Om något av dessa villkor inte är uppfyllt är det troligt att något är fel med provet eller PCR-primrarna.

Efter qPCR kan den procentuella matsmältningen och närvaron av 3C-interaktioner beräknas med qPCR Ct för varje reaktion. För att bestämma dessa måste först tröskeln för PCR-reaktionen fastställas. Detta görs normalt med hjälp av programvaran som medföljer qPCR-maskinen. Om tröskelvärdet fastställs definieras koncentrationen av PCR-produkten som ska användas för att jämföra Ct-provvärdena. Tröskelvärdet bör dela förstärkningskurvorna för PCR-reaktionerna i den exponentiella förstärkningsfasen. Endast PCR-reaktioner med exponentiell amplifiering kan jämföras (i detta fall kontrollprimrarna och testprimerreaktionerna), eftersom detta är det enda sättet att säkerställa att reaktionerna förstärker DNA i samma takt och kan jämföras troget. Vid analys av 3C-graferna identifieras villkorligt positiva reaktioner som de med mer produkt över kontrollproverna, genomisk kontroll och matsmältningskontroll (figur 4B). Dessa prover måste dock valideras ytterligare med hjälp av Sanger-sekvensering efter gelrening av PCR-produkten.

Efter Sanger-sekvensering kan prover som passerar QC analyseras med Blat. Målet med denna analys är att avgöra om provet har sekvensen av båda målgenomiska loci som flankerar restriktionsstället (DpnII i fallet med detta protokoll). Om båda sekvenserna identifieras kan 3C-fragmentet betraktas som validerat. Om resultaten av Blat inte returnerar den förväntade sekvensen kan detta indikera att en eller båda primrarna inte är optimala, vilket resulterar i ett falskt positivt qPCR-resultat. Spårningsfilerna för de falska positiva proverna kommer att ha odefinierade bastoppar och Seq-rapporterna innehåller mestadels "n" basanrop.

Sanger-validering är avgörande, eftersom falska positiva resultat från artefaktisk PCR-produktbildning är möjliga. Dessa falska positiva resultat kan identifieras när sekvenseringsprodukterna inte har den förväntade målsekvensen eller en DpnII-plats som är karakteristisk för ett korrekt 3C-fragment (figur 5). Sekvenseringen av PCR-fragmenten ger också en annan datapunkt för experimentet och driver hem till eleverna att 3C-tekniken identifierar avlägsna genomiska loci som samlas i 3D-rymden i kärnorna.

3C-tekniken ger en mängd grundläggande molekylära tekniker för studenter i ett flexibelt, enkelt förfarande. Denna 3C-teknik är också en startpunkt för de andra 3C-teknikerna som innehåller nästa generations sekvensering (NGS). Dessa typer av experiment kan utsätta studenter för viktiga aspekter av bioinformatik och är förankrade i de grundläggande principerna som beskrivs här. Grundutbildning och engagemang är nyckeln till deras framgång och utveckling som unga forskare. Genom att ge dessa möjligheter kan studenter stärka sin förståelse för grundläggande principer samtidigt som de bygger sitt förtroende för att ta itu med avancerade tekniker och frågor.

Disclosures

Författarna deklarerar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes delvis av Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence från National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health under bidragsnummer P20GM103430 och Bryant Center of Health and Behavioral Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% Formaldehyde  Millapore-Sigma F8775
100% Ethanol Millapore-Sigma E7023
CaCl2 MP Biomedical 215350280
chloroform Millapore-Sigma C0549
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Millapore-Sigma COEDTAF-RO mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh
Dithiothreitol (DTT) Millapore-Sigma D0632 1 M stock diluted to 500 µM in Sucrose buffer and GB buffer fresh
DpnII NEB R0543M
Glycerol Millapore-Sigma G9012
glycine Millapore-Sigma G8898
glycogen Millapore-Sigma 10901393001
HEPES Millapore-Sigma H3375
KCl Millapore-Sigma P3911
KH2PO4 Millapore-Sigma P5655
methyl green pyronin   Millapore-Sigma HT70116
MgAc2 Thermoscientific 1222530
Na2HPO4 Millapore-Sigma S5136
NaCl Millapore-Sigma S9888
phenol-chloroform  Millapore-Sigma P3803
Pronase Millapore-Sigma 11459643001
Proteinase K IBI Scientific IB05406
qPCR Ready mix (Phire Taq etc) Millapore-Sigma KCQS07
RNase A  Millapore-Sigma R6148
Sodium Acetate Millapore-Sigma S2889
sodium dodecyl sulfate (SDS) Millapore-Sigma L3771
Sucrose Millapore-Sigma S0389
T4 DNA Ligase Promega M1804
Tris-HCl Millapore-Sigma 108319
Triton X-100 Millapore-Sigma T9284
Trypsin-EDTA  Millapore-Sigma T4049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C. Chromatin architectural proteins. Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).
  2. Nalabothula, N., et al. The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation. BMC Genomics. 15, 92 (2014).
  3. John, S., et al. Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns. Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).
  4. Fawcett, D. W. On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates. The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).
  5. Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina. Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).
  6. Finlan, L. E., et al. Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells. PLoS Genetics. 4 (3), e1000039 (2008).
  7. Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development. Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).
  8. Chambeyron, S., Bickmore, W. A. Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription. Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).
  9. Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories. The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).
  10. Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH. The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).
  11. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The role of chromatin during transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  12. Chen, A., Chen, D., Chen, Y. Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals. Gene. 667, 83-94 (2018).
  13. Hughes, A. L., Rando, O. J. Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo. Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).
  14. Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging. Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).
  15. Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern. Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).
  16. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  17. van Berkum, N. L., Dekker, J. Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology. Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).
  18. Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus. American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).
  19. Crane, E. E. Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2. University of California, Berkeley. , PhD thesis (2012).
  20. Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell. 98 (3), 387-396 (1999).
  21. Cuadrado, A., et al. Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells. Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).
  22. Sarro, R., et al. Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development. Development. 145 (7), (2018).
  23. Tolhuis, B., et al. Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture. PLoS Genetics. 7 (3), e1001343 (2011).
  24. Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
  25. Fernández-Miñán, A., Bessa, J., Tena, J. J., Gómez-Skarmeta, J. L. Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish. Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).
  26. Dekker, J. The three "C" s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).
  27. Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).
  28. Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies. Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).
  29. Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression. BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).

Tags

Genetik utgåva 195
Få ett A med 3Cs: Kromosomkonformationsfångst för studenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Joniec, A., Leszczynski, J., Ndoye,… More

Joniec, A., Leszczynski, J., Ndoye, S., Sylvia, J., Weicksel, S. E. Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates. J. Vis. Exp. (195), e65213, doi:10.3791/65213 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter