Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

3C'lerle A Almak: Lisans Öğrencileri için Kromozom Konformasyon Yakalama

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65213
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, 1,2
1Department of Biological and Biomedical Sciences, Bryant University, 2Center of Health and Behavioral Sciences, Bryant University
* These authors contributed equally

Summary

Burada, kromozom konformasyon yakalama (3C) tekniğinin lisans katılımı ve öğrenimine vurgu yaparak ayrıntılı olarak bir adaptasyonunu sunuyoruz.

Abstract

Kromozom konformasyon yakalama (3C), kromatinin üç boyutlu organizasyonu hakkında ayrıntılı bilgi sağlayan benzer tekniklerin (örneğin, Hi-C, 4C ve 5C, burada 3C teknikleri olarak anılacaktır) bir ailesini ortaya çıkaran güçlü bir araçtır. 3C teknikleri, kanser hücrelerinde kromatin organizasyonundaki değişikliklerin izlenmesinden, gen promotörleri ile yapılan arttırıcı temasların belirlenmesine kadar çok çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır. Bu teknikleri kullanan çalışmaların çoğu, karmaşık örnek tipleriyle (yani, tek hücreli analiz) genom çapında büyük sorular sorarken, genellikle kaybolan şey, 3C tekniklerinin geniş bir çalışma yelpazesine uygulanabilir temel moleküler biyoloji yöntemlerine dayanmasıdır. Kromatin organizasyonunun sıkı bir şekilde odaklanmış sorularını ele alarak, bu son teknoloji teknik, lisans araştırma ve öğretim laboratuvarı deneyimini geliştirmek için kullanılabilir. Bu makale bir 3C protokolü sunmakta ve lisans araştırma ve öğretim deneyimlerinde öncelikle lisans kurumlarında uygulama için uyarlamalar ve vurgu noktaları sunmaktadır.

Introduction

Bir organizmanın genomu sadece işlev için gerekli tüm genleri değil, aynı zamanda bunların nasıl ve ne zaman kullanılacağına dair tüm talimatları da içerir. Bu, genoma erişimi düzenlemeyi hücrenin en önemli işlevlerinden biri haline getirir. Gen fonksiyonunu kontrol etmek için birçok mekanizma vardır; Bununla birlikte, baz düzeyinde, gen regülasyonu, düzenleyici transkripsiyon faktörlerinin (trans-faktörler) spesifik DNA dizilerine (cis-düzenleyici diziler) bağlanma kabiliyetine bağlıdır. Bu doğuştan gelen bir yetenek değildir; bunun yerine, çekirdekteki genomun organizasyonu / yapısı tarafından yönetilir, bu da cis-düzenleyici dizilerin trans-faktörlere kullanılabilirliğini / maruziyetini kontrol eder 1,2,3. Trans-faktörler cis-düzenleyici dizilerini bulamazlarsa, trans-faktörler düzenleyici görevlerini yerine getiremezler. Bu, genomların çekirdekte nasıl organize edildiğini anlamayı önemli bir araştırma kaynağı haline getirmiştir.

İnterfaz sırasında, çekirdekteki ökaryotik kromozomların nükleer lamina ve nükleer matrise demirlenmiş kendi alanlarını işgal ettikleri yaygın olarak kabul edilmektedir (Şekil 1), böylece kromozomu bir spagetti tabağı üzerinde bir erişte yerine bir dilim pizza gibi yapar. Kromozomlar, kromozomun bölümlerini büken ve döngüleyen protein-DNA etkileşimleri (kromatin) ile kısmen yoğunlaştırılır. Elektron mikroskobu, üç boyutlu DNA floresansı in situ hibridizasyon (FISH) ve DNA etiketleme teknikleri (yani, floresan ve yapay DNA metilasyonu) yoluyla, kromatinin aktif olmayan alanlarının nükleer çevre 4,5,6 boyunca sıkıca paketlendiği bulunurken, aktif, daha az yoğunlaştırılmış kromatin kısımlarının çekirdeğin iç kısmında bulunduğubulunmuştur 7,8,9, 10. Bu deneyler, kromozom dinamiklerinin geniş açılı bir görünümünü sağlar, ancak DNaz 11,12 ve nükleozom 13,14,15 çalışmalarında gözlenen gen promotorları etrafında lokal olarak meydana gelen değişiklikleri yakalamak için çok az şey yapar.

Daha yüksek çözünürlüklü kromatin dinamiklerinin kilidini açmanın anahtarı, 3D kromozom haritalama tekniği olan 3C'nin formülasyonuydu. 3C tekniğinin kendisi dört ana adımdan oluşur: kromatinin çapraz bağlanması, kısıtlama enzimleri ile kromatin sindirimi, kromatin ligasyonu ve DNA saflaştırması (Şekil 2). Bu süreç tarafından üretilen yeni yapay DNA fragmanları daha sonra DNA16'nın doğrusal olarak uzak parçaları arasındaki yakın fiziksel ilişkiyi ortaya çıkarmak için karakterize edilebilir. 3C tekniği, daha geniş genom çapında sorular sormak için 3C'nin ilk adımlarını kullanan çoklu spin-off tekniklerinin oluşturulmasının temeli haline geldi (örneğin, Hi-C, 4C, ChIP-C). Bu 3C teknikleri ailesi, kromozomların topolojik olarak ilişkili alanlar (TAD'lar) olarak adlandırılan çoklu ayrı birimler halinde düzenlendiğini tespit etmiştir. TAD'lar genomda kodlanır ve ilmeksiz sınırlarla çevrili kromatin döngüleri ile tanımlanır16,17,18,19. TAD sınırları, CCCT bağlanma faktörü (CTCF) ve kohezyon dahil olmak üzere evrimsel olarak korunmuş ve her yerde bulunan iki faktör tarafından korunur ve bu da ayrı TAD'lar içindeki döngülerin16,20 ile etkileşime girmesini önler. Döngülere, trans-faktörlerin düzenleyici dizileri ile etkileşimi, CTCF ve kohezyon21 aracılık eder.

3C teknolojilerini kullanan birçok çalışma genom çapında geniş sorular sormasına ve karmaşık örnek toplama teknikleri kullanmasına rağmen, 3C tekniğinin formülasyonu temel moleküler biyoloji tekniklerine dayanmaktadır. Bu, 3C'yi hem lisans araştırma hem de öğretim laboratuvarlarında dağıtım için ilgi çekici hale getirir. 3C tekniği daha küçük odaklı sorular için kullanılabilir ve sorulan soruların odağına ve yönüne bağlı olarak yukarı veya aşağı ölçeklendirmeye (tek genler22, kromozomlar16 ve / veya genomlar18) doğal olarak esnektir. Bu teknik aynı zamanda çok çeşitli model sistemlere 7,16,19,23 uygulanmış ve kullanımında çok yönlü olduğu kanıtlanmıştır. Bu, 3C'yi lisans öğrencileri için mükemmel bir teknik haline getirir, çünkü öğrenciler ortak moleküler biyoloji tekniklerinde deneyim kazanabilir ve aynı zamanda yönlendirilmiş soruları cevaplamada değerli deneyimler kazanabilirler.

Burada daha önce yayınlanmış 24,25,26,27 protokollerine dayanan 3C kütüphane hazırlığı için uyarlanmış bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol yaklaşık 1 × 107 hücre için optimize edilmiştir, ancak 1 × 105 hücreli 3C kütüphaneleri oluşturmuştur. Bu protokolün çok yönlü olduğu kanıtlanmıştır ve zebra balığı embriyolarından, zebra balığı hücre hatlarından ve genç-yetişkin (YA) Caenorhabditis elegans'tan (yuvarlak kurt) 3C kütüphaneleri oluşturmak için kullanılmıştır. Protokol ayrıca memeli hücre hatları ve daha fazla adaptasyon ile maya için uygun olmalıdır.

Bu uyarlamaların amacı, 3C'yi lisans öğrencileri için daha erişilebilir hale getirmektir. Bir lisans öğretim laboratuvarında gerçekleştirilebilecek tekniklere benzer tekniklerin kullanılmasına özen gösterilmiştir. 3C tekniği, lisans öğrencilerine tezgâhta, sınıfta ve mezuniyet sonrası çabalarında gelişimlerine fayda sağlayacak temel moleküler biyoloji tekniklerini öğrenmeleri için birçok öğrenme fırsatı sunmaktadır.

Protocol

1. Astar tasarımı

NOT: 3C astarlar tasarım araçları çevrimiçi olarak mevcuttur28. Alternatif olarak, özel astarlar öğrenciler tarafından tasarlanabilir (aşağıya bakınız).

  1. Astar konumlarının belirlenmesi
    1. UCSC Genom Tarayıcısını (http://genome.ucsc.edu/) açın, çalışmanın organizmasını seçin ve 3C kullanılarak değerlendirilecek genomun bölgesini arayın.
    2. Bir sonraki pencerede, Restr Enzimleri'ne tıklayarak tarayıcının altındaki Haritalama ve Sıralama sekmesindeki enzim izini etkinleştirin.
    3. Kullanılacak kısıtlama enzimini (enzimlerini) girin ve görüntüleme modunu paketle olarak ayarlayın. Gönder'e tıklayın.
    4. Varyasyon ve Tekrarlar'da, RepeatMasker'ın yoğun olarak ayarlandığından emin olun.
    5. Kısıtlama sitelerini kılavuz olarak kullanarak, maskelenmiş yinelenen bölgelerde (siyah çubuklar) bulunmayan ilgi çekici siteleri belirleyin. Konuma (en üstteki parça) tıklayarak ve istenen uzunluğa (~600 bp) sürükleyerek kısıtlama bölgesini çevreleyen hem yukarı hem de aşağı akış sırasını çevreleyen 300 temel çifti (bp) vurgulayın.
    6. Fareyi bıraktığınızda bir açılır kutu görünecektir. Genomik konumu not alın, Yakınlaştır'a tıklayın ve tarayıcının seçime yeniden uyum sağlamasına izin verin.
    7. Fareyi üst tarayıcı şeridindeki Görünüm sekmesinin üzerine getirin ve açılır menüden DNA'yı seçin.
    8. Varsayılan seçeneği bırakın, maskelenmiş dizilerin atanmasına dikkat edin (bunları N'ler yapmak için bir seçenek vardır). DNA al'a tıklayın.
    9. Vurgulanan sıra daha sonra pencerede görüntülenecektir. Bu sırayı kopyalayıp Primer3'e (https://primer3.ut.ee/) yapıştırın.
    10. Primer3 varsayılan ayarlarını kullanarak, Astarları seç'e tıklayarak astarlar oluşturun.
    11. Sonuçlarda, kısıtlama enziminin yerini not alın ve ortada bulunan kısıtlama bölgesi ile 200-500 bp PCR ürünü oluşturan primerleri seçin.
    12. Bu adımları izleyerek, ilgili site(ler)den 1 kilobase (kb), 2 kb, 5 kb, 10 kb ve 20 kb tasarım testi primerleri alın.
    13. Giriş denetimi astarlarını tasarlamak için, bu adımları, kısıtlama sitesi olmayan, yani hiçbir zaman kesilmeyen, ilgilenilen siteden 1-2 kB uzaklıktaki bir site için tekrarlayın.
  2. İşlevsel astar doğrulaması
    1. Primer işlevselliğini doğrulamak için, titre primer konsantrasyonları ve saflaştırılmış genomik DNA kullanarak PCR reaksiyonları ayarlayın. Kantitatif veya yarı kantitatif araçlarla, primerlerin beklenen ürünü oluşturup oluşturmadığını belirleyin.
    2. Doğrulamada başarısız olan astarları yeniden tasarlayın.

2. Gün 1

NOT: Protokol, kromatin çapraz bağlanmasından sonra ve çekirdek toplanmasından sonra duraklatılabilir (-20 °C'de dondurulabilir). Adımlar, lisans öğrencileri ile ortalama 5-6 saat sürer.

  1. Genç-yetişkin (YA) C. elegans çekirdekleri koleksiyonu (Han et al.29'dan uyarlanmıştır)
    1. Kromatin çapraz bağlama
      1. 50 mL'lik bir konik tüpte 30 mL M9 ortamında 5.000 YA solucanı toplayın ve oda sıcaklığında (RT) 2 dakika boyunca 400 × g'da döndürün.
      2. Bakterileri temizlemek için solucan peletini M9 ile 3 kat daha fazla yıkayın.
      3. Süpernatanı çıkarın, solucan peletini 2.7 mL% 37 formaldehit (% 2 nihai) içeren 47.3 mL M9'da yeniden askıya alın ve RT'de 30 dakika boyunca ajitasyon (sallanma veya besleyicilik) ile inkübe edin.
        DİKKAT: Formaldehiti dikkatli kullanın ve uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla (KKD laboratuvar önlüğü, uygun eldivenler ve göz koruması) duman davlumbazının altında çalışın. Formaldehit, gözleri, burnu, boğazı ve akciğerleri etkileyen tahriş edici bir maddedir.
      4. Solucanları RT'de 2 dakika boyunca 400 × g'da döndürün.
      5. Süpernatanı çıkarın ve solucan peletini 50 mL 1 M glisin içinde yeniden askıya alın. Solucanları RT'de 2 dakika boyunca 400 × g'da döndürün.
    2. Çekirdek koleksiyonu
      1. Solucan peletini 6 mL soğutulmuş NP tamponunda (pH 7,5'te 50 mM HEPES, 40 mM NaCl, 90 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, %0,1 Tween 20, 0,2 mM DTT, 0,5 mM spermidin, 0,25 mM spermin, 1x tam proteaz inhibitörü) yeniden askıya alın.
      2. Sonsuz süspansiyonu buz üzerinde 7 mL'lik gevşek bir Sıçramaya aktarın. Numuneyi 15x zıplayın ve 5 dakika boyunca buz üzerinde tutun.
      3. Sonsuz süspansiyonu buz üzerinde 7 mL'lik sıkı oturan bir Sıçramaya aktarın. Numuneyi 20x zıplayın ve 5 dakika boyunca buz üzerinde tutun.
      4. Sonsuz süspansiyonu temiz bir 15 mL konik tüpe aktarın ve NP tamponunu toplamda 10 mL'ye (yaklaşık 4 mL) ekleyin.
      5. Solucan süspansiyonunu 30 s boyunca yüksek bir ayarda vorteks. Numuneyi buz üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin.
      6. Önceki adımı yineleyin.
      7. Sonsuz süspansiyonu 100 × g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca döndürün.
      8. Süpernatantı taze bir 15 mL konik tüpe aktarın.
      9. Numunede solucan kalıntıları olup olmadığını kontrol edin. Numunenin 10 μL'sini ışık mikroskobu ile görselleştirin. Solucan kalıntıları varsa, numuneyi 4 °C'de 5 dakika boyunca 2.000 × g'da döndürün, peleti taze 10 mL NP tamponunda yeniden askıya alın ve numuneyi 4 ° C'de 5 dakika boyunca 100 × g'da tekrar döndürün. Peletleri atın, süpernatantı solucan kalıntıları açısından kontrol edin ve numune solucan kalıntılarından arındırılana kadar tekrarlayın.
        NOT: Alternatif olarak, solucan kalıntıları, numuneyi 40 μm'lik bir hücre süzgecinden (6x) ve ardından 20 μm'lik bir hücre süzgecinden (6x) süzerek de giderilebilir.
      10. Numune solucan kalıntılarından arındırılmışsa, numunenin 5 μL'sini alın, 5 μL metil yeşil pironin ekleyin (çekirdekler mavi olacaktır) ve çekirdekleri bir hemositometre ile sayın.
      11. Numuneyi 4 °C'de 5 dakika boyunca 2.000 × g'da döndürün
      12. Süpernatanı çıkarın, örnekleri buzun üzerine yerleştirin ve devam edin; alternatif olarak, çekirdekleri tutturun ve -80 ° C'de saklayın.
  2. Kromatin sindirimi
    1. Çekirdekleri 450 μL temiz suda tekrar askıya alın. Çekirdekleri temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    2. Çapraz bağlı numuneye, 60 μL 10x DpnII kısıtlama enzim tamponu ekleyin ve iyice karıştırın.
      NOT: Çapraz bağlı DNA'yı hala kesen diğer kısıtlama enzimleri kullanılabilir.
    3. Çekirdekleri geçirgenleştirmek için 15 μL% 10 sodyum dodesil sülfat (SDS) ekleyin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de ajitasyon (sallanma veya nutlama) ile inkübe edin.
      DİKKAT: SDS tahriş edicidir ve cilt yoluyla yutulursa veya emilirse toksiktir. Dikkatli kullanın ve uygun KKD'yi (laboratuvar önlüğü, uygun eldivenler ve göz koruması) kullanın.
    4. SDS'yi 75 μL% 20 Triton X-100 ekleyerek ve 1 saat boyunca 37 ° C'de çalkalama ile inkübe ederek söndürün.
    5. Numuneden sindirilmemiş bir kontrol olarak 10 μL alın. 4 °C'de saklayın.
    6. 400 U DpnII ekleyin ve gece boyunca ajitasyonla 37 ° C'de inkübe edin.

3. Gün 2

NOT: Ortalama olarak, lisans öğrencilerinin bu adımları tamamlamaları 5 saat sürer.

  1. Kromatin sindirimi
    1. Ek bir 200 U DpnII ekleyin ve çapraz bağlı numunenin tamamen sindirilmesini sağlamak için numuneleri 37 ° C'de ajitasyonla 4 saat boyunca inkübe edin.
    2. Sindirim kontrolü olarak numunelerden 10 μL'lik bir aliquot alın.
    3. Numuneyi 65 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe ederek (veya üreticinin talimatlarına göre) kısıtlama enzimini ısıl olarak inaktive edin. Adım 2.1.3'e geçin.
    4. Enzim ısı ile inaktive edilemezse, 80 μL% 10 SDS ekleyin ve numuneyi 65 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, 375 μL% 20 Triton X-100 ekleyin ve dönerek karıştırın. Numuneyi 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin ve adım 2.2'ye devam edin.
  2. Kromatin ligasyonu
    1. Numuneyi temiz bir 50 mL konik tüpe aktarın, numune hacmini moleküler sınıfH2O ile 5,7 mL'ye ayarlayın ve dönerek karıştırın.
    2. 700 μL 10x T4 Ligaz tamponu ekleyin ve dönerek karıştırın.
    3. 60 U T4 DNA Ligaz ekleyin ve dönerek karıştırın.
    4. Gece boyunca 16 ° C'de inkübe edin.

4. Gün 3

NOT: Ortalama olarak, lisans öğrencilerinin bu adımları tamamlamaları 15-30 dakika sürer. Gece inkübasyonundan sonra, numuneler dondurulabilir.

  1. Protein sindirimi ve ters çapraz bağlama
    1. 3C numunesine 30 μL proteinaz K (10 mg / mL) ekleyin ve gece boyunca 65 ° C'de çalkalama ile inkübe edin. Sindirilmemiş ve sindirim kontrolüne 5 μL proteinaz K (10 mg / mL) ekleyin ve gece boyunca 65 ° C'de ajitasyonla inkübe edin.

5. Gün 4

NOT: Ortalama olarak, lisans öğrencilerinin bu adımları tamamlamaları 4-5 saat sürer.

  1. 3C kütüphanesinin saflaştırılması
    1. 3C numuneye 30 μL RNaz A (10 mg/mL) ekleyin ve karıştırmak için girdap yapın. Numuneyi 37 ° C'de 45 dakika boyunca inkübe edin.
    2. Numuneye 7 mL fenol-kloroform ekleyin ve çalkalayarak karıştırın.
      DİKKAT: Fenol-kloroform cilt ve göz tahriş edicidir ve temas tedavi edilmezse yanıklara neden olabilir. Fenol-kloroform, uygun göz koruması ve eldivenlere (nitril) sahip bir duman davlumbazında kullanılmalıdır.
    3. Numuneyi RT'de 3.270 × g'da 15 dakika boyunca santrifüj edin. sulu fazı toplayın ve temiz bir 50 mL konik tüpe aktarın. Eşit miktarda kloroform ekleyin ve numuneyi çalkalayarak karıştırın.
    4. Numuneyi RT'de 3.270 × g'da 15 dakika boyunca santrifüj edin. sulu fazı toplayın ve temiz bir 50 mL konik tüpe aktarın. 7.5 mL moleküler sınıfH2O, 35 mL% 100 etanol ve (isteğe bağlı) 7 μL glikojen (1 mg / mL) ekleyin. Çalkalayarak karıştırın ve numune donana kadar -80 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Numunenin donması 1 saat veya daha fazla sürebilir. Protokol burada duraklatılabilir.
      1. 3C numunesi donarken, kontrol numunelerini saflaştırın. Kontrol numunelerine, moleküler dereceli su kullanarak ses seviyesini 500 μL'ye ayarlayın ve tüpü hareket ettirerek 2 μL RNase A (10 mg / mL) karışımı ekleyin.
      2. Numuneyi tüpün dibinde toplamak için kısaca döndürün. Numuneleri 37 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edin.
      3. Kontrol numunelerine 1 mL fenol-kloroform ekleyin ve tüpleri çalkalayarak karıştırın. Numuneyi RT'de 3.270 × g'da 15 dakika boyunca santrifüj edin. kontrollerin sulu fazını toplayın ve temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
      4. Eşit miktarda kloroform ekleyin ve numuneyi çalkalayarak karıştırın. Numuneyi RT'de 3.270 × g'da 15 dakika boyunca santrifüj edin. kontrollerin sulu fazını toplayın ve temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
      5. 1 mL% 100 etanol ve 2 μL glikojen (1 mg / mL) ekleyin. Çalkalayarak karıştırın ve 30 dakika boyunca -80 ° C'de inkübe edin.
      6. Numuneyi 4 °C'de 3.270 × g'da 15 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı çıkarın ve 750 μL soğutulmuş% 70 etanol ekleyin.
      7. Numuneyi 4 °C'de 3.270 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı çıkarın ve numuneleri havayla kurutun. Peletleri 50 μL moleküler dereceliH2O. Dondurucuda tekrar askıya alın veya adım 6'ya devam edin.
    5. Numuneyi 4 °C'de 3.270 × g'da 60 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı çıkarın ve 10 mL soğutulmuş% 70 etanol ekleyin. Karıştırmak için numuneyi sallayarak DNA peletini bozun ve parçalayın.
    6. Numuneyi 4 °C'de 3.270 × g'da 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve numunenin RT'de kısmen hava ile kurumasına izin verin. pelet yukarı ve aşağı pipetleme yaparak 10 mM Tris-HCl'nin 150 μL'sinde (pH 7.5) tekrar askıya alın. Bu "3C Kütüphanesi"dir.
      NOT: Numuneyi dondurun veya analize devam edin.

6. Gün 5

NOT: Ortalama olarak, lisans öğrencilerinin bu adımları tamamlamaları 1-2 saat sürer.

  1. Kontrol astarının standart eğrisini kullanarak numune kalitesinin belirlenmesi
    1. Tüm kontrollerin yanı sıra 3C numunesi için DNA konsantrasyonunu ölçün ve numuneleri 30 μg / μL'ye ayarlayın (konsantrasyonlar izin veriyorsa). Seri olarak seyreltilen numuneler dört kez iki kat seyreltilir ve her numune için beş seyreltme ile sonuçlanır (1x, 0.5x, 0.25x, 0.125x, 0.0625x).
      NOT: Miktar belirleme kolayca yapılamıyorsa, numuneleri yukarıda belirtildiği gibi seri olarak seyreltin ve devam edin.
    2. Kontrol primerleri ile seyreltilmiş her numune için 3C, genomik kontrol ve sindirilmiş kontrol için PCR reaksiyonları ayarlayın: 1 μL DNA, 10 μL 5x reaksiyon tamponu, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 mM kontrol primeri (ileri ve geri karışık), 1 μL Taq polimeraz ve 36 μL su.
    3. PCR makinesine özgü yazılımın talimatlarını izleyerek, döngü koşullarını kullanarak standart eğri PCR programını aşağıdaki gibi ayarlayın: 98 ° C'de 30 sn; 98 °C'de 5 s, 60 °C'de 5 s ve 72 °C'de 10 s'lik 30 döngü; 72 °C'de 1 dakika; 4 °C tutma.
    4. Yazılımı kullanarak, numuneler için standart eğriler oluşturun. Yazılım eğriyi oluşturduktan sonra, PCR verimliliğini ve R2 değerini not alın.
  2. DNA konsantrasyonunun belirlenmesi
    1. 3C örneklerinin DNA konsantrasyonunu belirlemek için, örnekleri bilinen konsantrasyondaki genomik bir DNA örneğiyle karşılaştırın. Numuneleri 30 ng/μL'ye kadar seyreltin ve standart bir eğri oluşturmak için genomik kontrolü 10 ng/μL'den 0,01 ng/μL'ye kadar iki katlı adımlarla seri olarak seyreltin.
      NOT: Miktar belirleme kolayca yapılamıyorsa, numuneyi 1:10 oranında seyreltin ve devam edin.
    2. Kontrol primerleri ile seyreltilmiş her numune için 3C, genomik kontrol ve sindirilmiş kontrol için PCR reaksiyonlarını ayarlayın: 1 μL DNA, 10 μL 5x reaksiyon tamponu, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 mM kontrol primeri (ileri ve geri karışık), 1 μL Taq polimeraz ve 36 μL su.
    3. PCR makinesine özgü yazılımın talimatlarını izleyerek, döngü koşullarını kullanarak standart eğri PCR programını aşağıdaki gibi ayarlayın: 98 ° C'de 30 sn; 98 °C'de 5 s, 60 °C'de 5 s ve 72 °C'de 10 s'lik 30 döngü; 72 °C'de 1 dakika; 4 °C tutma.
    4. Yazılımı kullanarak, 3C örneklerini eğri üzerinde çizerek numuneler için standart eğriler oluşturun. 3C numune bolluğunun konumunu, bilinen konsantrasyondaki genomik DNA'nın reaksiyonları tarafından oluşturulan standart eğri ile karşılaştırın ve 3C örneklerini 30 ng / μL'ye ayarlayın.
  3. Kromatin etkileşiminin varlığının veya yokluğunun belirlenmesi
    1. 30 ng 3C numunesi, genomik kontrol numunesi ve sindirilmiş kontrol numunesi ile qPCR reaksiyonlarını ayarlayın: 1 μL DNA, 10 μL 5x reaksiyon tamponu, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 mM primer (ileri ve geri karışık), 1 μL Taq polimeraz ve 36 μL su.
      NOT: Reaksiyonlar, kontrol primeri, bireysel genomik lokuslar için test primerleri ve kromatin etkileşimini belirlemek için kullanılan test primerlerinin istenen kombinasyonları ("a" bölgesi ileri ve "b" ters) kullanılarak ayarlanmalıdır (Şekil 3).
    2. PCR makinesinin yazılımı için talimatları izleyerek, PCR programını aşağıdaki gibi ayarlayın: 98 ° C'de 30 sn; 98 °C'de 5 s, 60 °C'de 5 s ve 72 °C'de 10 s'lik 40 döngü; 72 °C'de 1 dakika; 4 °C tutma.
    3. PCR çalıştırıldıktan sonra, amplifikasyon grafiğini inceleyin. PCR reaksiyonlarının üstel amplifikasyon gösterdiğinden ve her döngüyü iki katına çıkardığından emin olun.
      NOT: Üstel amplifikasyon göstermeyen reaksiyonlar daha fazla analiz edilemez.
    4. PCR makinesinin yazılımı için talimatları izleyerek, qPCR deneyinin eşiğini tanımlayın.
    5. Tüm örnekler için Ct değerlerini dışa aktarın.
    6. Denklem (1)'i kullanarak sindirilmemiş kontrol (UC) ve sindirilmiş kontrol (DC) numunelerinden test primeri (TP) ve kontrol primeri (CP) Ct değerlerini kullanarak çürütme verimliliğini belirleyin.
      Sindirilen yüzde = 100 - Equation 1 (1)
    7. Bu değerler% 80 -% 90 sindirim aralığında olmalıdır. Bu değerleri kaydedin (Şekil 4A).
    8. Test primer kombinasyonunu (TPC) ve kontrol primeri (CP) Ct değerlerini kullanarak sindirilmemiş kontrol (UC) ve denklem (2) kullanarak 3C (3C) örneklerinden bağıl kromatin etkileşimini belirleyin.
      Kromatin etkileşimi = 100 - Equation 2 (2)
    9. Her numunenin değerlerini, her test primeri kombinasyonu için bir çubuk grafikte çizin.
    10. 3C numunesinin kontrol numuneleri üzerinde belirli bir kromatin etkileşiminin zenginleşip zenginleştirilmediğini belirlemek için 3C numunelerinin sinyalini kontrol numuneleriyle karşılaştırın. Kontrol üzerinde zenginleştirme gösteren 3C numuneleri koşullu olarak pozitif olarak kabul edilebilir ve Sanger dizilemesi kullanılarak doğrulama gerektirir (Şekil 4B).
      NOT: Grafik verilerini analiz ederken, bir "kontrol şablonu" kullanılmadıkça (tartışmaya bakınız), reaksiyonlar arasındaki bolluğun (yani, bir primer kümesinden diğerine) karşılaştırılamayacağını hatırlamak önemlidir.
  4. 3C ürünlerinin tanımlanması
    1. PCR ürünlerini% 1.5'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın.
    2. Bir UV ışık kutusu veya jel dokümantasyon sistemi kullanarak jeli PCR ürünlerinin doğru boyutu için görselleştirin.
      NOT: İyi yapılandırılmış 3C kütüphaneleri çok çeşitli DNA fragmanları içerecektir ve primerlerin özgüllük için daha önce doğrulanmasına rağmen, 3C kütüphanelerinden gelen PCR reaksiyonları birçok bant içerme potansiyeline sahiptir (Şekil 5A). Bu, 3C kütüphanelerinin analizini engellemez.
    3. Beklenen parça boyutuna karşılık gelen ürün bantlarını tüketim ve ticari bir kitin veya aşağıda özetlenen ev yapımı protokolün talimatlarını izleyerek PCR ürünlerinin jel ekstraksiyonunu gerçekleştirin.
      DİKKAT: UV ışığı bilinen bir kanserojendir ve UV ışığına maruz kalma süresini sınırlamak için büyük özen gösterilmelidir. UV'ye dayanıklı göz koruması, örnek kalkanı, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyilmelidir.
      1. Ev yapımı bir arıtma kartuşu oluşturmak için, 0,5 mL'lik bir tüpün dibine bir iğne ile bir delik açın.
      2. Bir pamuk topundan az miktarda pamuğu 0,5 mL'lik tüpün dibine koyun ve tüpün yarısından fazlasını doldurmayın.
      3. 0,5 mL'lik tüpü 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin; Küçük tüpün tüpün içinde değil, daha büyük tüpün dudağına dayandığından emin olun.
      4. Bir jel parçasını dikkatlice daha küçük parçalara ayırın ve kartuşun 0,5 mL tüpüne yerleştirin.
      5. Tertibatı 5 dakika boyunca -20 ° C'lik bir dondurucuya yerleştirin. Montajı RT'de 13.000 × g'da 3 dakika döndürün.
      6. Ekstrakte edilen DNA ile 1.5 mL tüpü tamponda tutun ve agaroz kalıntılarını içeren 0.5 mL tüpü atın.
      7. Saflaştırılmış DNA, 3C fragmanı için ileri ve geri primerler kullanılarak Sanger dizilimi için gönderilebilir.
    4. Blat kullanarak kromatin kontaklarının tanımlanması
      1. Sıralamanın tamamlanmasının ardından, numunelerin sıralama raporunda belirtildiği gibi kalite kontrol standartlarını karşılayıp karşılamadığını belirleyin.
      2. QC'yi geçen diziler için, .seq ve .ab1 (trace) dosyalarını Başka Bir Plazmid Düzenleyicisi (ApE) gibi bir sıralama düzenleme programında açın, .ab1 dosyasında net temel çağrı tepe noktaları olup olmadığını inceleyin ve .seq dosyasında yanlış çağrılan tepe noktalarını düzenleyin.
      3. Düzenlenen .seq dosyasını kullanarak DpnII sitesini arayın. Dizi sonucuna bağlı olarak, bu rapor edilen dizinin yarısına kadar olmalıdır.
      4. Dizinin beklenen hedef dizi olup olmadığını belirlemek için, DpnII bölgesini ve 3C için test edilen genomik lokusların ileri astarına karşılık gelen yukarı akış dizisinin ek 30-50 bp'sini vurgulayın. Hedef türlere karşı bu sekansın Blat aramasını yapın. Genomik lokusların astarınkilerle eşleştiğinden emin olun.
      5. Ters primer dizisi için yukarıdaki adımı tekrarlayın, geri dönen genomik lokusun ters primerinkiyle eşleştiğinden emin olun.

Representative Results

Bu prosedür bir deneysel 3C numunesi ve iki kontrol numunesi (sindirilmemiş ve sindirilmiş) üretecektir. Bu üç örnek kullanılarak qPCR yapıldı. Bu sonuçlardan sindirim verimliliği hesaplanmış (denklem 1) ve kaydedilmiştir (Tablo 1). Bu hesaplamalardan, 3C örneğinin test edilen yedi genomik lokus boyunca yaklaşık% 88'lik bir sindirim verimliliğine (Tablo 1'in ortalaması) sahip olduğu belirlenmiştir.

Daha sonra, numuneler, lokuslara özgü primerlerin (Tablo 2) ve qPCR kombinasyonları kullanılarak farklı genomik lokuslar arasında uzun menzilli kromatin temaslarının varlığı açısından test edildi. Bu sonuçlar kullanılarak, bir kontrol primer setine göre ürün bollukları hesaplandı (denklem 2) ve karşılaştırma için grafiklendirildi (Şekil 4). Bu veriler, 10 reaksiyondan 8'inin uzun menzilli etkileşimler için koşullu pozitif olduğunu göstermiştir.

PCR reaksiyonları daha sonra bir agaroz jeli üzerinde çalıştırıldı. Sekiz koşullu pozitif ve bir negatif reaksiyon için beklenen PCR ürünü jel saflaştırıldı ve Sanger dizilemesi için gönderildi. Temsili pozitif (mavi ok, mavi kutu) ve negatif (kırmızı ok, kırmızı kutu) reaksiyonların sonuçları gösterilmiştir (Şekil 5).

Figure 1
Şekil 1: Çekirdekteki kromozom yapısı. Çekirdeğin içindeki varsayımsal kromozom organizasyonu. (A) Nükleer zarf, siyah çizgiler; (B) nükleer lamina, turuncu; (C) heterokromatin, sıkıştırılmış hatlar; (D) ökromatin, gevşek halkalar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: 3C protokolünün şeması. Doğrusal kromozomların uzak kısımları (mavi, sarı ve pembe), düzenleyici döngüler yoluyla çekirdek içinde birbirine yaklaştırılır. (A) Döngü yapılarına transkripsiyon faktörleri (gri daire ve siyah yıldız) aracılık eder; Bu etkileşimler kimyasal çapraz bağlama yoluyla korunur. (B) Döngüler enzimatik sindirim yoluyla kırılır (siyah çizgiler). (C) Uzak kromatin parçaları, sindirim tarafından oluşturulan yapışkan uçlardan birbirine bağlanır. (D) DNA proteinden saflaştırılır. (E) Fragmanlar içindeki sekans tanımlanır ve genoma geri eşlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Resim 3: 3C astar şeması. 3C primerler, ilgilenilen genomik konumdan farklı mesafelerde kısıtlama bölgeleri etrafında tasarlanmıştır. Pembe oklar, bir DpnII bölgesini çevreleyen deneysel astar setlerini temsil eder. Deneysel primerler, bölgedeki kromatin döngüsünü değerlendirmek için karıştırılabilir ve eşleştirilebilir. Turuncu astarlar, DpnII bölgesi olmayan negatif bir kontrolü temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Bir 3C deneyi için temsili qPCR verileri. 3C test astarı setlerinin göreceli bolluğu. (A) Sindirilmemiş kontroldeki (mavi), sindirilmiş kontroldeki (gri) ve 3C numunesindeki (turuncu) ürünün nispi bolluğunu gösteren kontrol grafiği. (B) 3C deneyi; Sindirilmemiş kontrol (mavi), sindirilmiş kontrol (gri) ve 3C numunesindeki (turuncu) test primerlerinin kombinasyonlarından ürünün nispi bolluğu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: 3C qPCR ürünlerinin görselleştirilmesi. Üstte, jel ile qPCR uç nokta ürünleri ile örnekler belirtilir. Altta, belirtilen reaksiyonlar için temsili Sanger dizisi izleme dosyaları. Turuncu numune yanlış pozitifin bir örneğidir (bkz. Şekil 4, r38/34) ve mavi numune, izlemenin üzerinde belirtilen DpnII bölgesi ile gerçek bir pozitif örneğidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Site % sindirim
r8 86.98
r3 88.44
r38 89.64
R34 87.55
r33 87.85
R14 86.97
R47 89.45

Tablo 1: Hesaplanan sindirim verimliliği.

Ad Sıra Genomik lokuslar
r3 FWD ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC chrX:11361475
r3 RVS TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC chrX:11361561
r38 FWD TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC chrX:5859700
r38 RVS AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG chrX:5859775
r34 FWD ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG chrX:5429702
r34 RVS AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC chrX:5429777
r33 FWD AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC chrX:6296704
r33 RVS TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG chrX:6296807
r14 FWD AATTATCGATTTTTCCATCGGCAG chrX:8036367
r14 RVS ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTC chrX:8036427
r47 FWD ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC chrX:9464939
r47 RVS AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC chrX:9465064
r8 FWD GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG chrX:11094257
r8 RVS TTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACC chrX:11094362
Kontrol astarı FWD CAATCGTCTCGCTCACTTGTC chrX:7608049
Kontrol astarı RVS GATGTGAGCAACAAGGCACC chrX:7608166

Tablo 2: Temsili 3C deneyi için astarlar.

Discussion

3C, temel moleküler tekniklere dayanan güçlü bir tekniktir. 3C'yi lisans öğrencileriyle kullanmak için bu kadar ilgi çekici bir teknik haline getiren temel araçların bu temelidir. Kromatin dinamiklerini bu kadar geniş bir ölçekte gözlemleyen pek çok yeni çalışma ile, bu sonuçları tek bir gen veya genomik bölge üzerinde dar odaklı bir deney tasarlamak için kullanmak, lisans araştırmalarında benzersiz ve etkili bir deney yaratma potansiyeline sahiptir. Çoğu zaman, bu gibi deneyler lisans öğrencileri için çok gelişmiş olarak kabul edilir, ancak dikkatli bir planlama ile kolayca elde edilebilirler. 3C kütüphanesi tarafından yakalanan kromatin bağlantılarını araştırmak için tasarlanan testlerin, yarı kantitatif son nokta PCR'den tüm genom dizilemesine kadar değişebileceğini belirtmek önemlidir. Aslında, ilk 3C makalesi16'dan elde edilen veriler qPCR'den üretildi. Bu geniş tahlil yelpazesinin hepsi kullanılabilir, çünkü tüm 3C teknolojileri aynı ürünü üretir - çekirdekteki 3D bağlantıları temsil eden DNA fragmanlarının bir kütüphanesi.

Burada sunulan, lisans araştırmacıları için daha uygun olan daha esnek ve uzlaşmacı bir protokolün uyarlanmasıdır. Yukarıda listelenen duraklama süreleri, gece boyunca gecikmeler anlamına gelir; Bununla birlikte, bu duraklamalar hafta sonları ve hücreler ve çekirdekler söz konusu olduğunda haftalarca uzayabilir. En önemli husus, işin ne zaman yapılacağıdır. Genellikle protokollerde, duraklatmanın bir seçenek olmadığı zaman zamana duyarlı adımlar vardır. Birkaç noktanın dışında (1. gün ve 2. gün), numuneyi durdurmak ve dondurmak için birçok yer vardır. Bunlar, laboratuvar çalışmalarının programlarının ve zamanlamalarının esnek olması gereken lisans öğrencileriyle çalışırken kritik öneme sahiptir. Bu durakların protokole dahil edilmesine ek olarak, lisans öğrencileri çiftler halinde veya hatta üç veya dört kişilik küçük gruplar halinde çalışmaya teşvik edilir. Gruplar bu protokol için iyi çalışır, çünkü öğrenciler birbirlerini destekleyebilir ve herkesin güvenli bir şekilde çalışması için bir arkadaş sistemi oluşturabilirler. Laboratuar çalışmaları da dahil olan diğer kişilerle daha eğlencelidir. Gruplarla, öğrenciler aynı protokolü uygularken kromatin organizasyonuna odaklanan çeşitli sorular üzerinde de çalışabilirler. Böylece, öğrenciler ayrı projeler üzerinde çalışırken bile, protokol çabalarını birbirine bağlar ve bu nedenle birbirlerini destekleyebilirler.

Diğer uyarlamalar, belirli özel araç ve gereçlerin tüm lisans kurumlarında mutlaka bulunmadığı gerçeğinin etrafında çalışmak içindir. Bu ekipman parçaları arasında qPCR termosikler, jel dokümantasyon sistemleri ve nano hacim spektrometreleri bulunur ancak bunlarla sınırlı değildir. Gerçekten de, bu ekipman parçaları uygundur, ancak bir gereklilik değildir. Burada, klasik 3C yöntemi astar tasarım bölümünde de açıklanmaktadır; Bu, ilgilenilen bir genomik lokusun tanımlanmasını ve bundan sonra, daha uzaktaki kromatin temas noktaları için diğer genomik lokusların değerlendirilmesini içerir. Bu teknik, bilinen pozitif (bağlanan) ve negatif (bağlanmayan) lokusların tanımlandığı Hi-C kullanan bir veri kümesi gibi yayımlanmış bir veri kümesi kullanıldığında da iyi çalışır. Bu yayınlanmış veri setlerini kullanarak deneyler tasarlamak, öğretim laboratuvarları için bir başka harika uyarlamadır, çünkü kromatin bağlantılarının başarılı bir şekilde tanımlanması için şans genellikle daha yüksektir. Ayrıca araştırma makalesi sınıfta tartışılabilir ve referans olarak kullanılabilir.

Bu protokol, 3C ürün oluşumunu görselleştirmek için değiştirilmiş bir qPCR yaklaşımı kullanır. Kontroller, 3C tekniğinin başarısı için çok önemlidir. Her deney, 3C prosedürünün tamamlandığını belirlemek için hem numune kontrollerini hem de astar kontrollerini kullanır. Numune kontrolleri sindirilmemiş bir kontrol (genomik DNA) ve sindirilmiş kontrolü içerir. Sindirilmemiş kontrol, astar setleri için taban çizgisi sinyalini belirler ve sindirim verimliliğini belirlemek için çapraz bağlı çürütme kontrolü ile birlikte kullanılır Bir kısıtlama bölgesine yönlendirilen herhangi bir astar için üründe bir düşüş olması beklenir. Bu değerin sindirilmemiş kontrolle karşılaştırılması, numunenin ne kadar iyi sindirildiğinin bir göstergesidir.

PCR için primerler bir kontrol astarı ve test primerleri içerir. Kontrol primeri, test edilen genomik bölgeye yakın olan ve bir kısıtlama bölgesi içermeyen bir primer setidir. Bu, test primer PCR ürünlerinin bolluğunu belirlemek için temel sağlar. Test primerleri, ilgilenilen belirli bir genomik lokus için bir kısıtlama bölgesini çevreleyen ileri ve geri primerlerdir (Şekil 3). Bu astar setlerini kullanan reaksiyonlar, sindirim verimliliğini belirlemek için karşılaştırılır, çünkü kısıtlama bölgesi kesilirse ürün bolluğu düşmelidir. Kromatin organizasyonunu belirlerken, bir lokustan bir test primeri, bu iki lokusun 3D uzayda birbirine yakın olup olmadığını belirlemek için farklı bir genomik lokustan başka bir test primeri ile eşleştirilir. Bu durumda, beklenti, bir PCR ürününün yalnızca şablon olarak 3C örneği kullanılarak bulunmasıdır.

Doğrulanmış astarların bile başarısız olma eğiliminde olduğuna dikkat etmek önemlidir (Şekil 4: r14 astar seti). Ek olarak, PCR ürünleri sıklıkla kontrol reaksiyonlarında ve kromatin bağlantısının tahmin edilmediği reaksiyonlarda (bağlanmadığı için sindirilmiş kontrol gibi) tanımlanır. Bu örnekler sıralanır ve Sanger QC'de başarısız olur veya tanımlanmış bir dizi olmadan geri döner (Şekil 5). Ek olarak, geleneksel 3C deneyleri, belirli miktarda DNA ile üretilebilecek tüm olası bağlı parçaları temsil eden, çapraz bağlanmamış, sindirilmiş ve bağlanmış bir DNA örneği olan bir "kontrol şablonu" oluşturur. "Kontrol şablonu", sinyalin gerçek bir etkileşimi mi yoksa sadece rastgele bir ilişkiyi mi temsil ettiğini belirlemek için iki genomik lokus arasındaki qPCR sinyallerinin yoğunluklarını karşılaştırmada önemli bir rol oynar. Bir "kontrol şablonu" oluşturmak sorunlu olabilir, çünkü test edilen kromatinin büyük bir kısmı yapay bir kromozom şeklinde yakalanmalı ve 3C örnekleri ile birlikte işlenmelidir. Böyle bir yapının güvence altına alınması mümkün olmayabilir ve bir tane oluşturmak bir dönem projesinin kapsamı dışında olabilir. Bu zorluklar nedeniyle, bir kontrol astarı kullanmanızı öneririz. Kontrol astarı, "kontrol şablonunun" tüm işlevlerinin yerini almaz, ancak yine de "mevcudiyet" veya "yokluk" belirlemeleri yapmak için verileri analiz etme fırsatı sunar.

qPCR yaparken, numunenin eşit miktarda kullanılması önemlidir. Bu, nanodamla gibi bir nano-spektrofotometre kullanılsa bile, bilinen bir konsantrasyonun genomik DNA'sından standart bir eğri oluşturarak ve 3C örneklerini bu çizgiye uydurarak belirlenmelidir. Bu miktarlar kaydedilmeli ve sonraki PCR'lerde kullanılmalıdır. PCR reaksiyonunun kalitesi de önemlidir. PCR qPCR'de çalıştığından, ürün bolluğu floresan kullanılarak ölçülür ve kaydedilir. Bu kayda amplifikasyon grafiğinden erişilebilir. Program bittiğinde, amplifikasyon grafiğini kontrol etmek ve reaksiyonların (şablon kontrolleri hariç) üç aşamaya sahip olduğundan emin olmak önemlidir: bir taban çizgisi, bir üstel ve bir plato / doygunluk aşaması. Reaksiyonların, özellikle eşiği ayarlamak için üstel bir faza sahip olup olmadığını kontrol etmek önemlidir (aşağıya bakınız). Ek olarak, seri olarak seyreltilmiş numuneler için, numunenin seyreltilmesi ile tutarlı Ct değerlerinde bir kayma olmalıdır (en yüksek konsantrasyon en düşük Ct değerlerine sahipken, en düşük konsantrasyon en yüksek Ct değerlerine sahip olacaktır). Amplifikasyon grafiğindeki bu değişikliği yansıtmayan numuneler yeni bir seyreltme gerektirir veya 3C numune oluşumu ile ilgili daha büyük bir soruna işaret eder. Son olarak, standart eğriyi oluştururken, PCR yazılımı PCR verimliliğini ve R2 değerini hesaplayacaktır. PCR etkinliği% 90'dan büyük olmalı ve R2 değeri 0.99'dan büyük olmalıdır. Bu koşullardan herhangi biri karşılanmazsa, numunede veya PCR primerlerinde bir sorun olması muhtemeldir.

qPCR sonrası, sindirim yüzdesi ve 3C etkileşimlerinin varlığı, her reaksiyon için qPCR Ct kullanılarak hesaplanabilir. Bunları belirlemek için öncelikle PCR reaksiyonunun eşiği belirlenmelidir. Bu normalde qPCR makinesiyle birlikte gelen yazılım kullanılarak yapılır. Eşiğin ayarlanması, numune Ct değerlerini karşılaştırmak için kullanılacak PCR ürününün konsantrasyonunu tanımlayacaktır. Eşik, amplifikasyonun üstel fazındaki PCR reaksiyonlarının amplifikasyon eğrilerini ikiye bölmelidir. Sadece üstel amplifikasyonlu PCR reaksiyonları karşılaştırılabilir (bu durumda, kontrol primerleri ve test primer reaksiyonları), çünkü reaksiyonların DNA'yı aynı oranda yükseltmesini sağlamanın tek yolu budur ve sadık bir şekilde karşılaştırılabilir. 3C grafiklerini analiz ederken, şartlı olarak pozitif reaksiyonlar, kontrol numuneleri, genomik kontrol ve sindirim kontrolü üzerinde daha fazla ürüne sahip olanlar olarak tanımlanır (Şekil 4B). Bununla birlikte, bu numuneler, PCR ürününün jel saflaştırılmasını takiben Sanger dizilimi kullanılarak daha da doğrulanmalıdır.

Sanger dizilemesinden sonra, QC'yi geçen örnekler Blat kullanılarak analiz edilebilir. Bu analizin amacı, numunenin kısıtlama bölgesini çevreleyen her iki hedef genomik lokusun dizisine sahip olup olmadığını belirlemektir (bu protokol durumunda DpnII). Her iki dizi de tanımlanırsa, 3C parçası doğrulanmış olarak kabul edilebilir. Blat'ın sonuçları beklenen sırayı döndürmezse, bu, primerlerden birinin veya her ikisinin de optimal olmadığını ve yanlış pozitif qPCR sonucuna neden olduğunu gösterebilir. Yanlış pozitif örnekler için izleme dosyaları tanımlanmamış temel tepe noktalarına sahip olacak ve Seq raporları çoğunlukla "n" temel çağrıları içerecektir.

Yapay PCR ürün oluşumundan kaynaklanan yanlış pozitifler mümkün olduğu için sanger doğrulaması esastır. Bu yanlış pozitifler, sıralama ürünleri beklenen hedef diziye veya uygun bir 3C parçasının DpnII bölgesi karakteristiğine sahip olmadığında tanımlanabilir (Şekil 5). PCR fragmanlarının dizilimi ayrıca deney için başka bir veri noktası sağlar ve öğrencilere 3C tekniğinin çekirdekler içindeki 3D uzayda bir araya gelen uzak genomik lokusları tanımladığını gösterir.

3C tekniği, lisans öğrencileri için esnek ve basit bir prosedürde zengin bir temel moleküler teknik sağlar. Bu 3C tekniği aynı zamanda yeni nesil dizilemeyi (NGS) içeren diğer 3C teknikleri için de bir başlangıç noktasıdır. Bu tür deneyler, lisans öğrencilerini biyoinformatiğin önemli yönlerine maruz bırakabilir ve burada özetlenen temel ilkelere dayanır. Lisans deneyimi ve katılımı, genç bilim adamları olarak başarılarının ve gelişimlerinin anahtarıdır. Bu fırsatları sağlayarak, lisans öğrencileri temel ilkeler hakkındaki anlayışlarını güçlendirirken, en yeni teknikler ve sorularla başa çıkmak için güvenlerini artırabilirler.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu çalışma kısmen, P20GM103430 hibe numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden Rhode Island Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA) Biyomedikal Araştırma Mükemmellik Ağı ve Bryant Sağlık ve Davranış Bilimleri Merkezi tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% Formaldehyde  Millapore-Sigma F8775
100% Ethanol Millapore-Sigma E7023
CaCl2 MP Biomedical 215350280
chloroform Millapore-Sigma C0549
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Millapore-Sigma COEDTAF-RO mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh
Dithiothreitol (DTT) Millapore-Sigma D0632 1 M stock diluted to 500 µM in Sucrose buffer and GB buffer fresh
DpnII NEB R0543M
Glycerol Millapore-Sigma G9012
glycine Millapore-Sigma G8898
glycogen Millapore-Sigma 10901393001
HEPES Millapore-Sigma H3375
KCl Millapore-Sigma P3911
KH2PO4 Millapore-Sigma P5655
methyl green pyronin   Millapore-Sigma HT70116
MgAc2 Thermoscientific 1222530
Na2HPO4 Millapore-Sigma S5136
NaCl Millapore-Sigma S9888
phenol-chloroform  Millapore-Sigma P3803
Pronase Millapore-Sigma 11459643001
Proteinase K IBI Scientific IB05406
qPCR Ready mix (Phire Taq etc) Millapore-Sigma KCQS07
RNase A  Millapore-Sigma R6148
Sodium Acetate Millapore-Sigma S2889
sodium dodecyl sulfate (SDS) Millapore-Sigma L3771
Sucrose Millapore-Sigma S0389
T4 DNA Ligase Promega M1804
Tris-HCl Millapore-Sigma 108319
Triton X-100 Millapore-Sigma T9284
Trypsin-EDTA  Millapore-Sigma T4049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C. Chromatin architectural proteins. Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).
  2. Nalabothula, N., et al. The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation. BMC Genomics. 15, 92 (2014).
  3. John, S., et al. Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns. Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).
  4. Fawcett, D. W. On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates. The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).
  5. Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina. Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).
  6. Finlan, L. E., et al. Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells. PLoS Genetics. 4 (3), e1000039 (2008).
  7. Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development. Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).
  8. Chambeyron, S., Bickmore, W. A. Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription. Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).
  9. Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories. The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).
  10. Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH. The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).
  11. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The role of chromatin during transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  12. Chen, A., Chen, D., Chen, Y. Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals. Gene. 667, 83-94 (2018).
  13. Hughes, A. L., Rando, O. J. Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo. Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).
  14. Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging. Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).
  15. Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern. Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).
  16. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  17. van Berkum, N. L., Dekker, J. Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology. Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).
  18. Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus. American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).
  19. Crane, E. E. Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2. University of California, Berkeley. , PhD thesis (2012).
  20. Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell. 98 (3), 387-396 (1999).
  21. Cuadrado, A., et al. Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells. Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).
  22. Sarro, R., et al. Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development. Development. 145 (7), (2018).
  23. Tolhuis, B., et al. Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture. PLoS Genetics. 7 (3), e1001343 (2011).
  24. Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
  25. Fernández-Miñán, A., Bessa, J., Tena, J. J., Gómez-Skarmeta, J. L. Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish. Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).
  26. Dekker, J. The three "C" s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).
  27. Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).
  28. Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies. Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).
  29. Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression. BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).

Tags

Genetik Sayı 195
3C'lerle A Almak: Lisans Öğrencileri için Kromozom Konformasyon Yakalama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Joniec, A., Leszczynski, J., Ndoye,… More

Joniec, A., Leszczynski, J., Ndoye, S., Sylvia, J., Weicksel, S. E. Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates. J. Vis. Exp. (195), e65213, doi:10.3791/65213 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter