Summary
Diese Studie stellt ein Protokoll für die Verwendung von induzierbaren Osteoblasten-spezifischen Stat3-Knockout-Mäusen zur Untersuchung des Knochenumbaus unter kieferorthopädischer Kraft zur Verfügung und beschreibt Methoden zur Analyse des alveolären Knochenumbaus während kieferorthopädischer Zahnbewegungen, wodurch ein Licht auf die mechanische Biologie des Skeletts geworfen wird.
Abstract
Der Alveolarknochen ist mit einer hohen Umsatzrate der am aktivsten umbauende Knochen im Körper. Die kieferorthopädische Zahnbewegung (OTM) ist ein gängiger künstlicher Prozess des Umbaus des Alveolarknochens als Reaktion auf mechanische Krafteinwirkung, aber der zugrunde liegende Mechanismus bleibt schwer fassbar. Bisherige Studien waren aufgrund von Einschränkungen im Tiermodell nicht in der Lage, den genauen Mechanismus des Knochenumbaus zu jeder Zeit und in jedem Raum aufzudecken. Der Signalwandler und Aktivator der Transkription 3 (STAT3) ist wichtig für den Knochenstoffwechsel, aber seine Rolle in Osteoblasten während der OTM ist unklar. Um in vivo den Nachweis zu erbringen, dass STAT3 zu bestimmten Zeitpunkten und in bestimmten Zellen während der OTM an der OTM beteiligt ist, haben wir ein Tamoxifen-induzierbares Osteoblastenlinien-spezifisches Stat3-Knockout-Mausmodell generiert, kieferorthopädische Kraft angewendet und den alveolären Knochenphänotyp analysiert.
Mikro-Computertomographie (Micro-CT) und Stereomikroskopie wurden verwendet, um die OTM-Distanz zu erfassen. Die histologische Analyse wählte den Bereich, der sich innerhalb von drei Wurzeln des ersten Molaren (M1) im Querschnitt des Oberkieferknochens befindet, als Region of Interest (ROI) aus, um die metabolische Aktivität von Osteoblasten und Osteoklasten zu bewerten, was auf die Wirkung der kieferorthopädischen Kraft auf den Alveolarknochen hinweist. Kurz gesagt, wir stellen ein Protokoll für die Verwendung von induzierbaren osteoblastenspezifischen Stat3-Knockout-Mäusen zur Verfügung, um den Knochenumbau unter kieferorthopädischer Kraft zu untersuchen und Methoden zur Analyse des alveolären Knochenumbaus während der OTM zu beschreiben und so ein neues Licht auf die mechanische Biologie des Skeletts zu werfen.
Introduction
Es ist allgemein bekannt, dass Knochen während des gesamten Lebens als Reaktion auf mechanische Kräfte nach dem Wolffschen Gesetz 1,2 ständig rekonstruiert werden. Geeignete mechanische Stimulation, wie Schwerkraft und tägliche Bewegung, erhalten Knochenmasse und -stärke und beugen Knochenschwund vor, indem sowohl Osteoblasten als auch Osteoklasten stimuliert werden. Osteoklasten, die für den Knochenabbau verantwortlich sind 3,4,5,6,7, und Osteoblasten, die für die Knochenbildung verantwortlich sind 8,9,10, halten die Knochenhomöostase aufrecht und fungieren gemeinsam im biologischen Prozess des Knochenumbaus. Im Gegensatz dazu erleiden die Knochen in Abwesenheit von Belastungsreizen, wie bei Astronauten in der Langzeit-Schwerelosigkeit, einen Verlust der Knochenmineraldichte um 10 %, was das Risiko für Osteoporose erhöht11,12. Darüber hinaus haben sich nicht-invasive und bequeme mechanische Therapien, einschließlich Kieferorthopädie und Distraktionsosteogenese, als Behandlung von Knochenerkrankungen herauskristallisiert13,14. All dies hat gezeigt, dass mechanische Kraft eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Knochenqualität und -quantität spielt. Neuere Studien analysierten im Allgemeinen den Knochenumbau als Reaktion auf mechanische Belastung mit zeitaufwändigen Modellen wie Laufrad- und Heckaufhängungstests, die in der Regel 4 Wochen oder länger dauerten, um die Kraftbelastung oder -entlastung zu simulieren15,16. Daher besteht Bedarf an einem bequemen und effizienten Tiermodell für die Untersuchung des Knochenumbaus, der durch Kraftbelastung angetrieben wird.
Der Alveolarknochen ist mit einer hohen Turnover-Rate am aktivsten in Bezug auf den Knochenumbau17. Die kieferorthopädische Zahnbewegung (OTM), eine gängige Behandlung von Zahnfehlstellungen, ist ein künstlicher Prozess des Umbaus des Alveolarknochens als Reaktion auf mechanische Krafteinwirkung. OTM, das einen schnellen Knochenumbau induziert18, ist jedoch auch eine zeitsparende Methode, um die Auswirkungen mechanischer Kraft auf den Knochenumbau im Vergleich zu anderen Modellen mit einer langen Versuchszeit zu untersuchen. Daher ist OTM ein ideales Modell, um den Knochenumbau unter mechanischen Stimuli zu untersuchen. Es ist erwähnenswert, dass der Mechanismus des alveolären Knochenumbaus oft zeitkritisch ist und es notwendig ist, die Veränderungen des alveolären Knochenumbaus zu bestimmten Zeitpunkten nach der Modellierung zu beobachten. Mit den doppelten Vorteilen der zeitlichen und räumlichen Kontrolle der DNA-Rekombination und der Gewebespezifität ist ein induzierbares bedingtes Gen-Knockout-Mausmodell eine geeignete Wahl für OTM-Studien.
Konventionell wurde der OTM-vermittelte alveoläre Knochenumbau in Spannungszonen mit Knochenbildung und Druckzonen mit Knochenresorption unterteilt 19,20,21, was detaillierter, aber schwer zu regulieren ist. Darüber hinaus berichteten Yuri et al., dass sich der Zeitpunkt der Knochenbildung bei OTM auf der Zug- und Kompressionsseite unterschied22. Darüber hinaus hatte eine frühere Studie gezeigt, dass der erste Molar unter kieferorthopädischer Kraft, die nicht auf die Spannungs- und Druckzonen beschränkt war, einen breiten Umbau des Oberkieferalveolarknochens einleiten konnte23. Daher wählten wir den Bereich, der sich innerhalb von drei Wurzeln von M1 im Querschnitt des Oberkieferknochens befindet, als Region of Interest (ROI) und beschrieben Methoden zur Bewertung der Aktivität von Osteoblasten und Osteoklasten im selben Bereich, um den alveolären Knochenumbau unter OTM zu bewerten.
Als nukleärer Transkriptionsfaktor hat sich der Signalwandler und Aktivator der Transkription 3 (STAT3) als entscheidend für die Knochenhomöostase erwiesen24,25. Frühere Studien berichteten über eine geringe Knochenmineraldichte und rezidivierende pathologische Frakturen bei Stat3-mutierten Mäusen26,27. Unsere frühere Studie zeigte, dass die Deletion von Stat3 in Osx+-Osteoblasten zu kraniofazialen Fehlbildungen und Osteoporose sowie zu spontanen Knochenbrüchen führte28. Kürzlich haben wir in vivo Beweise mit einem induzierbaren Osteoblasten-spezifischen Stat3-Deletions-Mausmodell (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, im Folgenden Stat3Col1α2ERT2) genannt), dass STAT3 entscheidend für die Vermittlung der Effekte der kieferorthopädischen Kraft ist, die den Umbau des Alveolarknochens antreibt29. In dieser Studie stellen wir Methoden und Protokolle für die Verwendung von induzierbaren osteoblastenlinienspezifischen Stat3-Knockout-Mäusen zur Verfügung, um den Knochenumbau unter kieferorthopädischer Kraft zu untersuchen und Methoden zur Analyse des alveolären Knochenumbaus während der OTM zu beschreiben und so die mechanische Biologie des Skeletts zu beleuchten.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden mit Tieren wurden von der Ethikkommission des Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (Nr. 82101048) genehmigt.
1. Etablierung induzierbarer Osteoblasten-spezifischer Stat3-Knockout-Mäuse
ANMERKUNG: Stat3 fl/fl Mäuse wurden kommerziell gewonnen; der Col1α2CreERT2-Stammwar ein Geschenk (siehe Materialtabelle für alle Details). Für alle Tiere wurden standardisiertes Laborpelletfutter und -wasser sowie Standard-Laborumgebungsbedingungen (Raumtemperatur bei 22 °C bis 26 °C und Luftfeuchtigkeit bei 50 % bis 55 %) bereitgestellt.
- Setze eine geschlechtsreife männliche Maus mit zwei weiblichen Mäusen in denselben Käfig. Nach 18 Tagen sollten Sie jeden Tag nach Neugeborenen suchen. Bringen Sie trächtige weibliche Mäuse in einen leeren Käfig und halten Sie sie bei Bedarf alleine. Setzen Sie männliche Mäuse in andere Zuchtkäfige, wenn die weiblichen Mäuse nicht innerhalb von 30 Tagen trächtig sind.
- Stat3fl/+ generieren; Col1α2 CreERT2 Mäuse durch Hybridisierung von Stat3 fl/ fl Mäusen mit Col1α2CreERT2 Mäusen; alle diese Mäuse auf dem C57BL/6-Hintergrund zu belassen. Sammeln Sie 2-5 mm Schwanzspitzen für die Genotypisierung und behalten Sie das Männchen Stat3fl/+; Col1α2CreERT2 Mäuse bis zur Geschlechtsreife (F1).
- Hybridisieren Sie 6 Wochen alte Rüden Stat3fl/ +; Col1α2CreERT2 Mäuse mit weiblichen Stat3 fl/fl Mäusen. Sammeln Sie 2-5 mm Schwanzspitzen, wenn die Mäuse 2 Wochen alt sind, für die Genotypisierung, und behalten Sie das Männchen Stat3 fl/ fl; Col1α2 CreERT2(Stat3,Col1α2ERT2) Mäuse bis zur Geschlechtsreife (F2).
- Hybridisierung des 6 Wochen alten Rüden Stat3 fl/ fl; Col1α2CreERT2 Mäuse mit weiblichen Stat3 fl/fl Mäusen (F3). Sammeln Sie 2-5 mm Schwanzspitzen, wenn die Mäuse 2 Wochen alt sind, um die Genotypisierung durchzuführen, und verwenden Sie die jüngeren Mäuse desselben Genotyps, um ältere Zuchtmäuse zu ersetzen, wenn dies angemessen ist (F3+N).
HINWEIS: Die Fortpflanzungsfähigkeit von Mäusen nimmt nach dem Alter von 8 Monaten ab, daher müssen die Mäuse in den Zuchtkäfigen sorgfältig überwacht und bei Bedarf ersetzt werden. Darüber hinaus sollte entsprechend den experimentellen Anforderungen die Anzahl der Zuchtkäfige entsprechend erhöht werden, um das Aussterben der Zielgenmäuse zu vermeiden.
2. Induzierbare Deletion von Stat3 in Col1α2-exprimierenden Osteoblasten durch Tamoxifen
- Tamoxifen in Maisöl auf 20 mg/ml in einem Zentrifugenröhrchen auflösen und durch Einwickeln in Folie vor Licht schützen. Das mit Folie überzogene Zentrifugenröhrchen auf einen Rotationsmischer stellen und bei Raumtemperatur mischen, bis es sich vollständig aufgelöst hat.
HINWEIS: Tamoxifen wurde kommerziell gewonnen und im Dunkeln bei 4 °C gelagert. - Wählen Sie zehn 6 Wochen alte männliche Mäuse aus und teilen Sie sie in Stat3fl/fl - und Stat3Col1α2ERT2-Gruppen mit fünf Mäusen in jeder Gruppe ein. Tamoxifen (100 mg·kg-1·KG) alle 2 Tage für 1 Woche durch intraperitoneale Injektion verabreichen.
3. Modell der kieferorthopädischen Zahnbewegung (OTM)
- Bereiten Sie eine sterilisierte Kunststoff-Maus-Dissektionsplattform als Operationstisch vor, um die Mäuse zu immobilisieren.
HINWEIS: Der Maus-Seziertisch wurde kommerziell erworben und bestand aus vier verstellbaren Gummipfosten und einem Metallstab zur Immobilisierung der Mäuse. Verwenden Sie während des gesamten Eingriffs sterile Instrumente und Werkzeuge. - Befestigen Sie an jedem Gummipfosten ein Gummiband zur Fixierung der Gliedmaßen.
- Binden Sie ein Gummiband zwischen die beiden oberen Gummipfosten; Binden Sie einen Faden an das Gummiband, um die unteren Schneidezähne zu halten. und binden Sie einen weiteren Faden an die Metallstange, um die oberen Schneidezähne zu halten.
- 7 Wochen alte männliche Mäuse werden vor der Operation mit 0,1 ml Lösung von Dexmedetomidinhydrochlorid (0,1 mg·kg-1·bw) und Zoletil (Tiletaminhydrochlorid für 20 mg·kg-1·bw und Zolazepamhydrochlorid für 20 mg·kg-1·bw) anästhesiert, die durch intraperitoneale Injektion in Kochsalzlösung gelöst wurden. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse während der gesamten Operation unter ordnungsgemäßer Narkose stehen.
HINWEIS: Achten Sie auf das Datum der effektiven Verwendung von Medikamenten und verwenden Sie keine abgelaufenen Medikamente. - Vergewissern Sie sich, dass die Mäuse unter ordnungsgemäßer Narkose stehen, indem Sie die Zehen der Hinterbeine mit den Fingern zusammendrücken.
HINWEIS: Wenn die Mäuse nicht auf den Test ansprechen, bedeutet dies, dass sie bewusstlos sind und die Anästhesie die gewünschte Tiefe erreicht hat. Zu diesem Zeitpunkt befinden sich die Mäuse in einem Zustand der Entspannung der Gliedmaßenmuskulatur mit gleichmäßiger Atmung und Herzfrequenz, und die Operation kann begonnen werden. - Verwenden Sie Tiersalbe auf den Augen der Mäuse, um Trockenheit zu verhindern, und legen Sie die betäubte Maus in Rückenlage auf den Operationstisch. Verwenden Sie vier elastische Bänder an den Gummipfosten, um die Gliedmaßen zu fixieren, einen Faden, der an der Metallstange befestigt ist, um die oberen Schneidezähne zu halten, und einen weiteren, der an einem Gummiband zwischen den beiden oberen Gummipfosten befestigt ist, um die unteren Schneidezähne einzuhaken, um den Unterkiefer offen zu halten.
- Bereiten Sie geschlossene Schraubenfedern (0,25 mm Drahtstärke, 0,76 mm Durchmesser, 1 mm Länge) für die kieferorthopädische Kraftapparatur vor.
HINWEIS: Schneiden Sie für jede Maus acht Federfäden ab. Vier Fäden von 1 mm Länge in der Mitte für die Kraftaufrüstung und zwei Fäden an jedem Ende für die Ligaturierung mit Stahlligaturdraht. - Ligatieren Sie ein Ende der Feder, das auf den linken ersten Backenzahn des Oberkiefers vorbereitet ist. Das andere Ende des mittleren Schneidezahns wird mit einem 0,1 mm dicken Stahlligaturdraht ligiert, der mit lichthärtendem Restaurationsharz verstärkt ist, nachdem die Schneidezähne mit dem Wattenstäbchen mit Klebstoff versehen wurden, um eine stabile Kraft von 10 g zu erzeugen, die mit einem Dynamometer gemessen wird.
- Nach Beendigung der Operation setzen Sie die Mäuse in einen Käfig mit anderen Mäusen desselben Stammes, um sich zu erholen, oder setzen Sie jede Maus allein in einen leeren Käfig. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse nicht unbeaufsichtigt gelassen werden, bis sie 2-4 Stunden nach der Operation wieder zu Bewusstsein gekommen sind, um das Brustbeinliegen aufrechtzuerhalten. Füttern Sie die Mäuse in den nächsten Tagen mit einer weichen Diät und beobachten Sie sie regelmäßig, um sicherzustellen, dass keine Komplikationen auftreten und um den Grad der postoperativen Schmerzen festzustellen. Verabreichen Sie bei Bedarf Analgetika.
HINWEIS: Mäuse, die sich einer Operation unterzogen haben, sollten nicht in die Gesellschaft anderer Mäuse zurückgebracht werden, bis sie sich vollständig erholt haben. Setzen Sie postoperative Mäuse nicht mit Mäusen zusammen, die nicht betäubt sind. Mäuse müssen während der Genesung warm gehalten werden. - Kontrollieren Sie die kieferorthopädische Apparatur täglich und schließen Sie Versuchsmäuse mit Dislokation aus.
4. Probenentnahme
- Euthanasieren Sie die Mäuse zu drei verschiedenen Zeitpunkten durch Zervixluxation: 4 Tage (d4), 7 Tage (d7) und 10 Tage (d10) nach Beginn der OTM.
- Schneiden Sie mit einer Augenschere die Haut senkrecht von der Halswirbelsäule ab und trennen Sie dann den Kopf vom Körper, wobei die gesamte Haut des Kopfes präpariert wird.
- Schneiden Sie die Haut und die Buccinator-Muskeln vom bilateralen Angulus oris bis zum hinteren Bereich des Unterkiefers ab. Trennen Sie die bukkalen Muskeln und die Sehnen, die an den Coracoiden befestigt sind, vollständig, um den Unterkiefer zu entfernen und zusätzliche Knochen zu trimmen, um einen vollständigen Oberkiefer zu erhalten. Entfernen Sie dann den Knochen hinter den beidseitigen dritten Backenzähnen und reißen Sie die Gaumenschleimhaut ab. Zum Schluss trennen Sie die kieferorthopädische Apparatur und schneiden den Knochen zwischen den Schneidezähnen entlang der mittleren Gaumennaht ab, um den Alveolarknochen der rechten und linken Seite zu erhalten.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Bereich von den Schneidezähnen bis zum dritten Backenzahn auf beiden Seiten intakt bleibt.
5. Vorbereitung für den Paraffinschnitt
- Fixierung: Tauchen Sie den entnommenen Alveolarknochen für 48 Stunden in 4%iges Paraformaldehyd und schneiden Sie ihn mit einer Augenschere in den Abzug für die Abschnitte 6 und 7.
- Entkalkung: Proben 3 x 10 min schonend mit 1x PBS waschen. Entkalken Sie die Proben 5 Wochen lang in einem universellen Gewebefixiermittel (pH 8,0), das alle 2 Tage durch eine frische Lösung ersetzt wird, bis die Knochen leicht mit einer Nadelspitze durchdrungen werden können.
- Dehydrierung: Waschen Sie die Proben 3 x 10 Minuten lang in 1x PBS und tauchen Sie sie dann nacheinander für jeweils 2 x 1 h in 95 % Ethanol, 100 % Ethanol und Xylol.
- Die Proben werden 30 min lang in eine 1:1-Mischung aus Xylol und Paraffin und dann über Nacht in Paraffin bei 65 °C getaucht.
- Einbettung: Wählen Sie geeignete Einbettbehälter aus. Platzieren Sie den Alveolarknochen gleichmäßig mit den Zähnen auf gleicher Höhe. Nehmen Sie die Proben aus dem Einbettbehälter und geben Sie sie in einen Gefrierschrank bei -20 °C, und nummerieren Sie sie, wenn das Paraffin vollständig abgekühlt und fest ist.
- Mit einem Mikrotom zwanzig bis vierzig 4 μm dicke Abschnitte kontinuierlich in die Querebene schneiden und auf 37 °C heißem Wasser schwimmen. Die Schnitte auf Objektträger kleben und bei 42 °C über Nacht backen.
6. OTM-Entfernungsmessung
- Fotografieren Sie Proben von drei Zeitpunkten vertikal von der Okklusionsebene aus mit Stereomikroskopie.
- Scannen Sie den Alveolarknochen mit einem Mikro-CT-Scanner. Rekonstruieren Sie 3D-Bilder der maximalen Sagittalebene des Oberkieferknochens, in der drei Molaren vollständig sichtbar sind, mit der unterstützenden Software des Scanners gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Messen Sie den OTM-Abstand mit der ImageJ-Software:
- Öffnen Sie die ImageJ-Software und verwenden Sie das Werkzeug Gerade Linie , um ein Liniensegment mit bekanntem Abstand zu erstellen.
- Klicken Sie auf "Analysieren" und wählen Sie "Maßstab festlegen", um den Wert des gezeichneten Linienabstands in "Bekannte Entfernung" und Einheiten in "Längeneinheit" einzugeben.
- Ziehen Sie eine Linie zwischen den Mittelpunkten des mesialen Marginalkamms von M2 und dem distalen Marginalkamm von M1, und klicken Sie auf Messung. Die in der Spalte Länge angezeigten Ergebnisse stellen die OTM-Entfernung dar.
7. Histologische Analyse
- Auswahl der Region of Interest (ROI): Definieren Sie den Alveolarknochen des ersten Molaren (M1) als ROI, der sich genau innerhalb von drei Wurzeln von M1 im Querschnitt am Oberkieferknochen befindet. Diese Region erreicht nicht nur den kortikalen Knochen des ersten Molaren in bukkal-lingualer Richtung, sondern erstreckt sich auch bis zur Mitte der Längsachse der mesiobukkalen Wurzel, einschließlich des halben Bereichs zwischen der distobukkalen Wurzel und der palatinalen Wurzel.
- Analyse der Osteogenese
- Doppelte Kennzeichnung und Analyse von Calcein und Alizarinrot
- Calcein- und Alizarinrot-Zubereitung: Calcein in 2%igerNaHCO-3-Lösung auf 1 mg/ml und Alizarinrot S inH2Oauf 2 mg/ml auflösen.
HINWEIS: In dieser Studie wurden Calcein und Alizarinrot kommerziell gewonnen. - Verabreichen Sie Calcein (20 mg·kg-1·bw) an Tag 1 und Alizarinrot S (40 mg·kg-1·bw) an Tag 8 durch intraperitoneale Injektion nach Beginn der OTM. Euthanasieren Sie die Mäuse an Tag 10 und entnehmen Sie den Alveolarknochen.
- Bereiten Sie die Proben vor und betten Sie sie gemäß den Schritten 5.1 und 5.3-5.5 ein. Weitere Informationen finden Sie bei Yang et al.30.
- Schneiden Sie mit einem Rotationsmikrotom kontinuierlich 5 μm dicke Abschnitte in der Querebene. Kleben Sie die Schnitte auf Objektträger und befestigen Sie sie mit Deckgläsern aus neutralem Balsam.
HINWEIS: Der Rest der Proben muss mit Trockenmittel bei Raumtemperatur gelagert werden. - Die Schnitte werden unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht und fotografiert und die Mineralappositionsrate (MAR) und die Knochenbildungsrate (BFR/BS) nach der zuvor beschriebenen Methode berechnet30.
- Calcein- und Alizarinrot-Zubereitung: Calcein in 2%igerNaHCO-3-Lösung auf 1 mg/ml und Alizarinrot S inH2Oauf 2 mg/ml auflösen.
- Immunfluoreszenz
- Geeignete Paraffinabschnitte auswählen und bei 65 °C 30 min backen.
- Entwachsung: Tauchen Sie die Partien 5 Minuten lang in Xylol und wiederholen Sie den Vorgang zweimal mit frischem Xylol.
- Rehydrierung: Tauchen Sie die Abschnitte nacheinander für jeweils 5 Minuten in 95 % Ethanol, 75 % Ethanol, 50 % Ethanol und ddH2O.
- Waschen Sie die Partien vorsichtig mit 1 x PBS für 2 x 5 Minuten.
- Antigengewinnung: Die Schnitte werden in eine Mischung aus Tris-HCl (0,05 m, pH 8,0), EDTA (0,01 m, pH 8,0) und Protease K (10 μg/ml) inddH2Ogetaucht und 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert.
- Waschen Sie die Partien vorsichtig mit 1 x PBS für 3 x 5 min.
- Block: Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Abschnitten und ziehen Sie mit einem hydrophoben Marker einen Kreis um den Zielbereich. Um die unspezifische Bindung zu blockieren, mit einem Blockierungspuffer mit 10 % Rinderserumalbumin abdecken und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die Abschnitte nicht zu lange zu trocknen, um das Ergebnis nicht zu beeinträchtigen. - Primäre Antikörperinkubation: Verdünnen Sie den Anti-Osteopontin-Antikörper (OPN) mit dem Antikörperverdünnungsmittel auf die empfohlene Konzentration und fügen Sie jeder Probe 30-50 μl hinzu. bei 4 °C über Nacht in einer befeuchteten Kammer inkubieren.
HINWEIS: Achten Sie darauf, etwas Wasser in der Kammer zu lassen und sie abzudecken, um zu verhindern, dass die Antikörperflüssigkeit verdunstet. - Waschen Sie die Partien vorsichtig mit 1 x PBS für 3 x 10 min.
HINWEIS: Die Schritte 7.2.2.10-7.2.2.12 sollten im Dunkeln ausgeführt werden. - Inkubation fluoreszierender Sekundärantikörper: Wählen Sie einen geeigneten fluoreszierenden Sekundärantikörper aus, der dem Primärantikörper entspricht, und verdünnen Sie ihn auf die empfohlene Konzentration. Zu jeder Probe 30-50 μl geben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Waschen Sie die Partien vorsichtig mit 1 x PBS für 2 x 10 min.
- Verwenden Sie ein Antifade-Eindeckmedium mit 4'6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), um die Proben zu montieren. Bewahren Sie die Abschnitte im Dunkeln auf und fotografieren Sie sie so schnell wie möglich.
- Führen Sie eine Fluoreszenzmikroskopie mit einer Digitalkamera durch, um die Abschnitte zu untersuchen und zu fotografieren und positive Zellen in den interessierenden Regionen (ROIs) zu zählen.
- Doppelte Kennzeichnung und Analyse von Calcein und Alizarinrot
- Analyse der Osteoklastogenese
- Färbung der Tartrat-resistenten sauren Phosphatase (TRAP)
- Wählen Sie geeignete Paraffinabschnitte aus. Wachs und rehydrieren Sie die Schritte 7.2.2.1-7.2.2.3.
- Frische Färbelösung mit dem TRAP-Färbekit nach Herstellerangaben zubereiten und auf 37 °C vorheizen.
- Zu jeder Probe 30-50 μl Färbelösung geben und bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer 20-30 Minuten inkubieren. Kontrollieren Sie alle 5 Minuten, bis unter dem Lichtmikroskop rote mehrkernige Osteoklasten zu sehen sind. Stoppen Sie die Reaktion mit ddH2O.
- 30 s lang in Hämatoxylinlösung einfärben und 1 Minute lang in 1%ige Ammoniaklösung eintauchen, um eine stabile blaue Farbe zu erzielen. Unter langsam fließendem Leitungswasser abspülen.
- Montieren Sie die Abschnitte mit Deckgläsern aus neutralem Balsam und trocknen Sie sie über Nacht.
- Nehmen Sie Fotos unter einem Mikroskop auf und zählen Sie die Anzahl der TRAP-positiven Zellen mit mehr als drei Kernen, gemäß unserem vorherigen Protokoll30.
- Immunfluoreszenz: Verwenden Sie Cathepsin K (CTSK)-Antikörper in der empfohlenen Konzentration für die Immunfluoreszenz und befolgen Sie das in Abschnitt 7 beschriebene Protokoll.
- Färbung der Tartrat-resistenten sauren Phosphatase (TRAP)
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Representative Results
Unter Verwendung dieses Protokolls haben wir ein induzierbares osteoblastenspezifisches Stat3-Knockout-Mausmodell (Stat3Col1α2ERT2) etabliert, um die Auswirkungen der STAT3-Deletion auf den kieferorthopädischen, kraftgetriebenen alveolären Knochenumbau zu untersuchen (Abbildung 1A,B). Die STAT3-Deletion in Osteoblasten wurde durch Immunfluoreszenzfärbung des Alveolarknochens bestätigt (Abbildung 1C).
Die Stereomikroskopie zeigte, dass der OTM-Abstand von WT-Mäusen auf d4, d7 und d10 zunahm. Bei Stat3Col1α2ERT2-Mäusen war die OTM-Distanz jedoch reduziert (Abbildung 2B). Dieses Phänomen wurde auch durch die Mikro-CT-Analyse von d10 bestätigt, was darauf hindeutet, dass die osteoblastische Stat3-Deletion die OTM verlangsamt (Abbildung 2C).
Für die histologische Analyse wurde der Bereich, der sich innerhalb von drei Wurzeln von M1 im Querschnitt am Oberkieferknochen befindet, als ROI definiert, was die Gesamtsituation des alveolären Knochenumbaus zeigt (Abbildung 3A). Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung und die OPN-Immunfluoreszenz-Färbung zeigten den gesamten Alveolarknochen der ROI (Abbildung 3B,C).
Für die osteogene Analyse zeigte die Markierung von Alizarinrot und Calcein, dass die kieferorthopädische Kraft die mineralische Appositionsrate (MAR) des Alveolarknochens bei WT-Mäusen erhöhte, aber die MAR in der OTM-Gruppe von Stat3Col1α2ERT2-Mäusen im Vergleich zu den WT-Mäusen reduziert war (Abbildung 4A). Darüber hinaus zeigte die Immunfluoreszenzfärbung, dass die Anzahl der OPN+-Osteoblasten unter kieferorthopädischer Kraft zunahm, aber es gab weniger OPN+-Osteoblasten in der OTM-Gruppe von Stat3Col1α2ERT2-Mäusen als in den WT-Mäusen (Abbildung 4B). Für die osteoklastogene Analyse zeigte die TRAP-Färbung, dass unter kieferorthopädischer Kraft die Anzahl der Osteoklasten in WT-Mäusen zunahm, aber es gab weniger Osteoklasten in der OTM-Gruppe von Stat3Col1α2ERT2-Mäusen als in den WT-Mäusen (Abbildung 4C). Dieses Phänomen wurde auch durch die Immunfluoreszenzfärbung von CTSK bestätigt (Abbildung 4D). Diese Ergebnisse zeigten, dass ein osteoblastischer Stat3-Mangel die Aktivität von Osteoblasten und Osteoklasten als Reaktion auf kieferorthopädische Kraft und beeinträchtigten Knochenumbau während der Zahnbewegung reduzierte.
Abbildung 1: Illustration der Generierung eines induzierbaren Osteoblasten-spezifischen Stat3-Knockout-Mausmodells. (A) Schematische Darstellung des Stat3-Knockouts in Col1α2-exprimierenden Osteoblasten, die durch Tamoxifen induziert wurden (links). Das Schema des Experiments: 6 Wochen alten männlichen Wildtyp- und Stat3Col1ERT2-Mäusen wurde TA (100 mg·kg-1·bw) alle 2 Tage ab einer Woche vor der OTM-Modellkonstruktion verabreicht und nach der OTM für die Analyse auf d4, d7 und d10 geopfert (rechts). (B) Hybridisierungsfortschritt von induzierbaren Osteoblasten-spezifischen Stat3-Knockout-Mäusen. (C) Doppelte Immunfluoreszenzfärbung von STAT3 und OPN im Alveolarknochen von WT- und Stat3Col1ERT2-Mäusen auf d10 nach OTM und die Quantifizierung von doppelpositiven Zellen auf Nicht-OTM-Seiten und OTM-Seiten. n = 5; Maßstabsbalken = 50 μm. Diese Abbildung stammt aus Gong et al. 26. Abkürzungen: STAT3 = Signalwandler und Aktivator der Transkription 3; Col1α = Kollagen 1-alpha; TA = Tamoxifen; WT = Wildtyp; OTM = kieferorthopädische Zahnbewegung; OPN = Osteopontin; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Osteoblastischer Mangel von Stat3 verlangsamte die kieferorthopädische Zahnbewegung (A) Die schematische Darstellung des OTM-Modells in vivo. Die Feder ligierte zwischen den Schneidezähnen und dem ersten Molaren (M1) und induzierte die kieferorthopädische Kraft, M1 in Richtung des mesialen Kammes zu bewegen. (B) Der OTM-Abstand von d0, d4, d7 und d10 nach OTM bei WT-Mäusen und Stat3Col1α2ERT2-Mäusen. (C) Repräsentative Bilder von Nicht-OTM-Seiten und OTM-Seiten in WT- und Stat3-Col1α2ERT2-Mäusen auf d10 nach OTM mittels Mikro-CT. n = 5. Maßstabsbalken = 1 mm (B), 500 μm (C). Diese Abbildung stammt von Gong et al.26. Abkürzungen: STAT3 = Signalwandler und Aktivator der Transkription 3; Col1α = Kollagen 1-alpha; WT = Wildtyp; OTM = kieferorthopädische Zahnbewegung; SAG = sagittale Ebene. Gestrichelte Kurven zeigen den OTM-Abstand an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Illustration der Regionen von Interesse . (A) Schematische Darstellung der ROI-Regionen. Der gepunktete Bereich, der sich innerhalb von drei Wurzeln von M1 im Querschnitt der Oberkiefer befindet, wurde als ROI ausgewählt. Zu den drei Wurzeln von M1 gehören die mesiobukkale Wurzel, die distobukkale Wurzel und die palatinale Wurzel. (B) HE-Färbung des gesamten Alveolarknochens von M1 bei Mäusen. (C) Immunfluoreszenzfärbung von OPN im gesamten Alveolarknochen von M1 bei Mäusen. Maßstabsbalken = 200 μm (B), 100 μm (C). Diese Abbildung stammt von Gong et al.26. Abkürzungen: ROIs = Regions of Interest; MB = mesiobukkale Wurzel; DB = distobukkale Wurzel; P = Gaumenwurzel; HE = Hämatoxylin-Eosin; OPN = Osteopontin; PDL = parodontales Ligament. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Osteoblastischer Mangel an Stat3 beeinträchtigte die kieferorthopädisch kraftinduzierte Knochenbildung und -resorption . (A) Sequentielle Fluorochrommarkierung durch Calcein und Alizarinrot S in WT- und Stat3Col1α2ERT2-Mäusen während der OTM und Quantifizierung der Mineralappositionsraten. n = 5. (B) Immunfluoreszenzfärbung und Quantifizierung von OPN+-Zellen im Alveolarknochen auf d10 nach OTM in WT- und Stat3Col1α2ERT2-Mäusen. n = 5. (C) TRAP-Färbung und Quantifizierung von TRAP-positiven Zellen im Alveolarknochen auf d4 nach OTM in WT- und Stat3-Col1α2ERT2-Mäusen. n = 5. (D) Immunfluoreszenzfärbung und Quantifizierung von CTSK+-Zellen im Alveolarknochen auf d4 nach OTM in WT- und Stat3-Col1α2ERT2-Mäusen. n = 5. Maßstabsbalken = 10 μm (A), 50 μm (B-D). Diese Abbildung stammt von Gong et al.26. Abkürzungen: STAT3 = Signalwandler und Aktivator der Transkription 3; Col1α = Kollagen 1-alpha; WT = Wildtyp; OTM = kieferorthopädische Zahnbewegung; OPN = Osteopontin; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; TRAP = Tartrat-resistente saure Phosphatase; MAR = mineralische Appositionsraten; CTSK = Cathepsin K. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Da Zahnfehlstellungen zu den häufigsten oralen Erkrankungen gehören, die die Atmung, das Kauen, das Sprechen und sogar das Aussehen beeinträchtigen, steigt die Nachfrage nach Kieferorthopädie von Tag zu Tag, wobei die Inzidenz laut einer früheren epidemiologischen Umfrage von 70 % auf 93 % steigt31,32. Wie der alveoläre Knochenumbau beschleunigt werden kann, um die Effizienz der kieferorthopädischen Behandlung sicher zu steigern, ist zu einem heißen Thema in diesem Bereich geworden. Daher ist es notwendig, den Mechanismus des alveolären Knochenumbaus zu klären, der durch OTM angetrieben wird. In früheren Studien verwendeten die Forscher die In-vivo-Injektion von Medikamenten, um den Mechanismus von OTM in Tiermodellenzu untersuchen 21,33, was einfach und leicht war, aber es war schwierig, den Einfluss von Medikamenten auf die Zellen anderer Systeme auszuschließen. Daher ist es dringend notwendig, den Mechanismus des Knochenumbaus unter kieferorthopädischer Kraft in vivo zu untersuchen.
In den letzten Jahren wurden Gen-Knockout-Mäuse weit verbreitet und bieten eine solide Grundlage für die Untersuchung der Genfunktion und die Erforschung therapeutischer Ziele34. Unter diesen Techniken war die Knockout-Technologie des gesamten Gens der früheste Ansatz. Das Adrb2-/- adrenerge Rezeptor (Adrb2) Knockout-Mausmodell wurde verwendet, um die Rolle des sympathischen Nervensystems beim alveolären Knochenumbau während der OTM35 zu untersuchen. Mäuse mit totalem Gen-Knockout können jedoch in einigen Fällen zu embryonaler Letalität führen, was die Untersuchung der Genfunktion behindert. Daher wurden konditionale Knockout-Mäuse entwickelt, die auf ein Gen in bestimmten Zelltypen abzielen. Da die Forschung im Zusammenhang mit dem Umbau des Alveolarknochens jedoch oft zeitkritisch ist, ist es daher notwendig, die Veränderungen des Alveolarknochens zu bestimmten Zeitpunkten nach der Modellierung zu beobachten.
Induzierbare konditionelle Gen-Knockout-Mäuse haben die doppelten Vorteile der zeitlichen und räumlichen Kontrolle der DNA-Rekombination und der Gewebespezifität, und der Gen-Knockout kann zu bestimmten Zeitpunkten und in bestimmten Geweben durch die Anwendung von Medikamenten oder Hormonen erreicht werden, die den Forschungsanforderungen besser gerecht werden können. Darüber hinaus ist STAT3 ein Transkriptionsfaktor, der in Knochen und anderen Geweben weit verbreitet ist und die Funktionen der Regulierung von Zellproliferation, Differenzierung, Apoptose sowie Immun- und anderen wichtigen Funktionen hat25. Wir berichteten bereits, dass die Knochenmineraldichte von nicht-induzierten Osteoblasten-spezifischen Stat3-Knockout-Mäusen reduziert war28, was darauf hindeutet, dass nicht-induzierte bedingte Stat3-Knockout-Mäuse nicht für die mechanistische Untersuchung des alveolären Knochenumbaus geeignet sind, die den Einfluss der Entwicklung ausschließen muss.
Daher haben wir in dieser Studie Tamoxifen-induzierbare Osteoblasten-spezifische Stat3-Gen-Knockout-Mäuse, Stat3Col1α2ERT2, durch den Einsatz einer induzierbaren bedingten Gen-Knockout-Technologie auf der Grundlage des Cre/loxP-Systems erzeugt, die zeitlich und räumlich kontrollierbar ist und sich besser für die Untersuchung des Mechanismus des alveolären Knochenumbaus eignet und eine weitere Untersuchung der Funktion spezifischer Zellen und Gene in Kombination mit der Verfolgung von Abstammungslinien ermöglicht. Vor der Induktion von Tamoxifen gab es keinen offensichtlichen Unterschied zwischen Stat3Col1α2ERT2 und Wildtyp-Mäusen und nichts Besonderes in der Zucht. Wir haben bereits herausgefunden, dass die induzierbare Deletion von Stat3 in Col1α2+-Osteoblasten die Knochenbildung beeinträchtigt und die Knochenmasse bei erwachsenen Mäusen reduziert28. In dieser Studie nahm der Knochenstoffwechsel von Stat3Col1α2ERT2-Mäusen in Nicht-OTM-Gruppen ab, was mit den vorherigen Ergebnissen übereinstimmte. Da der Knochenstoffwechsel der OTM-Gruppe als Reaktion auf die kieferorthopädische Kraft signifikanter abnahm, konnte davon ausgegangen werden, dass Stat3 eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Knochenstoffwechsels unter mechanischer Kraft spielte. Wir untersuchten den Mechanismus des Knochenumbaus, der durch Stat3 reguliert wird. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass Stat3 die Osteoblastendifferenzierung direkt fördern konnte 28,29 und die Osteoklastendifferenzierung beeinflusste, indem es die Wechselwirkung zwischen Osteoblasten und Osteoklasten durch die Modulation der Mmp3-Transkription regulierte 29.
In diesem Protokoll wählten wir den Bereich, der sich innerhalb von drei Wurzeln von M1 im Querschnitt am Oberkieferknochen von Mäusen befindet, als ROI aus, um den alveolären Knochenumbau zu bewerten. In diesem Bereich ist die Analyse des Alveolarknochens näher an der von Röhrenknochen, bei denen die Aktivität der Osteogenese und der Osteoklastogenese in derselben Region analysiert werden, anstatt der traditionellen Methode zur Analyse der Eigenschaften verschiedener Seiten. Darüber hinaus sollten nach der klassischen Hypothese zwei Medikamente mit gegensätzlicher Wirkung auf die Druck- bzw. Zugseite aufgetragen werden, um die Zahnbewegungsgeschwindigkeit zu beschleunigen. Diese Methode lieferte eine theoretische Grundlage für die Überwindung dieser Engpässe. In diesem OTM-Modell wurde die Größe der kieferorthopädischen Kraft mit Hilfe eines Dynamometers gemessen. Die Kraft würde jedoch mit der Verringerung des Abstands zwischen dem ersten Molaren und den Schneidezähnen etwas gedämpft. Daher ist es notwendig, ein standardisiertes mechanisches System zu etablieren, um eine konstantere und stabilere kieferorthopädische Kraft zu erzeugen.
Innerhalb des Protokolls gibt es einige kritische Schritte, die beachtet werden sollten. Zunächst sollten bei der Konstruktion des OTM-Modells der erste Molar und der erste Schneidezahn fest ligiert werden, um das Versagen der Krafteinwirkung durch Dislokation zu vermeiden. Zweitens muss auf die Richtung der Kraft geachtet werden, und die horizontale Kraft sollte auf den ersten Backenzahn ausgeübt werden, um eine Zahnextraktion durch die Anwendung der vertikalen Kraft zu vermeiden. Schließlich sollte beim Einbetten die Orientierung der Probe entsprechend dem Zielquerschnitt bestimmt werden, und die Querschnitte sollten rechtzeitig beobachtet werden, um die Ausrichtung anzupassen, um ideale Querschnitte zu erhalten.
Zusammenfassend stellen wir Protokolle für ein induzierbares, spezifisches Gen-Knockout-Mausmodell der OTM zur Verfügung, das den Umbau des alveolären Knochens zu verschiedenen Zeitpunkten zeigt. Wir werden dies weiter nutzen, um die Funktion bestimmter Zellen und Gene in Kombination mit der Verfolgung von Abstammungslinien zu untersuchen. Anschließend haben wir ein dynamisches und zellspezifisches Muster in vivo im Bereich der OTM-Mechanismusforschung erstellt, das den Nachweis für die Kieferorthopädie in der Klinik liefert. Darüber hinaus liefert diese Studie detaillierte Protokolle für die Konstruktion eines OTM-Modells, das einen schnellen Knochenumbau durch Stimulation von Osteoblasten und Osteoklasten ermöglicht und ein ideales Modell für die Untersuchung des Knochenumbaus als Reaktion auf mechanische Kraft darstellt. Darüber hinaus beschreiben wir Methoden zur Analyse des alveolären Knochenumbaus während der OTM, um eine neue Strategie für die Untersuchung der mechanischen Biologie des Skeletts bereitzustellen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949) unterstützt. die Natural Science Foundation of Shanghai (21ZR1436900, 22ZR1436700); das Programm des Shanghai Academic/Technology Research Leader (20XD1422300); Klinischer Forschungsplan des SHDC (SHDC2020CR4084); der interdisziplinäre Forschungsfonds des Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYJC201902, JYJC202116); das Innovationsforschungsteam der High-Level Local Universities in Shanghai (SSMUZLCX20180501); Der Forschungsdisziplinfonds Nr. KQYJXK2020 vom Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine und College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University; Ursprüngliches Explorationsprojekt des Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYYC003); Zweihundert-Talente-Projekt der Medizinischen Fakultät der Shanghai Jiao Tong Universität; das kooperative Forschungsprojekt des Instituts für Biomaterialien und regenerative Medizin Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (2022LHB02); das Projekt der Biobank des Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (YBKB201909, YBKB202216).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P1020 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1101 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Anti-CTSK antibody | Santa Cruz | sc-48353 | |
| Anti-OPN antibody | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | AF808 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Closed-coil springs | Innovative Material and Devices, Shanghai, China | CS1006B | |
| Col1α2CreERT2 mice | A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. | ||
| Dexmedetomidine hydrochloride | Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site | ||
| EDTA | Beyotime Biotechanology | ST069 | |
| Embedding tanks | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 80106-1100-16 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092183 | |
| ImageJ software | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| Mounting medium with DAPI | Beyotime Biotechanology | P0131 | |
| Mouse dissection platform | Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. | HK105 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| Primers for genotyping | Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC | ||
| Protease K | Sigma-Aldrich | 539480 | |
| Self-curing restorative resin | 3M ESPE, St. Paul, MN, USA | 712-035 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Tris-HCl | Beyotime Biotechanology | ST780 | |
| Universal tissue fixative | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1105 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 | |
| Zoletil | VIRBAC |
References
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