Summary
Hier stellen wir eine Adaption der Technik zur Erfassung der Chromosomenkonformation (3C) im Detail vor, wobei der Schwerpunkt auf der Beteiligung und dem Lernen von Studenten liegt.
Abstract
Die Erfassung der Chromosomenkonformation (3C) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das eine Familie ähnlicher Techniken hervorgebracht hat (z. B. Hi-C, 4C und 5C, hier als 3C-Techniken bezeichnet), die detaillierte Informationen über die dreidimensionale Organisation des Chromatins liefern. Die 3C-Techniken wurden in einer Vielzahl von Studien eingesetzt, von der Überwachung der Veränderungen in der Chromatinorganisation in Krebszellen bis hin zur Identifizierung von Enhancer-Kontakten mit Genpromotoren. Während viele der Studien, die diese Techniken verwenden, große genomweite Fragen mit komplizierten Probentypen stellen (z. B. Einzelzellanalyse), geht oft verloren, dass die 3C-Techniken auf grundlegenden molekularbiologischen Methoden basieren, die auf einem breiten Spektrum von Studien anwendbar sind. Durch die Behandlung von eng fokussierten Fragen der Chromatinorganisation kann diese hochmoderne Technik verwendet werden, um die Forschungs- und Lehrlaborerfahrung im Grundstudium zu verbessern. Dieser Beitrag stellt ein 3C-Protokoll vor und bietet Anpassungen und Schwerpunkte für die Implementierung an primär grundständigen Einrichtungen in Forschung und Lehre.
Introduction
Das Genom eines Organismus enthält nicht nur alle Gene, die für die Funktion erforderlich sind, sondern auch alle Anweisungen, wie und wann sie zu verwenden sind. Das macht die Regulierung des Zugangs zum Genom zu einer der wichtigsten Funktionen der Zelle. Es gibt viele Mechanismen, um die Genfunktion zu steuern. Im Grunde beruht die Genregulation jedoch auf der Fähigkeit regulatorischer Transkriptionsfaktoren (trans-Faktoren), an ihre spezifischen DNA-Sequenzen (cis-regulatorische Sequenzen) zu binden. Dies ist keine angeborene Fähigkeit; Stattdessen wird sie durch die Organisation/Struktur des Genoms im Zellkern bestimmt, die die Verfügbarkeit/Exposition der cis-regulatorischen Sequenzen gegenüber den trans-Faktoren 1,2,3 steuert. Wenn die Transfaktoren ihre cis-regulatorischen Sequenzen nicht finden können, dann können die Transfaktoren ihre regulatorischen Aufgaben nicht erfüllen. Dies hat das Verständnis, wie Genome im Zellkern organisiert sind, zu einer wichtigen Quelle für die Forschung gemacht.
Es ist allgemein anerkannt, dass eukaryotische Chromosomen im Zellkern während der Interphase ihre eigene Domäne besetzen, die an der Kernlamina und der Kernmatrix verankert ist (Abbildung 1), wodurch das Chromosom eher wie ein Stück Pizza als wie eine Nudel auf einem Teller Spaghetti aussieht. Chromosomen werden teilweise durch Protein-DNA-Interaktionen (Chromatin) kondensiert, die Teile des Chromosoms verdrehen und schlängeln. Durch Elektronenmikroskopie, dreidimensionale DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und DNA-Markierungstechniken (d. h. Fluoreszenz- und künstliche DNA-Methylierung) wurde festgestellt, dass inaktive Chromatindomänen entlang der Kernperipherie dicht gepackt sind 4,5,6, während Teile von aktivem, weniger kondensiertem Chromatin im Inneren des Zellkerns gefunden werden 7,8,9, 10. Sonstiges Diese Experimente bieten einen Weitwinkelblick auf die Chromosomendynamik, tragen aber wenig dazu bei, die Veränderungen zu erfassen, die lokal um die Genpromotoren herum auftreten, die in Studien zu DNase11,12 und Nukleosom13,14,15 beobachtet wurden.
Der Schlüssel zur Erschließung einer höher aufgelösten Chromatindynamik war die Formulierung der 3D-Chromosomen-Kartierungstechnik 3C. Die 3C-Technik selbst besteht aus vier Hauptschritten: Vernetzung des Chromatins, Chromatinverdau durch Restriktionsenzyme, Chromatinligation und DNA-Reinigung (Abbildung 2). Die neuen künstlichen DNA-Fragmente, die durch diesen Prozess erzeugt werden, können dann charakterisiert werden, um die enge physikalische Verbindung zwischen linear entfernten DNA-Stücken aufzudecken16. Die 3C-Technik wurde zur Grundlage für die Entwicklung mehrerer Spin-off-Techniken, die die ersten Schritte von 3C nutzen, um breitere genomweite Fragen zu stellen (z. B. Hi-C, 4C, ChIP-C). Diese Familie von 3C-Techniken hat gezeigt, dass Chromosomen in mehreren diskreten Einheiten organisiert sind, die als topologisch assoziierte Domänen (TADs) bezeichnet werden. TADs sind im Genom kodiert und werden durch Chromatinschleifen definiert, die von ungeschliffenen Grenzen16,17,18,19 flankiert werden. Die TAD-Grenzen werden durch zwei evolutionär konservierte und ubiquitäre Faktoren aufrechterhalten, darunter der CCCT-Bindungsfaktor (CTCF) und die Kohäsion, die verhindern, dass Schleifen innerhalb separater TADs interagieren16,20. Die Schleifen werden durch die Interaktion von trans-Faktoren mit ihren regulatorischen Sequenzen sowie CTCF und Kohäsion vermittelt21.
Obwohl viele Studien mit 3C-Technologien breite genomweite Fragen stellen und komplizierte Probenentnahmetechniken anwenden, basiert die Formulierung der 3C-Technik auf grundlegenden molekularbiologischen Techniken. Dies macht 3C für den Einsatz sowohl in Forschungs- als auch in Lehrlabors interessant. Die 3C-Technik kann für kleinere fokussierte Fragen eingesetzt werden und ist von Natur aus flexibel für die Skalierung nach oben oder unten (einzelne Gene22, Chromosomen16 und/oder Genome18), je nach Fokus und Richtung der gestellten Fragen. Diese Technik wurde auch auf eine Vielzahl von Modellsystemen 7,16,19,23 angewendet und hat sich in ihrer Anwendung als vielseitig erwiesen. Dies macht 3C zu einer hervorragenden Technik für Studenten, da die Studierenden Erfahrungen in gängigen molekularbiologischen Techniken sammeln und gleichzeitig wertvolle Erfahrungen bei der Beantwortung gezielter Fragen sammeln können.
Hier wird ein angepasstes Protokoll für die Herstellung von 3C-Bibliotheken vorgestellt, das auf den zuvor veröffentlichten Protokollen24,25,26,27 basiert. Dieses Protokoll wurde für ca. 1 × 107 Zellen optimiert, obwohl es 3C-Bibliotheken mit nur 1 × 105 Zellen generiert hat. Dieses Protokoll hat sich als vielseitig erwiesen und wurde verwendet, um 3C-Bibliotheken aus Zebrafischembryonen, Zebrafischzelllinien und Caenorhabditis elegans (Fadenwurm) für junge Erwachsene (YA) zu generieren. Das Protokoll sollte auch für Säugetierzelllinien und, mit weiterer Anpassung, für Hefen geeignet sein.
Das Ziel dieser Anpassungen ist es, 3C für Studenten zugänglicher zu machen. Es wurde darauf geachtet, Techniken zu verwenden, die denen ähneln, die in einem Lehrlabor für Studenten durchgeführt werden können. Die 3C-Technik bietet Studenten viele Lernmöglichkeiten, um grundlegende molekularbiologische Techniken zu erlernen, die ihrer Entwicklung am Labor, im Klassenzimmer und in ihren Bemühungen nach dem Abschluss zugute kommen.
Protocol
1. Primer-Design
HINWEIS: Die Design-Tools für 3C-Primer sind online verfügbar28. Alternativ können individuelle Fibeln von den Studierenden entworfen werden (siehe unten).
- Identifizierung von Primerstellen
- Öffnen Sie den UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/), wählen Sie den zu untersuchenden Organismus aus und suchen Sie die Region des Genoms, die mit 3C bewertet werden soll.
- Aktivieren Sie im nächsten Fenster die Enzymspur im Reiter Mapping and Sequencing unterhalb des Browsers, indem Sie auf Restr Enzymes klicken.
- Geben Sie das/die zu verwendende( n) Restriktionsenzym(e) ein und stellen Sie den Anzeigemodus auf Verpacken ein. Klicken Sie auf Senden.
- Stellen Sie sicher, dass RepeatMasker in den Bereichen Variation und Wiederholungen auf dicht eingestellt ist.
- Verwenden Sie die Restriktionsstellen als Leitlinien, um interessante Stellen zu identifizieren, die sich nicht innerhalb der maskierten Wiederholungsbereiche (schwarze Balken) befinden. Markieren Sie 300 Basenpaare (bp), die sowohl die stromaufwärts als auch die stromabwärts gelegene Sequenz um die Restriktionsstelle flankieren, indem Sie auf die Position (oberste Spur) klicken und auf die gewünschte Länge (~600 bp) ziehen.
- Lassen Sie die Maustaste los, und ein Popup-Fenster wird angezeigt. Notieren Sie sich die genomische Position, klicken Sie auf Vergrößern und lassen Sie den Browser die Auswahl neu einstellen.
- Bewegen Sie den Mauszeiger über die Registerkarte Ansicht im oberen Browser-Menüband, und wählen Sie im Dropdown-Menü DNA aus.
- Behalten Sie die Standardoption bei, beachten Sie die Bezeichnung maskierter Sequenzen (es gibt eine Option, sie zu N zu machen). Klicken Sie auf DNA abrufen.
- Die markierte Sequenz wird dann im Fenster angezeigt. Kopieren Sie diese Sequenz und fügen Sie sie in Primer3 (https://primer3.ut.ee/) ein.
- Generieren Sie mit den Standardeinstellungen von Primer3 Primer, indem Sie auf Primer auswählen klicken.
- Achten Sie in den Ergebnissen auf die Position des Restriktionsenzyms und wählen Sie Primer aus, die ein 200-500 bp PCR-Produkt mit der Restriktionsstelle in der Mitte erzeugen.
- Entwerfen Sie nach diesen Schritten Testprimer mit einer Größe von 1 Kilobase (kb), 2 kb, 5 kb, 10 kb und 20 kb von den gewünschten Standorten.
- Um die Primer für die Eingabesteuerung zu entwerfen, wiederholen Sie diese Schritte für eine Stelle, die 1 bis 2 KB von der interessierenden Stelle entfernt ist und für die keine Restriktionsstelle vorhanden ist, d. h. sie wird nie geschnitten.
- Funktionelle Primer-Validierung
- Um die Funktionalität des Primers zu validieren, richten Sie PCR-Reaktionen mit titrierten Primerkonzentrationen und gereinigter genomischer DNA ein. Bestimmen Sie entweder mit quantitativen oder semiquantitativen Mitteln, ob die Primer das erwartete Produkt erzeugen.
- Entwerfen Sie Primer neu, die die Validierung nicht bestehen.
2. Tag 1
HINWEIS: Das Protokoll kann nach der Chromatinvernetzung und nach der Zellkernentnahme pausiert (bei −20 °C eingefroren) werden. Die Schritte dauern im Durchschnitt 5-6 Stunden mit Studenten.
- Young-adult (YA) C. elegans nuclei collection (adaptiert von Han et al.29)
- Chromatin-Vernetzung
- Sammeln Sie 5.000 YA-Würmer in 30 ml M9-Medium in einem konischen 50-ml-Röhrchen und schleudern Sie sie 2 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) bei 400 × g .
- Waschen Sie das Wurmpellet noch 3x mit M9, um Bakterien zu entfernen.
- Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Wurmpellet in 47,3 ml M9 mit 2,7 ml 37%igem Formaldehyd (2% final) und inkubieren Sie es 30 Minuten lang unter Rühren (Schaukeln oder Nutieren).
VORSICHT: Gehen Sie vorsichtig mit Formaldehyd um und arbeiten Sie unter einem Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA-Laborkittel, geeignete Handschuhe und Augenschutz). Formaldehyd ist ein Reizstoff, der Augen, Nase, Rachen und Lunge angreift. - Schleudern Sie die Würmer bei 400 × g für 2 Minuten bei RT.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Wurmpellet in 50 ml 1 M Glycin. Schleudern Sie die Würmer bei 400 × g für 2 Minuten bei RT.
- Nuklei-Sammlung
- Resuspendieren Sie das Wurmpellet in 6 ml gekühltem NP-Puffer (50 mM HEPES bei pH 7,5, 40 mM NaCl, 90 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1 % Tween 20, 0,2 mM DTT, 0,5 mM Spermidin, 0,25 mM Spermin, 1x vollständiger Proteasehemmer).
- Übertragen Sie die Schneckensuspension in einen locker sitzenden 7-ml-Dounce auf Eis. Nehmen Sie die Probe 15x heraus und halten Sie sie 5 Minuten lang auf Eis.
- Übertragen Sie die Wurmsuspension in einen 7 ml dicht anliegenden Dounce auf Eis. Stechen Sie die Probe 20x ab und halten Sie sie 5 Minuten lang auf Eis.
- Übertragen Sie die Wurmsuspension in ein sauberes konisches 15-ml-Röhrchen und fügen Sie NP-Puffer auf insgesamt 10 ml (ca. 4 ml) hinzu.
- Ziehen Sie die Schneckenaufhängung 30 s lang auf hohe Stufe. Inkubieren Sie die Probe 5 Minuten lang auf Eis.
- Wiederholen Sie den vorherigen Schritt.
- Schleudern Sie die Schneckensuspension bei 100 × g für 5 min bei 4 °C.
- Übertragen Sie den Überstand in ein frisches konisches 15-ml-Röhrchen.
- Untersuchen Sie die Probe auf Wurmreste. Visualisieren Sie 10 μl der Probe mit einem Lichtmikroskop. Wenn Wurmreste vorhanden sind, schleudern Sie die Probe bei 2.000 × g für 5 min bei 4 °C, resuspendieren Sie das Pellet in einem frischen 10 ml NP-Puffer und schleudern Sie die Probe erneut bei 100 × g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie das Pellet, überprüfen Sie den Überstand auf Wurmreste und wiederholen Sie den Vorgang, bis die Probe frei von Wurmresten ist.
Anmerkungen: Alternativ können die Wurmreste auch entfernt werden, indem die Probe durch ein 40-μm-Zellsieb (6x) gefolgt von einem 20-μm-Zellsieb (6x) abgesiebt wird. - Wenn die Probe frei von Wurmresten ist, entnehmen Sie 5 μl der Probe, fügen Sie 5 μl methylgrünes Pyronin hinzu (die Kerne sind blau) und zählen Sie die Kerne mit einem Hämozytometer.
- Schleudern Sie die Probe bei 2.000 × g für 5 min bei 4 °C
- Entfernen Sie den Überstand, legen Sie die Proben auf Eis und fahren Sie fort. alternativ können die Kerne eingefroren und bei −80 °C gelagert werden.
- Chromatin-Vernetzung
- Chromatin-Verdau
- Resuspendieren Sie die Zellkerne in 450 μl sauberem Wasser. Übertragen Sie die Kerne in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- In die vernetzte Probe 60 μl 10x DpnII-Restriktionsenzympuffer geben und gut mischen.
HINWEIS: Andere Restriktionsenzyme, die noch vernetzte DNA schneiden, können verwendet werden. - Fügen Sie 15 μl 10%iges Natriumdodecylsulfat (SDS) hinzu, um die Zellkerne zu permeabilisieren, und inkubieren Sie sie unter Rühren (Schaukeln oder Nutieren) bei 37 °C für 1 h.
VORSICHT: SDS ist reizend und giftig, wenn es über die Haut verschluckt oder aufgenommen wird. Gehen Sie vorsichtig damit um und verwenden Sie geeignete PSA (Laborkittel, geeignete Handschuhe und Augenschutz). - Das SDB wird durch Zugabe von 75 μl 20 % Triton X-100 abgeschreckt und 1 h lang bei 37 °C inkubiert.
- Entnehmen Sie 10 μl aus der Probe als unverdaute Kontrolle. Bei 4 °C lagern.
- 400 U DpnII zugeben und über Nacht bei 37 °C unter Rühren inkubieren.
3. Tag 2
HINWEIS: Im Durchschnitt benötigen Studenten 5 Stunden, um diese Schritte abzuschließen.
- Chromatin-Verdau
- Fügen Sie weitere 200 U DpnII hinzu und inkubieren Sie die Proben 4 h lang bei 37 °C unter Rühren, um den vollständigen Aufschluss der vernetzten Probe zu gewährleisten.
- Entnehmen Sie einen 10 μl Aliquot aus den Proben als Aufschlusskontrolle.
- Inaktivierung des Restriktionsenzyms durch Inkubation der Probe für 20 min bei 65 °C (oder gemäß den Anweisungen des Herstellers). Fahren Sie mit Schritt 2.1.3 fort.
- Wenn das Enzym nicht durch Hitze inaktiviert werden kann, fügen Sie 80 μl 10% SDS hinzu und inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei 65 °C. Fügen Sie dann 375 μl 20% Triton X-100 hinzu und mischen Sie durch Schwenken. Inkubieren Sie die Probe 1 h lang bei 37 °C und fahren Sie mit Schritt 2.2 fort.
- Chromatin-Ligatur
- Übertragen Sie die Probe in ein sauberes konisches 50-ml-Röhrchen, stellen Sie das Probenvolumen auf 5,7 ml mit molekularem H2O ein und mischen Sie es durch Schwenken.
- Fügen Sie 700 μl 10x T4-Ligase-Puffer hinzu und mischen Sie durch Schwenken.
- Fügen Sie 60 U T4-DNA-Ligase hinzu und mischen Sie durch Schwenken.
- Über Nacht bei 16 °C inkubieren.
4. Tag 3
HINWEIS: Im Durchschnitt benötigen Studenten 15-30 Minuten, um diese Schritte abzuschließen. Nach der nächtlichen Inkubation können die Proben eingefroren werden.
- Proteinverdauung und umgekehrte Vernetzung
- 30 μl Proteinase K (10 mg/ml) in die 3C-Probe geben und über Nacht bei 65 °C unter Rühren inkubieren. 5 μl Proteinase K (10 mg/ml) zur Unverdauungs- und Verdauungskontrolle geben und über Nacht bei 65 °C unter Rühren inkubieren.
5. Tag 4
HINWEIS: Im Durchschnitt benötigen Studenten 4-5 Stunden, um diese Schritte abzuschließen.
- Aufreinigung der 3C-Bibliothek
- Geben Sie 30 μl RNase A (10 mg/ml) in die 3C-Probe und schwenken Sie sie, um sie zu mischen. Die Probe wird 45 min bei 37 °C inkubiert.
- Geben Sie 7 ml Phenol-Chloroform in die Probe und mischen Sie sie durch Schütteln.
VORSICHT: Phenol-Chloroform ist haut- und augenreizend und kann Verbrennungen verursachen, wenn der Kontakt nicht behandelt wird. Phenol-Chloroform sollte in einem Abzug mit geeignetem Augenschutz und Handschuhen (Nitril) verwendet werden. - Die Probe wird 15 Minuten lang bei 3.270 × g bei RT zentrifugiert. Die wässrige Phase auffangen und in ein sauberes konisches 50-ml-Röhrchen überführen. Fügen Sie gleiche Mengen Chloroform hinzu und mischen Sie die Probe durch Schütteln.
- Die Probe wird 15 Minuten lang bei 3.270 × g RT zentrifugiert. Die wässrige Phase auffangen und in ein sauberes konisches 50-ml-Röhrchen überführen. Fügen Sie 7,5 mlH2Oin molekularer Qualität, 35 ml 100%iges Ethanol und (optional) 7 μl Glykogen (1 mg/ml) hinzu. Durch Schütteln mischen und bei −80 °C inkubieren, bis die Probe gefroren ist.
Anmerkungen: Es kann 1 Stunde oder länger dauern, bis die Probe eingefroren ist. Hier kann das Protokoll pausiert werden.- Während die 3C-Probe gefriert, reinigen Sie die Kontrollproben. Stellen Sie das Volumen der Kontrollproben mit Wasser in molekularer Qualität auf 500 μl ein und fügen Sie 2 μl RNase A (10 mg/ml) hinzu, indem Sie das Röhrchen schnippen.
- Drehen Sie kurz, um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln. Inkubieren Sie die Proben für 45 min bei 37 °C.
- Zu den Kontrollproben wird 1 ml Phenol-Chloroform gegeben und durch Schütteln der Röhrchen gemischt. Zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 3.270 × g RT. Sammeln Sie die wässrige Phase der Kontrollen und geben Sie sie in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Fügen Sie gleiche Mengen Chloroform hinzu und mischen Sie die Probe durch Schütteln. Zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 3.270 × g bei RT. Sammeln Sie die wässrige Phase der Kontrollen und geben Sie sie in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Fügen Sie 1 ml 100% Ethanol und 2 μl Glykogen (1 mg/ml) hinzu. Durch Schütteln mischen und bei −80 °C 30 min inkubieren.
- Die Probe wird 15 min lang bei 3.270 × g bei 4 °C zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 750 μl gekühltes 70%iges Ethanol hinzu.
- Die Probe wird 10 min lang bei 3.270 × g bei 4 °C zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und trocknen Sie die Proben an der Luft. Resuspendieren Sie das Pellet in 50 μl molekularem H2O. Einfrieren oder fahren Sie mit Schritt 6 fort.
- Die Probe wird 60 min lang bei 3.270 × g bei 4 °C zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml gekühltes 70%iges Ethanol hinzu. Brechen Sie das DNA-Pellet auf und brechen Sie es auf, indem Sie die Probe schütteln, um sie zu mischen.
- Zentrifugieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei 3.270 × g bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie die Probe bei RT teilweise an der Luft trocknen. Resuspendieren Sie das Pellet in 150 μl 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), indem Sie es auf und ab pipettieren. Dies ist die "3C-Bibliothek".
Anmerkungen: Frieren Sie die Probe ein oder fahren Sie mit der Analyse fort.
6. Tag 5
HINWEIS: Im Durchschnitt benötigen Studenten 1-2 Stunden, um diese Schritte abzuschließen.
- Bestimmung der Probenqualität anhand der Standardkurve des Kontrollprimers
- Quantifizieren Sie die DNA-Konzentration für die 3C-Probe sowie für alle Kontrollen und stellen Sie die Proben auf 30 μg/μl ein (sofern die Konzentrationen dies zulassen). Seriell verdünnen die Proben viermal das Zweifache, was zu fünf Verdünnungen für jede Probe führt (1x, 0,5x, 0,25x, 0,125x, 0,0625x).
Anmerkungen: Wenn die Quantifizierung nicht einfach durchgeführt werden kann, verdünnen Sie die Proben wie oben angegeben seriell und fahren Sie fort. - Richten Sie PCR-Reaktionen für die 3C-, genomische Kontrolle und verdaute Kontrolle für jede verdünnte Probe mit den Kontrollprimern ein: 1 μl DNA, 10 μl 5x Reaktionspuffer, 1 μl 10 mM dNTPs, 1 μl 10 mM Kontrollprimer (vorwärts und rückwärts gemischt), 1 μl Taq-Polymerase und 36 μl Wasser.
- Befolgen Sie die Anweisungen für die für das PCR-Gerät spezifische Software und richten Sie das Standard-Kurven-PCR-Programm unter den folgenden Zyklusbedingungen ein: 30 s bei 98 °C; 30 Zyklen à 5 s bei 98 °C, 5 s bei 60 °C und 10 s bei 72 °C; 1 min bei 72 °C; 4 °C halten.
- Generieren Sie mit der Software die Standardkurven für die Proben. Nachdem die Software die Kurve generiert hat, notieren Sie sich die PCR-Effizienz und denR2-Wert .
- Quantifizieren Sie die DNA-Konzentration für die 3C-Probe sowie für alle Kontrollen und stellen Sie die Proben auf 30 μg/μl ein (sofern die Konzentrationen dies zulassen). Seriell verdünnen die Proben viermal das Zweifache, was zu fünf Verdünnungen für jede Probe führt (1x, 0,5x, 0,25x, 0,125x, 0,0625x).
- Bestimmung der DNA-Konzentration
- Um die DNA-Konzentration der 3C-Proben zu bestimmen, vergleichen Sie die Proben mit einer genomischen DNA-Probe bekannter Konzentration. Verdünnen Sie die Proben auf 30 ng/μl und verdünnen Sie die genomische Kontrolle seriell von 10 ng/μl auf 0,01 ng/μl in zweifachen Schritten, um eine Standardkurve zu erstellen.
Anmerkungen: Wenn die Quantifizierung nicht einfach durchgeführt werden kann, verdünnen Sie die Probe 1:10 und fahren Sie fort. - Richten Sie die PCR-Reaktionen für die 3C-, genomische Kontrolle und verdaute Kontrolle für jede verdünnte Probe mit den Kontrollprimern ein: 1 μl DNA, 10 μl 5x Reaktionspuffer, 1 μl 10 mM dNTPs, 1 μl 10 mM Kontrollprimer (vorwärts und rückwärts gemischt), 1 μl Taq-Polymerase und 36 μl Wasser.
- Befolgen Sie die Anweisungen für die für das PCR-Gerät spezifische Software und richten Sie das Standardkurven-PCR-Programm unter Verwendung der folgenden Zyklusbedingungen wie folgt ein: 30 s bei 98 °C; 30 Zyklen à 5 s bei 98 °C, 5 s bei 60 °C und 10 s bei 72 °C; 1 min bei 72 °C; 4 °C halten.
- Generieren Sie mit der Software die Standardkurven für die Proben und zeichnen Sie die 3C-Proben auf der Kurve. Vergleichen Sie die Position der 3C-Probenhäufigkeit mit der Standardkurve, die durch die Reaktionen der genomischen DNA bekannter Konzentration erzeugt wird, und passen Sie die 3C-Proben auf 30 ng/μl an.
- Um die DNA-Konzentration der 3C-Proben zu bestimmen, vergleichen Sie die Proben mit einer genomischen DNA-Probe bekannter Konzentration. Verdünnen Sie die Proben auf 30 ng/μl und verdünnen Sie die genomische Kontrolle seriell von 10 ng/μl auf 0,01 ng/μl in zweifachen Schritten, um eine Standardkurve zu erstellen.
- Bestimmung des Vorhandenseins oder Fehlens einer Chromatininteraktion
- Richten Sie qPCR-Reaktionen mit 30 ng der 3C-Probe, der genomischen Kontrollprobe und der verdauten Kontrollprobe ein: 1 μl DNA, 10 μl 5x-Reaktionspuffer, 1 μl 10 mM dNTPs, 1 μl 10 mM Primer (vorwärts und rückwärts gemischt), 1 μl Taq-Polymerase und 36 μl Wasser.
HINWEIS: Die Reaktionen sollten unter Verwendung des Kontrollprimers, der Testprimer für einzelne genomische Loci und der gewünschten Kombinationen der Testprimer (Stelle "a" vorwärts und Stelle "b" rückwärts) zur Bestimmung der Chromatininteraktion eingerichtet werden (Abbildung 3). - Befolgen Sie die Anweisungen für die Software des PCR-Geräts und richten Sie das PCR-Programm wie folgt ein: 30 s bei 98 °C; 40 Zyklen à 5 s bei 98 °C, 5 s bei 60 °C und 10 s bei 72 °C; 1 min bei 72 °C; 4 °C halten.
- Nachdem die PCR durchgeführt wurde, untersuchen Sie das Amplifikationsdiagramm. Stellen Sie sicher, dass die PCR-Reaktionen eine exponentielle Amplifikation aufweisen und sich bei jedem Zyklus verdoppeln.
HINWEIS: Reaktionen, die keine exponentielle Verstärkung aufweisen, können nicht weiter analysiert werden. - Befolgen Sie die Anweisungen für die Software des PCR-Geräts und definieren Sie den Schwellenwert des qPCR-Experiments.
- Exportieren Sie die Ct-Werte für alle Proben.
- Bestimmen Sie die Aufschlusseffizienz unter Verwendung der Ct-Werte des Testprimers (TP) und des Kontrollprimers (CP) aus den unverdauten Kontrollproben (UC) und den verdauten Kontrollproben (DC) unter Verwendung von Gleichung (1).
Prozent verdaut = 100 -
(1) - Diese Werte sollten im Bereich von 80%-90% Verdauung liegen. Notieren Sie diese Werte (Abbildung 4A).
- Bestimmen Sie die relative Chromatinwechselwirkung unter Verwendung der Ct-Werte der Testprimerkombination (TPC) und des Kontrollprimers (CP) aus der unverdauten Kontroll- (UC) und der 3C-Probe (3C) unter Verwendung von Gleichung (2).
Chromatin-Wechselwirkung = 100 -
(2) - Zeichnen Sie die Werte für jede Probe in einem Balkendiagramm für jede Testprimerkombination auf.
- Vergleichen Sie das Signal der 3C-Proben mit den Kontrollproben, um festzustellen, ob die 3C-Probe eine Anreicherung einer bestimmten Chromatin-Wechselwirkung über die Kontrollproben aufweist. 3C-Proben, die eine Anreicherung über die Kontrolle zeigen, können als bedingt positiv angesehen werden und müssen mittels Sanger-Sequenzierung validiert werden (Abbildung 4B).
HINWEIS: Bei der Analyse der Diagrammdaten ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Häufigkeit zwischen Reaktionen (d. h. von einem Satz von Primern zum nächsten) nicht verglichen werden kann, es sei denn, es wird eine "Kontrollschablone" verwendet (siehe Diskussion).
- Richten Sie qPCR-Reaktionen mit 30 ng der 3C-Probe, der genomischen Kontrollprobe und der verdauten Kontrollprobe ein: 1 μl DNA, 10 μl 5x-Reaktionspuffer, 1 μl 10 mM dNTPs, 1 μl 10 mM Primer (vorwärts und rückwärts gemischt), 1 μl Taq-Polymerase und 36 μl Wasser.
- Identifizierung der 3C-Produkte
- Führen Sie die PCR-Produkte auf einem 1,5%igen Agarose-Gel aus.
- Visualisieren Sie das Gel für die richtige Größe der PCR-Produkte mit einer UV-Lichtbox oder einem Gel-Dokumentationssystem.
HINWEIS: Gut konstruierte 3C-Bibliotheken enthalten eine Vielzahl von DNA-Fragmenten, und trotz vorheriger Validierung der Primer auf Spezifität haben PCR-Reaktionen aus 3C-Bibliotheken das Potenzial, viele Banden zu enthalten (Abbildung 5A). Dies verhindert nicht die Analyse der 3C-Bibliotheken. - Entfernen Sie die Produktbanden, die der erwarteten Fragmentgröße entsprechen, und führen Sie die Gelextraktion der PCR-Produkte gemäß den Anweisungen eines handelsüblichen Kits oder des unten beschriebenen hausgemachten Protokolls durch.
ACHTUNG: UV-Licht ist ein bekanntes Karzinogen, und es sollte sehr darauf geachtet werden, die Zeit zu begrenzen, die UV-Licht ausgesetzt ist. Es sollten ein UV-beständiger Augenschutz, ein Probenschutz, Handschuhe und ein Laborkittel getragen werden.- Um eine selbstgemachte Reinigungskartusche herzustellen, stechen Sie mit einer Nadel ein Loch in den Boden eines 0,5-ml-Röhrchens.
- Packen Sie eine kleine Menge Watte aus einem Wattebausch in den Boden des 0,5-ml-Röhrchens und füllen Sie nicht mehr als die Hälfte des Röhrchens.
- Legen Sie das 0,5-ml-Röhrchen in ein 1,5-ml-Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass das kleinere Rohr auf der Lippe des größeren Rohrs aufliegt, nicht im Rohr.
- Schneiden Sie ein Gelfragment vorsichtig in kleinere Stücke und legen Sie es in das 0,5-ml-Röhrchen der Kartusche.
- Legen Sie die Baugruppe für 5 Minuten in einen Gefrierschrank von −20 °C. Drehen Sie die Baugruppe 3 Minuten lang bei 13.000 × g bei RT.
- Bewahren Sie das 1,5-ml-Röhrchen mit der extrahierten DNA in einem Puffer auf und entsorgen Sie das 0,5-ml-Röhrchen mit den Agarose-Trümmern.
- Gereinigte DNA kann zur Sanger-Sequenzierung geschickt werden, wobei Vorwärts- und Rückwärtsprimer für das 3C-Fragment verwendet werden.
- Identifizierung von Chromatinkontakten mittels Blat
- Bestimmen Sie nach Abschluss der Sequenzierung, ob die Proben den Qualitätskontrollstandards entsprechen, die im Sequenzierungsbericht angegeben sind.
- Öffnen Sie für Sequenzen, die die Qualitätskontrolle bestehen, .seq- und .ab1-Dateien (Trace) in einem Sequenzbearbeitungsprogramm wie Another Plasmid Editor (ApE), untersuchen Sie die .ab1-Datei auf eindeutige Basisaufrufspitzen und bearbeiten Sie die in der .seq-Datei falsch aufgerufenen Spitzen.
- Suchen Sie mithilfe der bearbeiteten SEQ-Datei nach der DpnII-Site. Je nach Sequenzergebnis sollte dies in der Mitte der gemeldeten Sequenz liegen.
- Um festzustellen, ob es sich bei der Sequenz um die erwartete Zielsequenz handelt, markieren Sie die DpnII-Stelle und weitere 30-50 bp der stromaufwärts gelegenen Sequenz, die dem Vorwärtsprimer der auf 3C getesteten genomischen Loci entspricht. Führen Sie eine Blat-Suche dieser Sequenz gegen die Zielart durch. Stellen Sie sicher, dass die genomischen Loci mit denen des Primers übereinstimmen.
- Wiederholen Sie den obigen Schritt für die umgekehrte Primersequenz und stellen Sie sicher, dass der zurückgegebene genomische Locus mit dem des umgekehrten Primers übereinstimmt.
(1)
(2)Representative Results
Bei diesem Verfahren werden eine experimentelle 3C-Probe und zwei Kontrollproben (unverdaut und verdaut) erzeugt. Mit diesen drei Proben wurde eine qPCR durchgeführt. Aus diesen Ergebnissen wurde der Aufschlusswirkungsgrad berechnet (Gleichung 1) und aufgezeichnet (Tabelle 1). Aus diesen Berechnungen wurde ermittelt, dass die 3C-Probe eine Verdauungseffizienz von etwa 88 % (Durchschnitt von Tabelle 1) über die sieben getesteten genomischen Loci aufwies.
Als nächstes wurden die Proben auf das Vorhandensein von langreichweitigen Chromatinkontakten zwischen den verschiedenen genomischen Loci untersucht, wobei Kombinationen aus Loci-spezifischen Primern (Tabelle 2) und qPCR verwendet wurden. Anhand dieser Ergebnisse wurden die Produkthäufigkeiten relativ zu einem Kontrollprimer-Set berechnet (Gleichung 2) und zum Vergleich grafisch dargestellt (Abbildung 4). Diese Daten deuten darauf hin, dass 8 der 10 Reaktionen bedingt positiv für langreichweitige Interaktionen waren.
Die PCR-Reaktionen wurden dann auf einem Agarose-Gel durchgeführt. Das erwartete PCR-Produkt für die acht bedingt positiven und eine negative Reaktion wurde gelgereinigt und zur Sanger-Sequenzierung geschickt. Die Ergebnisse für repräsentative positive (blauer Pfeil, blauer Kasten) und negative (roter Pfeil, roter Kasten) Reaktionen sind dargestellt (Abbildung 5).
Abbildung 1: Chromosomenstruktur im Zellkern. Hypothetische Chromosomenorganisation im Zellkern. (A) Kernhülle, schwarze Linien; (B) Kernschicht, orange; (C) Heterochromatin, verdichtete Linien; (D) Euchromatin, lose Schleifen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung des 3C-Protokolls. Entfernte Anteile linearer Chromosomen (blau, gelb und rosa) werden innerhalb des Zellkerns durch regulatorische Schleifen nahe zusammengebracht. (A) Die Schleifenstrukturen werden durch Transkriptionsfaktoren (grauer Kreis und schwarzer Stern) vermittelt; Diese Wechselwirkungen bleiben durch chemische Vernetzung erhalten. (B) Die Schleifen werden durch enzymatische Verdauung unterbrochen (schwarze Linien). (C) Entfernte Chromatinstücke werden durch die durch die Verdauung entstehenden Enden zusammengefügt. (D) Die DNA wird von Proteinen gereinigt. (E) Die Sequenz innerhalb der Fragmente wird identifiziert und auf das Genom zurückgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Das 3C-Primer-Schema. Die 3C-Primer sind um Restriktionsstellen herum in unterschiedlichen Abständen von der interessierenden genomischen Stelle konzipiert. Die rosafarbenen Pfeile stellen die experimentellen Primer-Sets dar, die eine DpnII-Stelle umgeben. Die experimentellen Primer können gemischt und aufeinander abgestimmt werden, um die Chromatinschleife in der Region zu beurteilen. Die orangefarbenen Primer stellen eine Negativkontrolle ohne DpnII-Stelle dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative qPCR-Daten für ein 3C-Experiment. Relative Häufigkeit der 3C-Testprimer-Sets. (A) Kontrolldiagramm, das die relative Häufigkeit des Produkts in der unverdauten Kontrolle (blau), der verdauten Kontrolle (grau) und der 3C-Probe (orange) zeigt. (B) Das 3C-Experiment; die relative Häufigkeit des Produkts aus Kombinationen von Testprimern in der unverdauten Kontrollprobe (blau), der verdauten Kontrolle (grau) und der 3C-Probe (orange). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Visualisierung der 3C-qPCR-Produkte. Oben, Gel mit den qPCR-Endpunktprodukten mit den angegebenen Proben. Unten, repräsentative Sanger-Sequenz-Trace-Dateien für die angegebenen Reaktionen. Die orangefarbene Probe ist ein Beispiel für ein falsch positives Ergebnis (siehe Abbildung 4, r38/34), und die blaue Probe ist ein Beispiel für ein richtig positives Ergebnis mit der DpnII-Stelle, die über der Spur angegeben ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Platz | % Verdauung |
| R8 | 86.98 |
| R3 | 88.44 |
| R38 | 89.64 |
| R34 | 87.55 |
| R33 | 87.85 |
| R14 | 86.97 |
| R47 | 89.45 |
Tabelle 1: Berechnete Aufschlusseffizienz.
| Name | Reihenfolge | Genomische Loci | ||
| r3 Frontantrieb | ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC | chrX:11361475 | ||
| r3 RVS | TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC | chrX:11361561 | ||
| r38 Frontantrieb | TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC | chrX:5859700 | ||
| r38 RVS | AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG | chrX:5859775 | ||
| r34 Frontantrieb | ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG | chrX:5429702 | ||
| r34 RVS | AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC | chrX:5429777 | ||
| r33 Frontantrieb | AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC | chrX:6296704 | ||
| r33 RVS | TTCAGAAAAGTAAACTTTACTTGGAACG | chrX:6296807 | ||
| r14 Frontantrieb | AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG | chrX:8036367 | ||
| r14 RVS | ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTC | chrX:8036427 | ||
| r47 Frontantrieb | ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTCCTC | chrX:9464939 | ||
| r47 RVS | AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC | chrX:9465064 | ||
| r8 Frontantrieb | GAGAATGTTGTCTGTAACTGAAAACTTG | chrX:11094257 | ||
| r8 RVS | TTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACC | chrX:11094362 | ||
| Zündhülse FWD | CAATCGTCTCGCTCACTTGTC | chrX:7608049 | ||
| Primer zur Kontrolle RVS | GATGTGAGCAACAAGGCACC | chrX:7608166 | ||
Tabelle 2: Primer für das repräsentative 3C-Experiment.
Discussion
Die 3C ist eine leistungsfähige Technik, die auf grundlegenden molekularen Techniken beruht. Es ist diese Grundlage grundlegender Werkzeuge, die 3C zu einer so faszinierenden Technik für Studenten macht. Bei so vielen neueren Studien, die die Chromatindynamik auf einer so breiten Skala beobachten, hat die Verwendung dieser Ergebnisse zur Entwicklung eines eng fokussierten Experiments an einem einzelnen Gen oder einer Genomregion das Potenzial, ein einzigartiges und wirkungsvolles Experiment in der Bachelor-Forschung zu schaffen. Oft werden solche Experimente als zu fortgeschritten für Studenten angesehen, aber mit sorgfältiger Planung sind sie leicht durchführbar. Es ist wichtig zu beachten, dass die Assays, die zur Untersuchung der von der 3C-Bibliothek erfassten Chromatinverbindungen entwickelt wurden, von der semiquantitativen Endpunkt-PCR bis zur Sequenzierung des gesamten Genoms variieren können. Tatsächlich wurden die Daten aus dem ersten 3C-Paper16 aus der qPCR generiert. Diese breite Palette von Assays kann alle verwendet werden, da alle 3C-Technologien das gleiche Produkt erzeugen - eine Bibliothek von DNA-Fragmenten, die 3D-Verbindungen im Zellkern darstellen.
Hier wird eine Adaption eines flexibleren und entgegenkommenderen Protokolls vorgestellt, das besser für Forscher im Grundstudium geeignet ist. Die oben aufgeführten Pausenzeiten implizieren nächtliche Verspätungen; Diese Pausen können sich jedoch über Wochenenden und im Falle der Zellen und Zellkerne über Wochen erstrecken. Die wichtigste Überlegung ist, wann die Arbeit erledigt wird. Oft gibt es in Protokollen zeitkritische Schritte, bei denen ein Anhalten keine Option ist. Abgesehen von einigen wenigen Punkten (Tag 1 und Tag 2) gibt es viele Stellen, an denen man anhalten und die Probe einfrieren kann. Diese sind von entscheidender Bedeutung, wenn Sie mit Studenten arbeiten, bei denen die Zeitpläne und Zeiten der Laborarbeit flexibel sein müssen. Zusätzlich zur Aufnahme dieser Stopps in das Protokoll werden die Studenten ermutigt, zu zweit oder sogar in kleinen Gruppen von drei oder vier Personen zu arbeiten. Gruppen eignen sich gut für dieses Protokoll, da sich die Schüler gegenseitig unterstützen und ein Buddy-System erstellen können, damit alle sicher arbeiten können. Auch die Arbeit im Labor macht mit anderen Beteiligten mehr Spaß. In Gruppen können die Schüler auch an einer Vielzahl von Fragen arbeiten, die sich auf die Organisation des Chromatins konzentrieren, während sie immer noch das gleiche Protokoll durchführen. Selbst wenn die Schüler an separaten Projekten arbeiten, verknüpft das Protokoll ihre Bemühungen, und so können sie sich gegenseitig unterstützen.
Andere Anpassungen sollen die Tatsache umgehen, dass bestimmte spezialisierte Werkzeuge und Geräte nicht unbedingt in allen Hochschulen zu finden sind. Zu diesen Geräten gehören unter anderem qPCR-Thermocycler, Geldokumentationssysteme und Nanovolumenspektrometer. In der Tat sind diese Ausrüstungsgegenstände praktisch, aber keine Voraussetzung. Hier wird auch die klassische Methode von 3C im Primer-Design-Teil beschrieben; Dabei geht es darum, einen interessierenden genomischen Locus zu identifizieren und daraus andere genomische Loci für weiter entfernte Chromatin-Kontaktpunkte zu untersuchen. Diese Technik funktioniert auch gut, wenn ein veröffentlichter Datensatz verwendet wird, z. B. ein Datensatz mit Hi-C, bei dem bekannte positive (verbindende) und negative (nicht verbindende) Loci identifiziert werden. Das Design von Experimenten mit diesen veröffentlichten Datensätzen ist eine weitere großartige Anpassung für Lehrlabore, da die Chance auf die erfolgreiche Identifizierung von Chromatinverbindungen in der Regel größer ist. Darüber hinaus kann der Forschungsartikel im Unterricht diskutiert und als Referenz verwendet werden.
Dieses Protokoll verwendet einen modifizierten qPCR-Ansatz, um die 3C-Produktbildung zu visualisieren. Kontrollen sind für den Erfolg der 3C-Technik unerlässlich. Bei jedem Experiment werden sowohl Probenkontrollen als auch Primerkontrollen verwendet, um den Abschluss des 3C-Verfahrens zu bestimmen. Die Probenkontrollen umfassen eine unverdaute Kontrolle (genomische DNA) und eine verdaute Kontrolle. Die unverdaute Kontrolle bestimmt das Basisliniensignal für die Primer-Sets und wird zusammen mit der vernetzten Aufschlusskontrolle verwendet, um die Aufschlusseffizienz zu bestimmen. Es wird erwartet, dass es bei allen Primern, die über eine Restriktionsstelle gerichtet sind, zu einem Produktabfall kommt. Der Vergleich dieses Wertes mit der unverdauten Kontrolle gibt Aufschluss darüber, wie gut die Probe verdaut wurde.
Die Primer für die PCR umfassen einen Kontrollprimer und Testprimer. Der Kontrollprimer ist ein Primer-Set, das sich in der Nähe der zu untersuchenden Genomregion befindet und keine Restriktionsstelle enthält. Dies bildet die Grundlage für die Bestimmung der Häufigkeit der PCR-Produkte des Testprimers. Testprimer sind Vorwärts- und Rückwärtsprimer, die eine Restriktionsstelle für einen bestimmten genomischen Locus von Interesse flankieren (Abbildung 3). Reaktionen mit diesen Primer-Sets werden verglichen, um die Aufschlusseffizienz zu bestimmen, da die Produktfülle sinken sollte, wenn die Restriktionsstelle geschnitten wurde. Bei der Bestimmung der Chromatinorganisation wird ein Testprimer von einem Locus mit einem anderen Testprimer aus einem anderen genomischen Locus gepaart, um festzustellen, ob diese beiden Loci im 3D-Raum nahe beieinander liegen. In diesem Fall wird erwartet, dass ein PCR-Produkt nur anhand der 3C-Probe als Vorlage gefunden wird.
Es ist wichtig zu beachten, dass auch validierte Primer zum Versagen neigen (Abbildung 4: r14-Primer-Set). Darüber hinaus werden PCR-Produkte häufig in Kontrollreaktionen und in Reaktionen identifiziert, bei denen eine Chromatinverbindung nicht vorhergesagt wird (wie z.B. die verdaute Kontrolle, da sie nicht ligiert ist). Diese Instanzen werden sequenziert und bestehen entweder die Sanger-Qualitätssicherung nicht oder werden ohne definierte Sequenz zurückgegeben (Abbildung 5). Darüber hinaus erzeugen herkömmliche 3C-Experimente eine "Kontrollschablone", eine unvernetzte, verdaute und ligierte DNA-Probe, die alle möglichen ligierten Fragmente darstellt, die mit einer bestimmten DNA-Menge hergestellt werden können. Das "Kontrolltemplate" spielt eine wichtige Rolle beim Vergleich der Intensitäten von qPCR-Signalen zwischen zwei genomischen Loci, um festzustellen, ob das Signal eine echte Interaktion oder nur eine zufällige Assoziation darstellt. Die Erstellung einer "Kontrollmatrize" kann problematisch sein, da ein großer Teil des zu untersuchenden Chromatins in Form eines künstlichen Chromosoms erfasst und zusammen mit den 3C-Proben verarbeitet werden muss. Die Sicherung eines solchen Konstrukts ist möglicherweise nicht möglich, und die Erstellung eines solchen Konstrukts könnte außerhalb des Rahmens eines Semesterprojekts liegen. Aufgrund dieser Schwierigkeiten empfehlen wir die Verwendung einer Kontrollgrundierung. Der Kontrollprimer ersetzt nicht alle Funktionen der "Kontrollvorlage", bietet aber dennoch die Möglichkeit, die Daten zu analysieren, um "Anwesenheit" oder "Abwesenheit" zu bestimmen.
Bei der Durchführung der qPCR ist es wichtig, gleiche Mengen der Probe zu verwenden. Dies sollte auch bei Verwendung eines Nano-Spektralphotometers wie eines Nanotropfens bestimmt werden, indem eine Standardkurve aus genomischer DNA einer bekannten Konzentration erzeugt und die 3C-Proben an diese Linie angepasst werden. Diese Mengen sollten aufgezeichnet und in nachfolgenden PCRs verwendet werden. Wichtig ist auch die Qualität der PCR-Reaktion. Da die PCR in der qPCR läuft, wird die Produkthäufigkeit mittels Fluoreszenz gemessen und aufgezeichnet. Diese Aufnahme ist im Verstärkungsdiagramm zugänglich. Sobald das Programm beendet ist, ist es wichtig, das Amplifikationsdiagramm zu überprüfen und sicherzustellen, dass die Reaktionen (mit Ausnahme der Kontrollen ohne Vorlage) drei Phasen haben: eine Basislinie, eine Exponential- und eine Plateau-/Sättigungsphase. Es ist wichtig zu überprüfen, ob die Reaktionen eine exponentielle Phase haben, insbesondere für die Einstellung des Schwellenwerts (siehe unten). Darüber hinaus sollte bei seriell verdünnten Proben eine Verschiebung der Ct-Werte auftreten, die mit der Verdünnung der Probe übereinstimmt (die höchste Konzentration hat die niedrigsten Ct-Werte, während die niedrigste Konzentration die höchsten Ct-Werte aufweist). Proben, die diese Änderung im Amplifikationsdiagramm nicht widerspiegeln, erfordern eine neue Verdünnung oder weisen auf ein größeres Problem mit der 3C-Probenbildung hin. Schließlich berechnet die PCR-Software bei der Erstellung der Standardkurve die PCR-Effizienz und denR2-Wert . Die PCR-Effizienz sollte größer als 90 % und derR2-Wert größer als 0,99 sein. Wenn eine dieser Bedingungen nicht erfüllt ist, ist es wahrscheinlich, dass etwas mit der Probe oder den PCR-Primern nicht stimmt.
Nach der qPCR können der prozentuale Aufschluss und das Vorhandensein von 3C-Wechselwirkungen mit der qPCR Ct für jede Reaktion berechnet werden. Um diese zu bestimmen, muss zunächst der Schwellenwert für die PCR-Reaktion festgelegt werden. Dies geschieht normalerweise mit der Software, die mit dem qPCR-Gerät geliefert wird. Durch das Festlegen des Schwellenwerts wird die Konzentration des PCR-Produkts definiert, die zum Vergleich der Ct-Werte der Probe verwendet wird. Der Schwellenwert sollte die Amplifikationskurven der PCR-Reaktionen in der exponentiellen Phase der Amplifikation halbieren. Es können nur PCR-Reaktionen mit exponentieller Amplifikation verglichen werden (in diesem Fall die Kontrollprimer und die Testprimerreaktionen), da nur so sichergestellt werden kann, dass die Reaktionen die DNA mit der gleichen Geschwindigkeit amplifizieren und originalgetreu verglichen werden können. Bei der Analyse der 3C-Diagramme werden bedingt positive Reaktionen als solche mit mehr Produkt als die Kontrollproben, die genomische Kontrolle und die Verdauungskontrolle identifiziert (Abbildung 4B). Diese Proben müssen jedoch nach der Gelaufreinigung des PCR-Produkts mittels Sanger-Sequenzierung weiter validiert werden.
Nach der Sanger-Sequenzierung können Proben, die die Qualitätskontrolle bestehen, mit Blat. Das Ziel dieser Analyse ist es, festzustellen, ob die Probe die Sequenz beider genomischer Zielorte aufweist, die die Restriktionsstelle flankieren (DpnII im Falle dieses Protokolls). Wenn beide Sequenzen identifiziert sind, kann das 3C-Fragment als validiert betrachtet werden. Wenn die Ergebnisse des Blat nicht die erwartete Sequenz zurückgeben, kann dies darauf hindeuten, dass einer oder beide Primer nicht optimal sind, was zu einem falsch positiven qPCR-Ergebnis führt. Die Ablaufverfolgungsdateien für die falsch positiven Proben weisen undefinierte Basisspitzen auf, und die Seq-Berichte enthalten hauptsächlich "n" Basisaufrufe.
Die Sanger-Validierung ist unerlässlich, da falsch positive Ergebnisse aus der künstlichen PCR-Produktbildung möglich sind. Diese falsch positiven Ergebnisse können identifiziert werden, wenn die Sequenzierungsprodukte nicht die erwartete Zielsequenz oder eine DpnII-Stelle aufweisen, die für ein geeignetes 3C-Fragment charakteristisch ist (Abbildung 5). Die Sequenzierung der PCR-Fragmente liefert auch einen weiteren Datenpunkt für das Experiment und macht den Studenten klar, dass die 3C-Technik entfernte genomische Loci identifiziert, die im 3D-Raum innerhalb der Zellkerne zusammenkommen.
Die 3C-Technik bietet eine Fülle grundlegender molekularer Techniken für Studenten in einem flexiblen, unkomplizierten Verfahren. Diese 3C-Technik ist auch ein Ausgangspunkt für die anderen 3C-Techniken, die Next-Generation-Sequencing (NGS) beinhalten. Diese Art von Experimenten kann Studenten mit wichtigen Aspekten der Bioinformatik vertraut machen und ist in den hier skizzierten Grundprinzipien verwurzelt. Erfahrung und Engagement im Grundstudium sind der Schlüssel zu ihrem Erfolg und ihrer Entwicklung als junge Wissenschaftler. Durch die Bereitstellung dieser Möglichkeiten können Studenten ihr Verständnis der Grundprinzipien stärken und gleichzeitig ihr Selbstvertrauen aufbauen, um modernste Techniken und Fragen anzugehen.
Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch den Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence des National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Fördernummer P20GM103430 und des Bryant Center of Health and Behavioral Sciences unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Millapore-Sigma | F8775 | |
| 100% Ethanol | Millapore-Sigma | E7023 | |
| CaCl2 | MP Biomedical | 215350280 | |
| chloroform | Millapore-Sigma | C0549 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millapore-Sigma | COEDTAF-RO | mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh |
| Dithiothreitol (DTT) | Millapore-Sigma | D0632 | 1 M stock diluted to 500 µM in Sucrose buffer and GB buffer fresh |
| DpnII | NEB | R0543M | |
| Glycerol | Millapore-Sigma | G9012 | |
| glycine | Millapore-Sigma | G8898 | |
| glycogen | Millapore-Sigma | 10901393001 | |
| HEPES | Millapore-Sigma | H3375 | |
| KCl | Millapore-Sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | Millapore-Sigma | P5655 | |
| methyl green pyronin | Millapore-Sigma | HT70116 | |
| MgAc2 | Thermoscientific | 1222530 | |
| Na2HPO4 | Millapore-Sigma | S5136 | |
| NaCl | Millapore-Sigma | S9888 | |
| phenol-chloroform | Millapore-Sigma | P3803 | |
| Pronase | Millapore-Sigma | 11459643001 | |
| Proteinase K | IBI Scientific | IB05406 | |
| qPCR Ready mix (Phire Taq etc) | Millapore-Sigma | KCQS07 | |
| RNase A | Millapore-Sigma | R6148 | |
| Sodium Acetate | Millapore-Sigma | S2889 | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Millapore-Sigma | L3771 | |
| Sucrose | Millapore-Sigma | S0389 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1804 | |
| Tris-HCl | Millapore-Sigma | 108319 | |
| Triton X-100 | Millapore-Sigma | T9284 | |
| Trypsin-EDTA | Millapore-Sigma | T4049 |
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