Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Få et A med 3C'erne: Kromosom Conformation Capture for studerende

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65213
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, 1,2
1Department of Biological and Biomedical Sciences, Bryant University, 2Center of Health and Behavioral Sciences, Bryant University
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi en tilpasning af kromosomkonformationsfangstteknikken (3C) i detaljer med vægt på bachelorinddragelse og læring.

Abstract

Kromosom konformation capture (3C) er et kraftfuldt værktøj, der har skabt en familie af lignende teknikker (fx Hi-C, 4C og 5C, her benævnt 3C teknikker), der giver detaljerede oplysninger om den tredimensionelle organisation af kromatin. 3C-teknikkerne er blevet brugt i en lang række undersøgelser, fra overvågning af ændringer i kromatinorganisation i kræftceller til identifikation af forstærkerkontakter foretaget med genpromotorer. Mens mange af de undersøgelser, der bruger disse teknikker, stiller store genom-dækkende spørgsmål med indviklede prøvetyper (dvs. enkeltcelleanalyse), er det, der ofte går tabt, at 3C-teknikkerne er baseret på grundlæggende molekylærbiologiske metoder, der kan anvendes til en bred vifte af undersøgelser. Ved at behandle tæt fokuserede spørgsmål om kromatinorganisation kan denne banebrydende teknik bruges til at forbedre bachelorforsknings- og undervisningslaboratorieoplevelsen. Dette papir præsenterer en 3C-protokol og giver tilpasninger og fokuspunkter til implementering på primært bachelorinstitutioner i bachelorforskning og undervisningserfaringer.

Introduction

En organismes genom indeholder ikke kun alle de gener, der kræves for funktion, men også alle instruktioner om, hvordan og hvornår de skal bruges. Dette gør regulering af adgangen til genomet til en af cellens vigtigste funktioner. Der er mange mekanismer til at kontrollere genfunktionen; På sit basisniveau kommer genregulering imidlertid ned til regulatoriske transkriptionsfaktorers evne (transfaktorer) til at binde til deres specifikke DNA-sekvenser (cis-regulerende sekvenser). Dette er ikke en medfødt evne; I stedet styres det af organisationen / strukturen af genomet i kernen, som styrer tilgængeligheden / eksponeringen af de cis-regulerende sekvenser for transfaktorerne 1,2,3. Hvis transfaktorerne ikke kan finde deres cis-regulerende sekvenser, kan transfaktorerne ikke udføre deres regulatoriske opgaver. Dette har gjort forståelsen af, hvordan genomer er organiseret i kernen, til en vigtig kilde til undersøgelse.

Det er almindeligt accepteret, at eukaryote kromosomer i kernen under interfase optager deres eget domæne forankret til den nukleare lamina og nukleare matrix (figur 1), hvilket gør kromosomet mere som et stykke pizza snarere end en nudel på en tallerken spaghetti. Kromosomer kondenseres delvist af protein-DNA-interaktioner (kromatin), der vrider og sløjfer dele af kromosomet. Gennem elektronmikroskopi, tredimensionel DNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) og DNA-mærkningsteknikker (dvs. fluorescerende og kunstig DNA-methylering) har inaktive kromatindomæner vist sig at være pakket tæt langs den nukleare periferi 4,5,6, mens dele af aktivt, mindre kondenseret kromatin findes i det indre af kernen 7,8,9, 10. Disse eksperimenter giver et vidvinkelbillede af kromosomdynamikken, men gør lidt for at fange de ændringer, der forekommer lokalt omkring genpromotorerne observeret i DNase11,12 og nukleosom13,14,15 undersøgelser.

Nøglen til at låse op for kromatindynamik med højere opløsning var formuleringen af 3D-kromosomkortlægningsteknikken, 3C. Selve 3C-teknikken består af fire hovedtrin: tværbinding af kromatin, kromatinfordøjelse ved restriktionsenzymer, kromatinligering og DNA-oprensning (figur 2). De nye kunstige DNA-fragmenter, der genereres ved denne proces, kan derefter karakteriseres for at afsløre den tætte fysiske sammenhæng mellem lineært fjerne stykker DNA16. 3C-teknikken blev grundlaget for oprettelsen af flere spin-off-teknikker, der udnytter de indledende trin i 3C til at stille bredere genom-dækkende spørgsmål (f.eks. Hi-C, 4C, ChIP-C). Denne familie af 3C-teknikker har identificeret, at kromosomer er organiseret i flere diskrete enheder kaldet topologisk associerede domæner (TAD'er). TAD'er er kodet i genomet og defineres af kromatinsløjfer flankeret af ikke-loopede grænser16,17,18,19. TAD-grænserne opretholdes af to evolutionært bevarede og allestedsnærværende faktorer, herunder CCCT-bindingsfaktor (CTCF) og kohæsion, som forhindrer sløjfer inden for separate TAD'er i at interagere16,20. Sløjferne formidles af transfaktorernes interaktion med deres regulatoriske sekvenser samt CTCF og samhørighed21.

Selvom mange undersøgelser, der bruger 3C-teknologier, stiller brede genom-dækkende spørgsmål og anvender komplicerede prøveindsamlingsteknikker, er formuleringen af 3C-teknikken baseret på grundlæggende molekylærbiologiske teknikker. Dette gør 3C spændende til implementering i både bachelorforskning og undervisningslaboratorier. 3C-teknikken kan anvendes til mindre fokuserede spørgsmål og er i sagens natur fleksibel til at skalere op eller ned (enkeltgener22, kromosomer16 og / eller genomer18) afhængigt af fokus og retning af de stillede spørgsmål. Denne teknik er også blevet anvendt på en bred vifte af modelsystemer 7,16,19,23 og har vist sig at være alsidig i brugen. Dette gør 3C til en fremragende teknik for studerende, idet eleverne kan få erfaring med almindelige molekylærbiologiske teknikker, samtidig med at de får værdifuld erfaring med at besvare rettede spørgsmål.

Her præsenteres en tilpasset protokol til 3C-biblioteksforberedelse baseret på tidligere offentliggjorte protokoller24,25,26,27. Denne protokol er optimeret til ca. 1 × 107 celler, selvom den har genereret 3C-biblioteker med så lidt som 1 × 105 celler. Denne protokol har vist sig at være alsidig og er blevet brugt til at generere 3C-biblioteker fra zebrafiskembryoner, zebrafiskcellelinjer og ung-voksen (YA) Caenorhabditis elegans (rundorm). Protokollen bør også være hensigtsmæssig for cellelinjer hos pattedyr og, med yderligere tilpasning, gær.

Målet med disse tilpasninger er at gøre 3C mere tilgængelig for studerende. Der er sørget for at bruge teknikker, der ligner dem, der kan opnås i et bachelorundervisningslaboratorium. 3C-teknikken giver mange læringsmuligheder for studerende at lære grundlæggende molekylærbiologiske teknikker, der vil gavne deres udvikling på bænken, i klasseværelset og i deres bestræbelser efter eksamen.

Protocol

1. Primer design

BEMÆRK: 3C-primerdesignværktøjerne er tilgængelige online28. Alternativt kan brugerdefinerede primere designes af eleverne (se nedenfor).

  1. Identifikation af primerplaceringer
    1. Åbn UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/), vælg undersøgelsesorganismen, og søg i det område af genomet, der skal vurderes ved hjælp af 3C.
    2. I det næste vindue skal du aktivere enzymsporet i fanen Kortlægning og sekventering under browseren ved at klikke på Restr Enzymes.
    3. Indtast de(t) restriktionsenzym(er), der skal anvendes, og indstil visningstilstanden til pakning. Klik på Send.
    4. I Variation og gentagelser skal du sørge for, at RepeatMasker er indstillet til tæt.
    5. Brug begrænsningswebstederne som vejledninger til at identificere interesseområder, der ikke er inden for de maskerede gentagne regioner (sorte bjælker). Fremhæv 300 basepar (bp), der flankerer både opstrøms- og nedstrømssekvensen omkring begrænsningsstedet ved at klikke på positionen (øverste spor) og trække til den ønskede længde (~ 600 bp).
    6. Slip musen, og en pop op-boks vises. Vær opmærksom på den genomiske placering, klik på Zoom ind, og lad browseren justere sig til valget.
    7. Hold musen over fanen Vis på det øverste browserbånd, og vælg DNA i rullemenuen.
    8. Forlad standardindstillingen, bemærk betegnelsen for maskerede sekvenser (der er mulighed for at gøre dem N'er). Klik på get DNA.
    9. Den fremhævede sekvens vises derefter i vinduet. Kopier og indsæt denne sekvens i Primer3 (https://primer3.ut.ee/).
    10. Brug standardindstillingerne for Primer3 til at generere primere ved at klikke på Plukprimere.
    11. I resultaterne skal du notere placeringen af restriktionsenzymet og vælge primere, der skaber et 200-500 bp PCR-produkt med restriktionsstedet placeret i midten.
    12. Følg disse trin, design test primere 1 kilobase (kb), 2 kb, 5 kb, 10 kb og 20 kb fra det eller de relevante steder.
    13. For at designe inputkontrolgrunderne skal du gentage disse trin for et sted 1-2 KB fra det interessante sted, der mangler et begrænsningssted, hvilket betyder, at det aldrig skæres.
  2. Funktionel primervalidering
    1. For at validere primerfunktionaliteten skal du oprette PCR-reaktioner ved hjælp af titrerede primerkoncentrationer og renset genomisk DNA. Enten gennem kvantitative eller semikvantitative midler skal du afgøre, om primerne skaber det forventede produkt.
    2. Redesign primere, der ikke valideres.

2. Dag 1

BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause (fryses ved -20 °C) efter kromatintværbinding og efter kerneopsamlingen. Trinene tager i gennemsnit 5-6 timer med studerende.

  1. Young-adult (YA) C. elegans nuclei collection (tilpasset fra Han et al.29)
    1. Chromatin tværbinding
      1. Opsaml 5.000 YA-orme i 30 ml M9-medium i et 50 ml konisk rør, og drej ved 400 × g i 2 minutter ved stuetemperatur (RT).
      2. Vask ormepillen 3x mere med M9 for at fjerne bakterier.
      3. Supernatanten fjernes, ormepillen resuspenderes i 47,3 ml M9 indeholdende 2,7 ml 37% formaldehyd (2% endelig), og der inkuberes under omrystning (vuggende eller nøgen) i 30 minutter ved RT.
        FORSIGTIG: Håndter formaldehyd med forsigtighed, og arbejd under en stinkhætte med korrekt personligt beskyttelsesudstyr (PPE-lab coat, korrekte handsker og øjenbeskyttelse). Formaldehyd er et irriterende middel, der påvirker øjne, næse, hals og lunger.
      4. Drej ormene ved 400 × g i 2 minutter ved RT.
      5. Supernatanten fjernes, og ormepillen resuspenderes i 50 ml 1 M glycin. Drej ormene ved 400 × g i 2 minutter ved RT.
    2. Nuclei samling
      1. Resuspender ormepillen i 6 ml kølet NP-buffer (50 mM HEPES ved pH 7,5, 40 mM NaCl, 90 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1% Tween 20, 0,2 mM DTT, 0,5 mM spermidin, 0,25 mM spermin, 1x komplet proteasehæmmer).
      2. Overfør ormeophænget til en 7 ml løstsiddende Dounce på is. Dounce prøven 15x, og hold på is i 5 min.
      3. Overfør ormeophænget til en 7 ml tætsiddende Dounce på is. Dounce prøven 20x, og hold på is i 5 min.
      4. Overfør ormesuspensionen til et rent 15 ml konisk rør, og tilsæt NP-buffer til 10 ml i alt (ca. 4 ml).
      5. Vortex ormophænget på en høj indstilling i 30 s. Prøven inkuberes på is i 5 min.
      6. Gentag det forrige trin.
      7. Centrifuger ormsuspensionen ved 100 × g i 5 minutter ved 4 °C.
      8. Supernatanten overføres til et friskt konisk rør på 15 ml.
      9. Kontroller prøven for ormrester. Visualiser 10 μL af prøven med et lysmikroskop. Hvis der er ormrester til stede, drejes prøven ved 2.000 × g i 5 minutter ved 4 °C, pelletpen resuspenderes i en frisk 10 ml NP-buffer og centrifugeres prøven igen ved 100 × g i 5 minutter ved 4 °C. Pelletsen kasseres, supernatanten kontrolleres for ormerester, og gentages, indtil prøven er fri for ormerester.
        BEMÆRK: Alternativt kan ormeresterne også fjernes ved at sile prøven gennem en 40 μm cellesi (6x) efterfulgt af en 20 μm cellesi (6x).
      10. Hvis prøven er fri for ormrester, skal du tage 5 μL af prøven, tilsæt 5 μL methylgrøn pyronin (kernerne vil være blå) og tæl kernerne med et hæmocytometer.
      11. Centrifuger prøven ved 2.000 × g i 5 minutter ved 4 °C
      12. Supernatanten fjernes, prøverne lægges på is og fortsættes. alternativt kan du snapfryse kernerne og opbevare dem ved -80 °C.
  2. Kromatin fordøjelse
    1. Resuspender kernerne i 450 μL rent vand. Overfør kernerne til et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    2. Til den tværbundne prøve tilsættes 60 μL 10x DpnII-restriktionsenzymbuffer og blandes godt.
      BEMÆRK: Andre restriktionsenzymer, der stadig skærer tværbundet DNA, kan anvendes.
    3. Der tilsættes 15 μL 10% natriumdodecylsulfat (SDS) for at permeabilisere kernerne, og der inkuberes under omrøring (vuggende eller nøgende) ved 37 °C i 1 time.
      FORSIGTIG: SDS er irriterende og giftigt, hvis det indtages eller absorberes gennem huden. Håndter forsigtigt, og brug korrekt PPE (laboratoriefrakke, korrekte handsker og øjenbeskyttelse).
    4. SDS slukkes ved at tilsætte 75 μL 20% Triton X-100 og inkuberes med omrøring ved 37 °C i 1 time.
    5. Der udtages 10 μL fra prøven som en ufordøjet kontrol. Opbevares ved 4 °C.
    6. Der tilsættes 400 U DpnII, og der inkuberes ved 37 °C natten over under omrystning.

3. Dag 2

BEMÆRK: I gennemsnit tager det studerende 5 time(r) at gennemføre disse trin.

  1. Kromatin fordøjelse
    1. Der tilsættes yderligere 200 U DpnII, og prøverne inkuberes i 4 timer ved 37 °C under omrøring for at sikre fuldstændig fordøjelse af den tværbundne prøve.
    2. Der udtages en 10 μL delprøve fra prøverne som fordøjelseskontrol.
    3. Restriktionsenzymet varmeinaktiveres ved at inkubere prøven i 20 minutter ved 65 °C (eller efter producentens anvisninger). Fortsæt til trin 2.1.3.
    4. Hvis enzymet ikke kan inaktiveres ved varme, tilsættes 80 μL 10% SDS, og prøven inkuberes i 30 minutter ved 65 °C. Derefter tilsættes 375 μL 20% Triton X-100, og blandes ved hvirvling. Prøven inkuberes i 1 time ved 37 °C, og fortsæt til trin 2.2.
  2. Kromatinligering
    1. Overfør prøven til et rent 50 ml konisk rør, juster prøvevolumenet til 5,7 ml med molekylær H2O, og bland ved hvirvling.
    2. Tilsæt 700 μL 10x T4 ligasebuffer, og bland ved hvirvlende.
    3. Tilsæt 60 U T4 DNA-ligase, og bland ved hvirvlende.
    4. Der inkuberes natten over ved 16 °C.

4. Dag 3

BEMÆRK: I gennemsnit tager det studerende 15-30 minutter at gennemføre disse trin. Efter inkubationen natten over kan prøverne fryses.

  1. Proteinfordøjelse og omvendt tværbinding
    1. Der tilsættes 30 μL proteinase K (10 mg/ml) til 3C-prøven, og der inkuberes ved 65 °C natten over under omrystning. Der tilsættes 5 μL proteinase K (10 mg/ml) til den ufordøjede kontrol og fordøjelseskontrollen, og der inkuberes ved 65 °C natten over under omrystning.

5. Dag 4

BEMÆRK: I gennemsnit tager det studerende 4-5 timer at gennemføre disse trin.

  1. Oprensning af 3C-biblioteket
    1. Der tilsættes 30 μL RNase A (10 mg/ml) til 3C-prøven, og hvirvlen hvirvles rundt for at blande. Prøven inkuberes i 45 minutter ved 37 °C.
    2. Der tilsættes 7 ml phenolchloroform til prøven, og blandingen blandes under omrystning.
      FORSIGTIG: Phenol-chloroform er hud- og øjenirriterende og kan forårsage forbrændinger, hvis kontakt ikke behandles. Phenol-chloroform bør anvendes i en stinkhætte med korrekt øjenbeskyttelse og handsker (nitril).
    3. Prøven centrifugeres i 15 minutter ved 3.270 × g ved RT. Den vandige fase opsamles, og den overføres til et rent 50 ml konisk rør. Tilsæt lige store mængder chloroform, og bland prøven ved omrystning.
    4. Prøven centrifugeres i 15 minutter ved 3.270 × g ved RT. Den vandige fase opsamles, og den overføres til et rent 50 ml konisk rør. Tilsæt 7,5 ml molekylær H2O, 35 ml 100% ethanol og (valgfrit) 7 μL glykogen (1 mg / ml). Bland ved omrystning, og inkuber ved -80 °C, indtil prøven er frosset.
      BEMÆRK: Det kan tage 1 time eller mere for prøven at fryse. Protokollen kan sættes på pause her.
      1. Mens 3C-prøven fryser, renses kontrolprøverne. Til kontrolprøverne justeres volumenet til 500 μL ved hjælp af molekylært vand, og der tilsættes 2 μL RNase A (10 mg/ml) blanding ved at svirpe med glasset.
      2. Drej kort for at samle prøven i bunden af røret. Prøverne inkuberes i 45 minutter ved 37 °C.
      3. Til kontrolprøverne tilsættes 1 ml phenolchloroform, og blandes ved at ryste glassene. Centrifuger prøven i 15 minutter ved 3.270 × g ved RT. Den vandige fase af kontrollerne opsamles, og den anbringes i et rent 1,5 ml mikrocentrifugeglas.
      4. Tilsæt lige store mængder chloroform, og bland prøven ved omrystning. Centrifuger prøven i 15 minutter ved 3.270 × g ved RT. Den vandige fase af kontrollerne opsamles, og anbringes i et rent 1,5 ml mikrocentrifugeglas.
      5. Tilsæt 1 ml 100% ethanol og 2 μL glykogen (1 mg / ml). Bland ved omrystning og inkuber ved -80 °C i 30 minutter.
      6. Prøven centrifugeres i 15 minutter ved 3.270 × g ved 4 °C. Supernatanten fjernes, og der tilsættes 750 μl afkølet 70% ethanol.
      7. Prøven centrifugeres i 10 minutter ved 3.270 × g ved 4 °C. Supernatanten fjernes, og prøverne lufttørres. Pellet resuspenderes i 50 μL molekylær klasseH2O. Fryses, eller fortsæt til trin 6.
    5. Prøven centrifugeres i 60 minutter ved 3.270 × g ved 4 °C. Supernatanten fjernes, og der tilsættes 10 ml afkølet 70% ethanol. Afbryd og bryd DNA-pelleten op ved at ryste prøven for at blande.
    6. Prøven centrifugeres i 30 minutter ved 3.270 × g ved 4 °C. Supernatanten fjernes, og prøven lufttørres delvist ved RT. Pelletpen resuspenderes i 150 μL 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) ved pipettering op og ned. Dette er "3C-biblioteket."
      BEMÆRK: Frys prøven, eller fortsæt til analysen.

6. Dag 5

BEMÆRK: I gennemsnit tager det studerende 1-2 timer at gennemføre disse trin.

  1. Bestemmelse af prøvekvaliteten ved hjælp af kontrolprimerens standardkurve
    1. Kvantificer DNA-koncentrationen for 3C-prøven samt alle kontrollerne, og juster prøverne til 30 μg/μL (hvis koncentrationerne tillader det). Serielt fordobles de fortyndede prøver fire gange, hvilket resulterer i fem fortyndinger for hver prøve (1x, 0,5x, 0,25x, 0,125x, 0,0625x).
      BEMÆRK: Hvis kvantificering ikke let kan udføres, fortyndes prøverne serielt som angivet ovenfor og fortsættes.
    2. Opsæt PCR-reaktioner for 3C, genomisk kontrol og fordøjet kontrol for hver fortyndet prøve med kontrolprimerne: 1 μL DNA, 10 μL 5x reaktionsbuffer, 1 μL 10 mM dNTP'er, 1 μL 10 mM kontrolprimer (fremad og omvendt blandet), 1 μL Taq-polymerase og 36 μL vand.
    3. Følg instruktionerne for den software, der er specifik for PCR-maskinen, og opsæt PCR-programmet med standardkurve ved hjælp af cykelbetingelser som følger: 30 s ved 98 °C; 30 cyklusser à 5 sek. ved 98 °C, 5 sek. ved 60 °C og 10 sek. ved 72 °C 1 min ved 72 °C; Hold på 4 °C.
    4. Brug softwaren til at generere standardkurverne for prøverne. Når softwaren har genereret kurven, skal du være opmærksom på PCR-effektiviteten ogR2-værdien .
  2. Bestemmelse af DNA-koncentrationen
    1. For at bestemme DNA-koncentrationen af 3C-prøverne skal du sammenligne prøverne med en genomisk DNA-prøve med kendt koncentration. Fortynd prøverne til 30 ng/μL, og fortynd den genomiske kontrol serielt fra 10 ng/μL til 0,01 ng/μL i to trin for at skabe en standardkurve.
      BEMÆRK: Hvis kvantificering ikke let kan udføres, fortyndes prøven 1:10 og fortsættes.
    2. Opsæt PCR-reaktionerne for 3C, genomisk kontrol og fordøjet kontrol for hver fortyndet prøve med kontrolprimerne: 1 μL DNA, 10 μL 5x reaktionsbuffer, 1 μL 10 mM dNTP'er, 1 μL 10 mM kontrolprimer (fremad og omvendt blandet), 1 μL Taq-polymerase og 36 μL vand.
    3. Følg instruktionerne for den software, der er specifik for PCR-maskinen, og opsæt PCR-programmet med standardkurve ved hjælp af cykelbetingelserne som følger: 30 s ved 98 °C; 30 cyklusser à 5 sek. ved 98 °C, 5 sek. ved 60 °C og 10 sek. ved 72 °C 1 min ved 72 °C; Hold på 4 °C.
    4. Brug softwaren til at generere standardkurverne for prøverne og plotte 3C-prøverne på kurven. Sammenlign placeringen af 3C-prøvemængden med standardkurven skabt af reaktionerne i det genomiske DNA med kendt koncentration, og juster 3C-prøverne til 30 ng / μL.
  3. Bestemmelse af tilstedeværelsen eller fraværet af kromatininteraktion
    1. Opsæt qPCR-reaktioner med 30 ng af 3C-prøven, genomisk kontrolprøve og fordøjet kontrolprøve: 1 μL DNA, 10 μL 5x reaktionsbuffer, 1 μL 10 mM dNTP'er, 1 μL 10 mM primer (fremad og omvendt blandet), 1 μL Taq-polymerase og 36 μL vand.
      BEMÆRK: Reaktionerne skal opstilles ved hjælp af kontrolprimeren, testprimerne for individuelle genomiske loci og ønskede kombinationer af testprimere (sted "a" fremad og sted "b" omvendt), der anvendes til at bestemme kromatininteraktionen (figur 3).
    2. Følg instruktionerne til PCR-maskinens software, opsæt PCR-programmet som følger: 30 s ved 98 °C; 40 cyklusser à 5 sek. ved 98 °C, 5 sek. ved 60 °C og 10 sek. ved 72 °C 1 min ved 72 °C; Hold på 4 °C.
    3. Når PCR er kørt, skal du inspicere forstærkningsplottet. Sørg for, at PCR-reaktionerne viser eksponentiel forstærkning og fordobler hver cyklus.
      BEMÆRK: Reaktioner, der ikke viser eksponentiel forstærkning, kan ikke analyseres yderligere.
    4. Følg instruktionerne til PCR-maskinens software, definer tærsklen for qPCR-eksperimentet.
    5. Eksporter Ct-værdierne for alle prøverne.
    6. Nedbrydningseffektiviteten bestemmes ved hjælp af testprimeren (TP) og kontrolprimerens (CP) Ct-værdier fra prøverne af ufordøjet kontrol (UC) og fordøjet kontrol (DC) ved hjælp af ligning (1).
      Procent fordøjet = 100 - Equation 1 (1)
    7. Disse værdier bør ligge i området 80% -90% fordøjelse. Registrer disse værdier (figur 4A).
    8. Den relative kromatininteraktion bestemmes ved hjælp af testprimerkombinationen (TPC) og kontrolprimerens (CP) Ct-værdier fra prøverne af ufordøjet kontrol (UC) og 3C (3C) ved hjælp af ligning (2).
      Kromatininteraktion = 100 - Equation 2 (2)
    9. Værdierne for hver prøve afbildes på et søjlediagram for hver kombination af grundgrunder.
    10. Signalet fra 3C-prøverne sammenlignes med kontrolprøverne for at bestemme, om 3C-prøven har berigelse af en bestemt kromatininteraktion over kontrolprøverne. 3C-prøver, der viser berigelse over kontrollen, kan betragtes som betinget positive og kræver validering ved hjælp af Sanger-sekventering (figur 4B).
      BEMÆRK: Når man analyserer grafdataene, er det vigtigt at huske, at medmindre der anvendes en "kontrolskabelon" (se diskussion), kan mængden mellem reaktioner (dvs. fra et sæt primere til det næste) ikke sammenlignes.
  4. Identifikation af 3C-produkterne
    1. Kør PCR-produkterne på en 1,5% agarosegel.
    2. Visualiser gelen til den korrekte størrelse af PCR-produkterne ved hjælp af en UV-lysboks eller geldokumentationssystem.
      BEMÆRK: Velkonstruerede 3C-biblioteker vil indeholde en bred vifte af DNA-fragmenter, og på trods af tidligere validering af primerne for specificitet har PCR-reaktioner fra 3C-biblioteker potentialet til at indeholde mange bånd (figur 5A). Dette forhindrer ikke analysen af 3C-bibliotekerne.
    3. Punktafgifter produktbåndene svarende til den forventede fragmentstørrelse, og udfør gelekstraktion af PCR-produkterne efter instruktionerne i et kommercielt sæt eller den hjemmelavede protokol, der er beskrevet nedenfor.
      FORSIGTIG: UV-lys er et kendt kræftfremkaldende stof, og der skal udvises stor omhu for at begrænse den tid, der udsættes for UV-lys. UV-resistent øjenbeskyttelse, et prøveskærm, handsker og en laboratoriefrakke skal bæres.
      1. For at konstruere en hjemmelavet rensepatron skal du stikke et hul i bunden af et 0,5 ml rør med en nål.
      2. Pak en lille mængde bomuld fra en bomuldskugle i bunden af 0,5 ml røret, og fyld ikke mere end halvdelen af røret.
      3. Anbring 0,5 ml røret i et 1,5 ml rør; Sørg for, at det mindre rør hviler på læben af det større rør, ikke i røret.
      4. Skær forsigtigt et gelfragment i mindre stykker, og læg det i patronens 0,5 ml rør.
      5. Anbring enheden i en -20 °C fryser i 5 min. Drej enheden i 3 min ved 13.000 × g ved RT.
      6. Hold 1,5 ml røret med det ekstraherede DNA i buffer, og bortskaf 0,5 ml røret indeholdende agaroseaffaldet.
      7. Oprenset DNA kan sendes til Sanger-sekventering ved hjælp af fremadgående og omvendte primere til 3C-fragmentet.
    4. Identifikation af kromatinkontakter ved hjælp af Blat
      1. Efter afslutningen af sekventeringen skal du afgøre, om prøverne opfylder kvalitetskontrolstandarderne som angivet i sekventeringsrapporten.
      2. For sekvenser, der passerer QC, skal du åbne .seq- og .ab1-filer (trace) i et sekventeringsredigeringsprogram såsom Another Plasmid Editor (ApE), inspicere .ab1-filen for klare basekaldstoppe og redigere de toppe, der fejlagtigt er kaldet i .seq-filen.
      3. Brug den redigerede .seq-fil til at søge efter DpnII-webstedet. Afhængigt af sekvensresultatet skal dette være halvvejs inde i den rapporterede sekvens.
      4. For at afgøre, om sekvensen er den forventede målsekvens, fremhæves DpnII-stedet og yderligere 30-50 bp af opstrømssekvensen svarende til den fremadgående primer for de genomiske loci, der er testet for 3C. Udfør en Blat-søgning af denne sekvens mod målarten. Sørg for, at de genomiske loci matcher primerens.
      5. Gentag trinnet ovenfor for den omvendte primersekvens, og sørg for, at det genomiske locus, der returneres, svarer til den omvendte primer.

Representative Results

Denne procedure vil producere en eksperimentel 3C-prøve og to kontrolprøver (ufordøjet og fordøjet). Ved anvendelse af disse tre prøver blev qPCR udført. Ud fra disse resultater blev fordøjelseseffektiviteten beregnet (ligning 1) og registreret (tabel 1). Fra disse beregninger blev det fastslået, at 3C-prøven havde en ca. 88% fordøjelseseffektivitet (gennemsnit af tabel 1) på tværs af de syv genomiske loci, der blev testet.

Derefter blev prøverne testet for tilstedeværelsen af langtrækkende kromatinkontakter mellem de forskellige genomiske loci ved hjælp af kombinationer af loci-specifikke primere (tabel 2) og qPCR. Ved hjælp af disse resultater blev produktmængderne i forhold til et kontrolprimersæt beregnet (ligning 2) og graferet til sammenligning (figur 4). Disse data indikerede, at 8 af de 10 reaktioner var betingede positive for langtrækkende interaktioner.

PCR-reaktionerne blev derefter kørt på en agarosegel. Det forventede PCR-produkt for de otte betingede positive og én negativ reaktion blev gelrenset og sendt til Sanger-sekventering. Resultaterne for repræsentative positive (blå pil, blå boks) og negative (rød pil, rød boks) reaktioner vises (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Kromosomstruktur i kernen. Hypotetisk kromosomorganisation inde i kernen. (A) Nuklear konvolut, sorte linjer; B) nuklear lamina, orange C) heterochromatin, komprimerede linjer D) euchromatin, løse sløjfer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Skematisk oversigt over 3C-protokollen. Fjerne dele af lineære kromosomer (blå, gul og pink) bringes tæt sammen i kernen gennem regulatoriske sløjfer. (A) Sløjfestrukturerne medieres af transkriptionsfaktorer (grå cirkel og sort stjerne); Disse interaktioner bevares gennem kemisk tværbinding. (B) Sløjferne brydes gennem enzymatisk fordøjelse (sorte linjer). (C) Fjerne kromatinstykker ligeres sammen gennem de klæbende ender, der skabes af fordøjelsen. D) DNA renses fra protein. E) Sekvensen i fragmenterne identificeres og kortlægges tilbage til genomet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: 3C-grundskemaet. 3C-primerne er designet omkring restriktionssteder i varierende afstande fra den genomiske placering af interesse. De lyserøde pile repræsenterer de eksperimentelle primersæt, der omgiver et DpnII-sted. De eksperimentelle primere kan blandes og matches for at vurdere kromatinsløjfe i regionen. De orange primere repræsenterer en negativ kontrol uden et DpnII-sted. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative qPCR-data for et 3C-eksperiment. Relativ overflod af 3C testprimersæt. (A) Kontrolgraf, der viser produktets relative tæthed i den ufordøjede kontrol (blå), fordøjet kontrol (grå) og 3C-prøve (orange). (B) 3C-eksperimentet; produktets relative forekomst fra kombinationer af testprimere i den ufordøjede kontrol (blå), fordøjede kontrol (grå) og 3C-prøve (orange). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Visualisering af 3C qPCR-produkterne. Top, gel med qPCR-slutpunktsprodukterne med de angivne prøver. Nederst, repræsentative Sanger-sekvenssporingsfiler for de angivne reaktioner. Den orange prøve er et eksempel på en falsk positiv (se figur 4, r38/34), og den blå prøve er et eksempel på en ægte positiv med DpnII-stedet angivet over sporet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Websted % fordøjelse
R8 86.98
R3 88.44
R38 89.64
R34 87.55
R33 87.85
R14 86.97
R47 89.45

Tabel 1: Beregnet nedbrydningseffektivitet.

Navn Sekvens Genomiske loci
r3 FWD ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC chrX:11361475
r3 autocampere TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTTTGC chrX:11361561
r38 FWD TTACTTCTGAAGTAATCTTTTTCTTATCCCC chrX:5859700
r38 autocampere AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG chrX:5859775
r34 FWD ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG chrX:5429702
r34 autocampere AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC chrX:5429777
r33 FWD AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC chrX:6296704
r33 autocampere TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG chrX:6296807
r14 FWD AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG chrX:8036367
r14 autocampere ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTC chrX:8036427
r47 FWD ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC chrX:9464939
r47 autocampere AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC chrX:9465064
r8 FWD GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG chrX:11094257
r8 RVS TTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACC chrX:11094362
Kontrol primer FWD CAATCGTCTCGCTCACTTGTC chrX:7608049
Kontrol primer RVS GATGTGAGCAACAAGGCACC chrX:7608166

Tabel 2: Primere til det repræsentative 3C-eksperiment.

Discussion

3C er en kraftfuld teknik, der er forankret i grundlæggende molekylære teknikker. Det er dette fundament af grundlæggende værktøjer, der gør 3C til en så spændende teknik at bruge med studerende. Med så mange nylige undersøgelser, der observerer kromatindynamik i så bred skala, har brugen af disse resultater til at udtænke et snævert fokuseret eksperiment på et enkelt gen eller genomisk region potentialet til at skabe et unikt og virkningsfuldt eksperiment inden for bachelorforskning. Ofte betragtes eksperimenter som disse som for avancerede til studerende, men med omhyggelig planlægning er de let opnåelige. Det er vigtigt at bemærke, at analyserne designet til at undersøge kromatinforbindelserne fanget af 3C-biblioteket kan variere fra semikvantitativ endepunkts-PCR til helgenomsekventering. Faktisk blev data fra det første 3C-papir16 genereret fra qPCR. Denne brede vifte af assays kan alle bruges, fordi alle 3C-teknologier producerer det samme produkt - et bibliotek af DNA-fragmenter, der repræsenterer 3D-forbindelser i kernen.

Præsenteret her er en tilpasning af en mere fleksibel og imødekommende protokol, der passer bedre til bachelorforskere. De pauseperioder, der er anført ovenfor, indebærer forsinkelser natten over; Disse pauser kan dog strække sig over weekender og i tilfælde af celler og kerner i uger. Den mest afgørende overvejelse er, hvornår arbejdet bliver gjort. Ofte i protokoller er der tidsfølsomme trin, når pause ikke er en mulighed. Uden for nogle få punkter (dag 1 og dag 2) er der mange steder at stoppe og fryse prøven. Disse er kritiske, når man arbejder med studerende, hvor tidsplanerne og timingerne for laboratoriearbejde skal være fleksible. Ud over at konstruere disse stop i protokollen, opfordres studerende til at arbejde parvis eller endda små grupper på tre eller fire. Grupper fungerer godt for denne protokol, da eleverne kan støtte hinanden og oprette et kammeratsystem, så alle arbejder sikkert. Laboratoriearbejde er også sjovere med andre involverede. Med grupper kan eleverne også arbejde på en række spørgsmål med fokus på organisering af kromatin, mens de stadig udfører den samme protokol. Selv mens eleverne arbejder på separate projekter, forbinder protokollen således deres indsats, og på grund af dette kan de støtte hinanden.

Andre tilpasninger er beregnet til at omgå det faktum, at visse specialiserede værktøjer og udstyr ikke nødvendigvis findes i alle bachelorinstitutioner. Disse stykker udstyr omfatter, men er ikke begrænset til, qPCR-termocyklister, geldokumentationssystemer og nanovolumenspektrometre. Faktisk er disse stykker udstyr praktisk, men er ikke et krav. Her beskrives den klassiske metode til 3C også i primerdesigndelen; Dette indebærer at identificere et genomisk sted af interesse og ud fra det vurdere andre genomiske loci for kromatinkontaktpunkter længere væk. Denne teknik fungerer også godt, hvis der bruges et publiceret datasæt, f.eks. et datasæt, der bruger Hi-C, hvor kendte positive (forbindende) og negative (ikke-forbindende) loci identificeres. Design af eksperimenter ved hjælp af disse offentliggjorte datasæt er en anden stor tilpasning til undervisningslaboratorier, da chancen for en vellykket identifikation af kromatinforbindelser normalt er større. Derudover kan forskningsartiklen diskuteres i klassen og bruges som reference.

Denne protokol bruger en modificeret qPCR-tilgang til at visualisere 3C-produktdannelsen. Kontrol er afgørende for 3C-teknikkens succes. Hvert eksperiment bruger både prøvekontroller og primerkontroller til at bestemme afslutningen af 3C-proceduren. Prøvekontrollerne omfatter en ufordøjet kontrol (genomisk DNA) og fordøjet kontrol. Den ufordøjede kontrol bestemmer basislinjesignalet for primersættene og bruges sammen med den tværbundne fordøjelseskontrol til at bestemme fordøjelseseffektiviteten Det forventes, at der vil være et fald i produktet for eventuelle primere, der er rettet over et restriktionssted. Sammenligning af denne værdi med den ufordøjede kontrol giver en indikation af, hvor godt prøven blev fordøjet.

Primere til PCR inkluderer en kontrolprimer og testprimere. Kontrolprimeren er et primersæt, der er nær det genomiske område, der analyseres, og indeholder ikke et restriktionssted. Dette giver basislinjen til bestemmelse af overflod af testprimerens PCR-produkter. Testprimere er fremadgående og omvendte primere, der flankerer et restriktionssted for et bestemt genomisk sted af interesse (figur 3). Reaktioner ved hjælp af disse primersæt sammenlignes for at bestemme fordøjelseseffektiviteten, da produktmængden skal falde, hvis begrænsningsstedet er blevet skåret. Ved bestemmelse af kromatinorganisationen parres en testprimer fra et locus med en anden testprimer fra et andet genomisk locus for at bestemme, om disse to loci er tæt på hinanden i 3D-rum. I så fald er forventningen, at et PCR-produkt kun findes ved hjælp af 3C-prøven som skabelon.

Det er vigtigt at bemærke, at selv validerede primere har tendens til at svigte (figur 4: r14 primersæt). Derudover identificeres PCR-produkter ofte i kontrolreaktioner og i reaktioner, hvor en kromatinforbindelse ikke forudsiges (såsom den fordøjede kontrol, da den ikke er ligeret). Disse forekomster sekventeres og mislykkes enten Sanger QC eller returnerer uden en defineret sekvens (figur 5). Derudover genererer traditionelle 3C-eksperimenter en "kontrolskabelon", en ikke-tværbundet, fordøjet og ligeret DNA-prøve, som repræsenterer alle mulige ligerede fragmenter, der kan produceres med en given mængde DNA. "Kontrolskabelonen" spiller en vigtig rolle i sammenligningen af intensiteterne af qPCR-signaler mellem to genomiske loci for at afgøre, om signalet repræsenterer en sand interaktion eller blot en tilfældig forening. Oprettelse af en "kontrolskabelon" kan være problematisk, da en stor del af kromatinet, der analyseres, skal fanges i form af et kunstigt kromosom og behandles sammen med 3C-prøverne. Sikring af en sådan konstruktion er muligvis ikke mulig, og oprettelse af en kan være uden for rammerne af et semesterprojekt. På grund af disse vanskeligheder foreslår vi at bruge en kontrolprimer. Kontrolprimeren erstatter ikke al funktionaliteten i "kontrolskabelonen", men giver stadig mulighed for at analysere dataene for at foretage "tilstedeværelse" eller "fravær" -bestemmelser.

Når du udfører qPCR, er det vigtigt at bruge lige store mængder af prøven. Dette bør bestemmes, selv om der anvendes et nanospektrofotometer, såsom et nanodrop, ved at generere en standardkurve fra genomisk DNA med en kendt koncentration og tilpasse 3C-prøverne til denne linje. Disse mængder bør registreres og anvendes i efterfølgende PCR'er. Kvaliteten af PCR-reaktionen er også vigtig. Da PCR kører i qPCR, måles produktmængden ved hjælp af fluorescens og registreres. Denne optagelse er tilgængelig i forstærkningsplottet. Når programmet er færdigt, er det vigtigt at kontrollere forstærkningsplottet og sikre, at reaktionerne (bortset fra kontrolelementerne uden skabelon) har tre faser: en basislinje, en eksponentiel og en plateau/mætningsfase. Det er vigtigt at kontrollere, at reaktionerne har en eksponentiel fase, især for fastsættelse af tærsklen (se nedenfor). For serielt fortyndede prøver bør der desuden ske et skift i Ct-værdier, der er i overensstemmelse med fortyndingen af prøven (den højeste koncentration vil have de laveste Ct-værdier, mens den laveste koncentration vil have de højeste Ct-værdier). Prøver, der ikke afspejler denne ændring i amplifikationsplottet, kræver en ny fortynding eller indikerer et større problem med 3C-prøvedannelsen. Endelig, mens standardkurven genereres, beregner PCR-softwaren PCR-effektiviteten ogR2-værdien . PCR-effektiviteten skal være større end 90%, ogR2-værdien skal være større end 0,99. Hvis en af disse betingelser ikke er opfyldt, er det sandsynligt, at der er noget galt med prøven eller PCR-primerne.

Post qPCR kan den procentvise fordøjelse og tilstedeværelsen af 3C-interaktioner beregnes ved hjælp af qPCR Ct for hver reaktion. For at bestemme disse skal tærsklen for PCR-reaktionen først indstilles. Dette gøres normalt ved hjælp af den software, der følger med qPCR-maskinen. Indstilling af tærsklen definerer koncentrationen af PCR-produkt, der vil blive brugt til at sammenligne prøvens Ct-værdier. Tærsklen bør gennemskære amplifikationskurverne for PCR-reaktionerne i amplifikationsfasens eksponentielle fase. Kun PCR-reaktioner med eksponentiel amplifikation kan sammenlignes (i dette tilfælde kontrolprimerne og testprimerreaktionerne), da dette er den eneste måde at sikre, at reaktionerne forstærker DNA med samme hastighed og kan sammenlignes trofast. Ved analyse af 3C-graferne identificeres betinget positive reaktioner som dem med mere produkt over kontrolprøverne, genomisk kontrol og fordøjelseskontrol (figur 4B). Disse prøver skal dog valideres yderligere ved hjælp af Sanger-sekventering efter gelrensning af PCR-produktet.

Efter Sanger-sekventering kan prøver, der passerer QC, analyseres ved hjælp af Blat. Målet med denne analyse er at bestemme, om prøven har sekvensen af begge målgenomiske loci, der flankerer restriktionsstedet (DpnII i tilfælde af denne protokol). Hvis begge sekvenser identificeres, kan 3C-fragmentet betragtes som valideret. Hvis resultaterne af Blat ikke returnerer den forventede sekvens, kan dette indikere, at en eller begge primere ikke er optimale, hvilket resulterer i et falsk positivt qPCR-resultat. Sporingsfilerne for de falsk positive prøver vil have udefinerede basetoppe, og Seq-rapporterne indeholder for det meste "n"-basiskald.

Sanger-validering er afgørende, da falske positiver fra kunstig PCR-produktdannelse er mulige. Disse falske positiver kan identificeres, når sekventeringsprodukterne ikke har den forventede målsekvens eller et DpnII-sted, der er karakteristisk for et korrekt 3C-fragment (figur 5). Sekventering af PCR-fragmenterne giver også et andet datapunkt for eksperimentet og viser eleverne, at 3C-teknikken identificerer fjerne genomiske loci, der kommer sammen i 3D-rum i kernerne.

3C-teknikken giver et væld af grundlæggende molekylære teknikker til studerende i en fleksibel, ligetil procedure. Denne 3C-teknik er også et udgangspunkt for de andre 3C-teknikker, der inkorporerer næste generations sekventering (NGS). Disse typer eksperimenter kan udsætte studerende for vigtige aspekter af bioinformatik og er forankret i de grundlæggende principper, der er skitseret her. Undergraduate erfaring og engagement er nøglen til deres succes og udvikling som unge forskere. Ved at give disse muligheder kan bachelorer styrke deres forståelse af grundlæggende principper, samtidig med at de opbygger deres tillid til at tackle banebrydende teknikker og spørgsmål.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence fra National Institute of General Medical Sciences ved National Institutes of Health under bevillingsnummer P20GM103430 og Bryant Center of Health and Behavioral Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% Formaldehyde  Millapore-Sigma F8775
100% Ethanol Millapore-Sigma E7023
CaCl2 MP Biomedical 215350280
chloroform Millapore-Sigma C0549
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Millapore-Sigma COEDTAF-RO mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh
Dithiothreitol (DTT) Millapore-Sigma D0632 1 M stock diluted to 500 µM in Sucrose buffer and GB buffer fresh
DpnII NEB R0543M
Glycerol Millapore-Sigma G9012
glycine Millapore-Sigma G8898
glycogen Millapore-Sigma 10901393001
HEPES Millapore-Sigma H3375
KCl Millapore-Sigma P3911
KH2PO4 Millapore-Sigma P5655
methyl green pyronin   Millapore-Sigma HT70116
MgAc2 Thermoscientific 1222530
Na2HPO4 Millapore-Sigma S5136
NaCl Millapore-Sigma S9888
phenol-chloroform  Millapore-Sigma P3803
Pronase Millapore-Sigma 11459643001
Proteinase K IBI Scientific IB05406
qPCR Ready mix (Phire Taq etc) Millapore-Sigma KCQS07
RNase A  Millapore-Sigma R6148
Sodium Acetate Millapore-Sigma S2889
sodium dodecyl sulfate (SDS) Millapore-Sigma L3771
Sucrose Millapore-Sigma S0389
T4 DNA Ligase Promega M1804
Tris-HCl Millapore-Sigma 108319
Triton X-100 Millapore-Sigma T9284
Trypsin-EDTA  Millapore-Sigma T4049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C. Chromatin architectural proteins. Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).
  2. Nalabothula, N., et al. The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation. BMC Genomics. 15, 92 (2014).
  3. John, S., et al. Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns. Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).
  4. Fawcett, D. W. On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates. The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).
  5. Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina. Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).
  6. Finlan, L. E., et al. Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells. PLoS Genetics. 4 (3), e1000039 (2008).
  7. Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development. Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).
  8. Chambeyron, S., Bickmore, W. A. Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription. Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).
  9. Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories. The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).
  10. Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH. The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).
  11. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The role of chromatin during transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  12. Chen, A., Chen, D., Chen, Y. Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals. Gene. 667, 83-94 (2018).
  13. Hughes, A. L., Rando, O. J. Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo. Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).
  14. Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging. Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).
  15. Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern. Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).
  16. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  17. van Berkum, N. L., Dekker, J. Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology. Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).
  18. Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus. American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).
  19. Crane, E. E. Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2. University of California, Berkeley. , PhD thesis (2012).
  20. Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell. 98 (3), 387-396 (1999).
  21. Cuadrado, A., et al. Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells. Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).
  22. Sarro, R., et al. Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development. Development. 145 (7), (2018).
  23. Tolhuis, B., et al. Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture. PLoS Genetics. 7 (3), e1001343 (2011).
  24. Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
  25. Fernández-Miñán, A., Bessa, J., Tena, J. J., Gómez-Skarmeta, J. L. Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish. Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).
  26. Dekker, J. The three "C" s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).
  27. Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).
  28. Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies. Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).
  29. Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression. BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).

Tags

Genetik nr. 195
Få et A med 3C'erne: Kromosom Conformation Capture for studerende
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Joniec, A., Leszczynski, J., Ndoye,… More

Joniec, A., Leszczynski, J., Ndoye, S., Sylvia, J., Weicksel, S. E. Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates. J. Vis. Exp. (195), e65213, doi:10.3791/65213 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter