Summary
Deze studie biedt een protocol voor het gebruik van induceerbare osteoblast-lijnspecifieke Stat3-knock-outmuizen om botremodellering onder orthodontische kracht te bestuderen en beschrijft methoden voor het analyseren van alveolaire botremodellering tijdens orthodontische tandbeweging, waardoor licht wordt geworpen op de mechanische biologie van het skelet.
Abstract
Het alveolaire bot, met een hoge omloopsnelheid, is het meest actief remodellerende bot in het lichaam. Orthodontische tandbeweging (OTM) is een veelvoorkomend kunstmatig proces van alveolaire botremodellering als reactie op mechanische kracht, maar het onderliggende mechanisme blijft ongrijpbaar. Eerdere studies zijn niet in staat geweest om het precieze mechanisme van botremodellering in enige tijd en ruimte te onthullen vanwege beperkingen in diermodelgerelateerde beperkingen. De signaaltransducer en activator van transcriptie 3 (STAT3) is belangrijk in het botmetabolisme, maar de rol ervan in osteoblasten tijdens OTM is onduidelijk. Om in vivo bewijs te leveren dat STAT3 deelneemt aan OTM op specifieke tijdstippen en in bepaalde cellen tijdens OTM, genereerden we een tamoxifen-induceerbaar osteoblast-lijnspecifiek Stat3 knock-out muismodel, oefenden we orthodontische kracht uit en analyseerden we het alveolaire botfenotype.
Microcomputertomografie (Micro-CT) en stereomicroscopie werden gebruikt om toegang te krijgen tot OTM-afstand. Histologische analyse selecteerde het gebied binnen drie wortels van de eerste kies (M1) in de dwarsdoorsnede van het maxillaire bot als het interessegebied (ROI) om de metabole activiteit van osteoblasten en osteoclasten te evalueren, wat het effect van orthodontische kracht op alveolair bot aangeeft. Kortom, we bieden een protocol voor het gebruik van induceerbare osteoblast-afstammingsspecifieke Stat3-knock-outmuizen om botremodellering onder orthodontische kracht te bestuderen en methoden te beschrijven voor het analyseren van alveolaire botremodellering tijdens OTM, waardoor een nieuw licht wordt geworpen op de mechanische biologie van het skelet.
Introduction
Het is algemeen bekend dat bot gedurende het hele leven voortdurend wordt gereconstrueerd, als reactie op mechanische krachten volgens de wet van Wolff 1,2. Passende mechanische stimulatie, zoals zwaartekracht en dagelijkse lichaamsbeweging, behoudt de botmassa en -sterkte en voorkomt botverlies door zowel osteoblasten als osteoclasten te stimuleren. Osteoclasten, verantwoordelijk voor botresorptie 3,4,5,6,7, en osteoblasten, verantwoordelijk voor botvorming 8,9,10, handhaven de bothomeostase en functioneren gezamenlijk in het biologische proces van botremodellering. Daarentegen, bij afwezigheid van belastingsprikkels, zoals bij astronauten onder langdurige microzwaartekracht, lijden botten aan een verlies van 10% botmineraaldichtheid, waardoor het risico op osteoporose toeneemt11,12. Bovendien zijn niet-invasieve en gemakkelijke mechanische therapieën, waaronder orthodontie en afleidingsosteogenese, naar voren gekomen als behandelingen voor botziekten13,14. Dit alles heeft aangetoond dat mechanische kracht een cruciale rol speelt bij het handhaven van de kwaliteit en kwantiteit van botten. Recente studies analyseerden over het algemeen botremodellering als reactie op mechanische belasting met behulp van tijdrovende modellen zoals loopwiel- en staartophangingstests, die meestal 4 weken of langer duurden om krachtbelasting of -ontlading te simuleren15,16. Daarom is er vraag naar een handig en efficiënt diermodel voor het bestuderen van botremodellering aangedreven door krachtbelasting.
Het alveolaire bot is het meest actief op het gebied van botremodellering, met een hoge omloopsnelheid17. Orthodontische tandbeweging (OTM), een veel voorkomende behandeling voor malocclusie, is een kunstmatig proces van alveolaire botremodellering als reactie op mechanische kracht. OTM, dat snelle botremodellering induceert18, is echter ook een tijdbesparende manier om de effecten van mechanische kracht op botremodellering te bestuderen in vergelijking met andere modellen met een lange experimentele periode. Daarom is OTM een ideaal model om botremodellering onder mechanische stimuli te bestuderen. Het is opmerkelijk dat het mechanisme van alveolaire botremodellering vaak tijdgevoelig is en dat het noodzakelijk is om de veranderingen in alveolaire botremodellering op bepaalde tijdstippen na modellering te observeren. Met de dubbele voordelen van temporele en ruimtelijke controle van DNA-recombinatie en weefselspecificiteit, is een induceerbaar conditioneel gen-knock-outmuismodel een geschikte keuze voor OTM-studies.
Conventioneel is OTM-gemedieerde alveolaire botremodellering onderverdeeld in spanningszones met botvorming en drukzones met botresorptie 19,20,21, wat gedetailleerder is maar moeilijk te reguleren. Verder rapporteerden Yuri et al. dat de tijd van botvorming bij OTM verschilde aan de spannings- en compressiezijde22. Bovendien had een eerdere studie aangetoond dat de eerste kies een brede remodellering van het maxillaire alveolaire bot kon initiëren onder orthodontische kracht, die niet beperkt was tot de spannings- en drukzones23. Daarom selecteerden we het gebied binnen drie wortels van M1 in de dwarsdoorsnede van het maxillaire bot als het interessegebied (ROI) en beschreven we methoden om de activiteit van osteoblasten en osteoclasten in hetzelfde gebied te beoordelen om alveolaire botremodellering onder OTM te evalueren.
Als nucleaire transcriptiefactor is bewezen dat signaaltransducer en activator van transcriptie 3 (STAT3) cruciaal is in bothomeostase24,25. Eerdere studies hebben een lage botmineraaldichtheid en terugkerende pathologische fracturen gemeld bij Stat3-mutante muizen26,27. Onze vorige studie toonde aan dat deletie van Stat3 in Osx+ osteoblasten craniofaciale malformatie en osteoporose veroorzaakte, evenals spontane botbreuken28. Onlangs leverden we in vivo bewijs met een induceerbaar osteoblast-specifiek Stat3-deletiemuismodel (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, hierna Stat3Col1α2ERT2 genoemd) dat STAT3 van cruciaal belang is bij het mediëren van de effecten van orthodontische kracht die alveolaire botremodellering aandrijft29. In deze studie bieden we methoden en protocollen voor het gebruik van induceerbare osteoblast-lijnspecifieke Stat3-knock-outmuizen om botremodellering onder orthodontische kracht te bestuderen en methoden te beschrijven voor het analyseren van alveolaire botremodellering tijdens OTM, waardoor licht wordt geworpen op de mechanische biologie van het skelet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden met dieren zijn goedgekeurd door de ethische commissie van het Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (nr. 82101048).
1. Vaststellen van induceerbare osteoblast afstammingsspecifieke Stat3 knock-out muizen
OPMERKING: Stat3 fl/fl-muizen werden commercieel verkregen; de Col1α2CreERT2stam was een geschenk (zie de Tabel met Materialen voor alle details). Alle dieren kregen gestandaardiseerd laboratoriumpelletvoer en -water en standaard laboratoriumomgevingsomstandigheden (kamertemperatuur van 22 °C tot 26 °C en luchtvochtigheid van 50%-55%).
- Zet een geslachtsrijpe mannelijke muis met twee vrouwelijke muizen in dezelfde kooi. Controleer na 18 dagen elke dag op pasgeborenen. Breng zwangere vrouwtjesmuizen naar een lege kooi en houd ze indien nodig alleen. Zet mannelijke muizen in andere verschillende kweekkooien als de vrouwelijke muizen niet binnen 30 dagen drachtig zijn.
- Genereer Stat3fl/+; Col1α2 CreERT2-muizen door Stat3 fl/fl-muizen te hybridiseren met Col1α2CreERT2-muizen; onderhoud al deze muizen op de C57BL/6 achtergrond. Verzamel staartpunten van 2-5 mm voor genotypering en houd het mannetje Stat3fl/+; Col1α2CreERT2 muizen tot ze geslachtsrijp zijn (F1).
- Hybridiseren 6 weken oude reu Stat3fl/ +; Col1α2CreERT2 muizen met vrouwelijke Stat3 fl/fl muizen. Verzamel staartpunten van 2-5 mm wanneer muizen 2 weken oud zijn voor genotypering, en houd het mannetje Stat3 fl/fl; Col1α2 CreERT2(Stat3Col1α2ERT2) muizen totdat ze geslachtsrijp zijn (F2).
- Hybridiseren 6 weken oude reu Stat3 fl/ fl; Col1α2CreERT2-muizen met vrouwelijke Stat3 fl/fl-muizen (F3). Verzamel staartpunten van 2-5 mm wanneer muizen 2 weken oud zijn voor genotypering, en gebruik de jongere muizen van hetzelfde genotype om oudere fokmuizen te vervangen wanneer dat nodig is (F3+N).
OPMERKING: Het voortplantingsvermogen van muizen neemt af na de leeftijd van 8 maanden, dus de muizen in de fokkooien moeten zorgvuldig worden gecontroleerd en indien nodig worden vervangen. Bovendien moet, overeenkomstig de experimentele voorschriften, het aantal fokkooien op passende wijze worden verhoogd om het uitsterven van de doelgenmuizen te voorkomen.
2. Induceerbare deletie van Stat3 in osteoblasten die Col1α2 tot expressie brengen door tamoxifen
- Los tamoxifen op in maïsolie tot 20 mg/ml in een centrifugebuisje en bescherm tegen licht door het in folie te wikkelen. Plaats de met folie bedekte centrifugebuis op een roterende mixer en meng op kamertemperatuur tot het volledig is opgelost.
OPMERKING: Tamoxifen werd commercieel verkregen en in het donker bewaard bij 4 °C. - Selecteer tien mannelijke muizen van 6 weken oud en verdeel ze in Stat3 fl/fl en Stat3 Col1α2ERT2-groepen met vijf muizen in elke groep. Dien tamoxifen (100 mg·kg-1·bw) om de 2 dagen toe gedurende 1 week via intraperitoneale injectie.
3. Orthodontisch tandbewegingsmodel (OTM)
- Bereid een gesteriliseerd plastic muisdissectieplatform voor als operatietafel om de muizen te immobiliseren.
OPMERKING: De muisdissectietafel werd commercieel verkregen en bestond uit vier verstelbare rubberen palen en een metalen staaf voor het immobiliseren van de muizen. Gebruik tijdens de hele procedure steriele instrumenten en gereedschappen. - Bevestig een elastische band aan elke rubberen paal voor fixatie van de ledematen.
- Bind een elastische band tussen de twee bovenste rubberen palen; bind een draad aan de elastische band om de onderste snijtanden vast te houden; en bind nog een draad aan de metalen staaf om de bovenste snijtanden vast te houden.
- Verdoof mannelijke muizen van 7 weken oud met 0,1 ml oplossing van dexmedetomidinehydrochloride (0,1 mg·kg-1·bw) en zoletil (tiletamine hydrochloride voor 20 mg·kg-1·bw en zolazepamhydrochloride voor 20 mg·kg-1·bw) opgelost in zoutoplossing door intraperitoneale injectie voorafgaand aan de operatie. Zorg ervoor dat de muizen tijdens de operatie onder de juiste verdoving staan.
OPMERKING: Let op de effectieve gebruiksdatum van medicijnen en gebruik geen verlopen medicijnen. - Bevestig dat de muizen onder de juiste narcose zijn door met de vingers in de tenen van de achterpoten te knijpen.
OPMERKING: Als de muizen niet reageren op de test, betekent dit dat ze bewusteloos zijn en dat de anesthesie de gewenste diepte heeft bereikt. Op dat moment zijn de muizen in een staat van ontspanning van de ledematenspieren, met een soepele ademhaling en hartslag, en kan de operatie worden gestart. - Gebruik dierenartszalf op de ogen van de muizen om uitdroging te voorkomen en plaats de verdoofde muis in rugligging op de operatietafel. Gebruik vier elastische banden op de rubberen palen om de ledematen vast te zetten, een draad die aan de metalen staaf is bevestigd om de bovenste snijtanden vast te houden en een andere die is bevestigd aan een elastische band tussen de twee bovenste rubberen palen om over de onderste snijtanden te haken om de onderkaak open te houden.
- Bereid gesloten spiraalveren (0,25 mm draaddikte, 0,76 mm diameter, 1 mm lengte) voor op orthodontische kracht.
NOTITIE: Knip acht veerdraden af voor elke muis. Vier draden van 1 mm lengte in het midden voor krachtoverbrenging en twee draden aan elk uiteinde voor ligaturing met behulp van stalen ligatuurdraad. - Maak het ene uiteinde van de veer voorbereid op de maxillaire linker eerste kies. Bind het andere uiteinde aan de centrale snijtand vast met een stalen ligatuurdraad van 0,1 mm, versterkt met lichtuithardende restauratiehars na het aanbrengen van lijm op de snijtanden met het wattenstaafje om een stabiele kracht van 10 g te genereren, gemeten met behulp van een dynamometer.
- Na het voltooien van de operatie, plaatst u de muizen in een kooi met anderen van dezelfde stam in herstel, of plaatst u elke muis alleen in een lege kooi. Zorg ervoor dat de muizen niet onbeheerd worden achtergelaten totdat ze 2-4 uur na de operatie weer voldoende bij bewustzijn zijn om sternale lighouding te behouden. Geef de muizen de komende dagen een zacht dieet en observeer ze regelmatig om er zeker van te zijn dat er geen complicaties optreden en om de mate van postoperatieve pijn vast te stellen; Dien indien nodig pijnstillers toe.
OPMERKING: Muizen die een operatie hebben ondergaan, mogen niet worden teruggebracht naar het gezelschap van andere muizen totdat ze volledig hersteld zijn. Plaats postoperatieve muizen niet in herstel met muizen die niet verdoofd zijn. Muizen moeten warm worden gehouden tijdens het herstel. - Controleer het orthodontische apparaat elke dag en sluit experimentele muizen met losraken uit.
4. Monsterneming
- Euthanaseer de muizen op drie verschillende tijdstippen via cervicale dislocatie: 4 dagen (d4), 7 dagen (d7) en 10 dagen (d10) na de start van OTM.
- Gebruik een oogheelkundige schaar om de huid verticaal van het cervicale gebied af te snijden en scheid vervolgens het hoofd van het lichaam met de hele huid van het hoofd ontleed.
- Snijd de huid en buccinatorspieren af van de bilaterale angulus oris tot het achterste deel van de onderkaak. Koppel de buccale spieren en de pezen die aan de coracoïden zijn bevestigd volledig los om de onderkaak te verwijderen en trim extra botten om volledige maxillae te verkrijgen. Verwijder vervolgens het bot achter de bilaterale derde kiezen en scheur het palatinale slijmvlies af. Koppel ten slotte het orthodontische apparaat los en snijd het bot tussen de snijtanden langs de mediane palatinale hechting af om het alveolaire bot van de rechter- en linkerkant te verkrijgen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het gebied van de snijtanden tot de derde kies aan beide zijden intact blijft.
5. Voorbereiding voor paraffinesectie
- Fixatie: Dompel het geoogste alveolaire bot gedurende 48 uur onder in 4% paraformaldehyde en knip met een oogheelkundige schaar in de zuurkast voor secties 6 en 7.
- Ontkalking: Was de monsters voorzichtig met 1x PBS gedurende 3 x 10 min. Ontkalk de monsters in universeel weefselfixeermiddel (pH 8,0), vervangen door een verse oplossing om de 2 dagen, gedurende 5 weken totdat de botten gemakkelijk kunnen worden gepenetreerd door een naaldpunt.
- Uitdroging: Was de monsters in 1x PBS gedurende 3 x 10 minuten en dompel ze vervolgens achtereenvolgens onder in 95% ethanol, 100% ethanol en xyleen, gedurende 2 x 1 uur per oplossing.
- Dompel de monsters gedurende 30 minuten onder in een 1:1 mengsel van xyleen en paraffine en vervolgens een nacht in paraffine bij 65 °C.
- Inbedding: Kies geschikte inbeddingstanks. Plaats het alveolaire bot gelijkmatig met de tanden op hetzelfde niveau. Haal de monsters uit de inbeddingstank en breng ze over naar een vriezer van -20 °C en nummer ze wanneer de paraffine volledig is afgekoeld en stevig is.
- Snijd met behulp van een microtoom twintig tot 44 μm dikke secties continu in het dwarsvlak en drijf op water van 37 °C. Plak de secties op microscoopglaasjes en bak ze een nacht op 42 °C.
6. OTM-afstandsmeting
- Fotografeer monsters van drie tijdstippen verticaal vanaf het occlusale vlak door middel van stereomicroscopie.
- Scan het alveolaire bot met een Micro-CT-scanner. Reconstrueer 3D-beelden van het maximale sagittale vlak van het maxillaire alveolaire bot, waarin drie kiezen volledig zichtbaar zijn, met behulp van de ondersteunende software van de scanner volgens de instructies van de fabrikant.
- Meet de OTM-afstand met behulp van ImageJ-software:
- Open de ImageJ-software en gebruik het gereedschap Rechte lijn om een lijnstuk met een bekende afstand te maken.
- Klik op Analyseren en kies Schaal instellen om de waarde van de getekende lijnafstand in te voeren in Bekende afstand en eenheden in te voeren in Lengte-eenheid.
- Trek een lijn tussen de middelpunten van de mesiale marginale richel van M2 en de distale marginale richel van M1 en klik op Meting. De resultaten die in de kolom Lengte worden weergegeven, vertegenwoordigen de OTM-afstand.
7. Histologische analyse
- Selectie van interessegebied (ROI): Definieer het alveolaire bot van de eerste kies (M1) als de ROI, precies gelegen binnen drie wortels van M1 in de dwarsdoorsnede bij het bovenkaakbeen. Dit gebied bereikt niet alleen het corticale bot van de eerste kies in de buccaal-linguale richting, maar strekt zich ook uit tot het midden van de lange as van de mesiobuccale wortel, inclusief het halve gebied tussen de distobuccale wortel en de palatinale wortel.
- Analyse van osteogenese
- Calceïne en alizarinerood dubbele etikettering en analyse
- Calceïne en alizarinerood preparaat: Los calceïne op in 2% NaHCO3-oplossing tot 1 mg/ml en alizarinerood S in H 2 O tot2mg/ml.
OPMERKING: In deze studie werden calceïne en alizarinerood commercieel verkregen. - Dien calceïne (20 mg·kg-1·bw) toe op dag 1 en alizarine rode S (40 mg·kg-1·bw) op dag 8 door middel van intraperitoneale injectie na het begin van OTM. Euthanaseer de muizen op dag 10 en oogst het alveolaire bot.
- Bereid de monsters voor en plaats ze in volgens de stappen 5.1 en 5.3-5.5. Voor meer details, zie Yang et al.30.
- Snijd met behulp van een roterende microtoom continu secties van 5 μm dik in het dwarsvlak. Plak de secties op microscoopglaasjes en monteer ze met dekglaasjes met behulp van neutrale balsem.
NOTITIE: De rest van de monsters moet met droogmiddel bij kamertemperatuur worden bewaard. - Onderzoek en fotografeer de coupes onder een fluorescentiemicroscoop en bereken de mineraalappositiesnelheid (MAR) en botvormingssnelheid (BFR/BS) volgens de eerder beschreven methode30.
- Calceïne en alizarinerood preparaat: Los calceïne op in 2% NaHCO3-oplossing tot 1 mg/ml en alizarinerood S in H 2 O tot2mg/ml.
- Immunofluorescentie
- Kies geschikte paraffinepartjes en bak 30 minuten op 65 °C.
- Dewaxing: Dompel de secties 5 minuten onder in xyleen en herhaal dit twee keer met verse xyleen, elke keer.
- Rehydratatie: Dompel de secties achtereenvolgens onder in 95% ethanol, 75% ethanol, 50% ethanol en ddH2O, elk gedurende 5 minuten.
- Was de secties voorzichtig met 1 x PBS gedurende 2 x 5 min.
- Antigeen retrieval: Dompel de coupes onder in een mengsel van Tris-HCl (0,05 M, pH 8,0), EDTA (0,01 M, pH 8,0) en protease K (10 μg/ml) in ddH2O en incubeer bij 37 °C gedurende 15 min.
- Was de secties voorzichtig met 1 x PBS gedurende 3 x 5 min.
- Blok: Verwijder extra vloeistof uit de secties en teken een cirkel rond het doelgebied met behulp van een hydrofobe stift. Om niet-specifieke binding te blokkeren, afdekken met een blokkerende buffer die 10% runderserumalbumine bevat en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.
NOTITIE: Zorg ervoor dat u de secties niet te lang droogt, om de resultaten niet te beïnvloeden. - Primaire antilichaamincubatie: Verdun het anti-osteopontine (OPN)-antilichaam met antilichaamverdunningsmiddel tot de aanbevolen concentratie en voeg 30-50 μL toe aan elk monster; incubeer bij 4 °C gedurende een nacht in een bevochtigde kamer.
NOTITIE: Zorg ervoor dat er wat water in de kamer blijft en dek deze af om te voorkomen dat de antilichaamvloeistof verdampt. - Was de secties voorzichtig met 1 x PBS gedurende 3 x 10 min.
OPMERKING: De stappen 7.2.2.10-7.2.2.12 moeten in het donker worden uitgevoerd. - Incubatie van fluorescerende secundaire antilichamen: Selecteer een geschikt fluorescerend secundair antilichaam dat overeenkomt met het primaire antilichaam en verdun het tot de aanbevolen concentratie. Voeg 30-50 μL toe aan elk monster en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was de secties voorzichtig met 1 x PBS gedurende 2 x 10 min.
- Gebruik een antifade montagemedium met 4'6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) om de preparaten te monteren. Bewaar de secties in het donker en fotografeer ze zo snel mogelijk.
- Voer fluorescentiemicroscopie uit met behulp van een digitale camera om de secties te onderzoeken en te fotograferen en positieve cellen in de interessegebieden (ROI's) te tellen.
- Calceïne en alizarinerood dubbele etikettering en analyse
- Analyse van osteoclastogenese
- Tartraatresistente zure fosfatase (TRAP) kleuring
- Selecteer geschikte paraffinesecties. Ontwaxen en rehydrateren volgens de stappen 7.2.2.1-7.2.2.3.
- Bereid verse kleuroplossing met behulp van de TRAP-kleuringsset volgens de instructies van de fabrikant en verwarm voor op 37°C.
- Voeg 30-50 μL kleuroplossing toe aan elk monster en incubeer bij 37 °C in een bevochtigde kamer gedurende 20-30 minuten. Controleer elke 5 minuten totdat rode meerkernige osteoclasten onder een lichtmicroscoop worden gezien. Stop de reactie met ddH2O.
- Tegenkleuring in hematoxyline-oplossing gedurende 30 s en onderdompelen in 1% ammoniakoplossing gedurende 1 minuut voor een stabiele blauwe kleur. Spoel af onder langzaam stromend kraanwater.
- Monteer de secties met dekglaasjes met behulp van neutraal balsem en laat ze een nacht drogen.
- Maak foto's onder een microscoop en tel het aantal TRAP-positieve cellen met meer dan drie kernen, volgens ons vorige protocol30.
- Immunofluorescentie: Gebruik cathepsine K (CTSK)-antilichamen in de aanbevolen concentratie voor immunofluorescentie en volg het protocol beschreven in rubriek 7 hierboven.
- Tartraatresistente zure fosfatase (TRAP) kleuring
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van dit protocol hebben we een induceerbaar osteoblast-lijnspecifiek Stat3 knock-out muismodel (Stat3Col1α2ERT2) opgesteld om de effecten van STAT3-deletie op orthodontische krachtgedreven alveolaire botremodellering te onderzoeken (Figuur 1A,B). Deletie van STAT3 in osteoblasten werd bevestigd door immunofluorescentiekleuring van alveolair bot (Figuur 1C).
Stereomicroscopie gaf aan dat de OTM-afstand van WT-muizen toenam op d4, d7 en d10. Bij Stat3Col1α2ERT2-muizen was de OTM-afstand echter kleiner (Figuur 2B). Dit fenomeen werd ook bevestigd door Micro-CT-analyse op d10, wat aangeeft dat osteoblastische Stat3-deletie OTM vertraagde (Figuur 2C).
Voor histologische analyse werd het gebied binnen drie wortels van M1 in de dwarsdoorsnede bij het maxillaire bot gedefinieerd als ROI, wat de algehele situatie van alveolaire botremodellering laat zien (Figuur 3A). De hematoxyline-eosinekleuring en OPN-immunofluorescerende kleuring toonden het volledige alveolaire bot van ROI (Figuur 3B,C).
Voor osteogene analyse gaven alizarinerood en calceïne-etikettering aan dat orthodontische kracht de minerale appositiesnelheid (MAR) van alveolair bot bij WT-muizen verhoogde, maar de MAR in de OTM-groep van Stat3Col1α2ERT2-muizen was verlaagd in vergelijking met de WT-muizen (Figuur 4A). Bovendien toonde immunofluorescentiekleuring aan dat het aantal OPN+ osteoblasten toenam onder orthodontische kracht, maar er waren minder OPN+ osteoblasten in de OTM-groep van Stat3Col1α2ERT2-muizen dan in de WT-muizen (Figuur 4B). Voor osteoclastogene analyse gaf TRAP-kleuring aan dat, onder orthodontische kracht, het aantal osteoclasten toenam bij WT-muizen, maar er waren minder osteoclasten in de OTM-groep van Stat3Col1α2ERT2-muizen dan in de WT-muizen (Figuur 4C). Dit fenomeen werd ook bevestigd door immunofluorescentiekleuring van CTSK (Figuur 4D). Deze resultaten toonden aan dat osteoblastische Stat3-deficiëntie de activiteit van zowel osteoblasten als osteoclasten verminderde als reactie op orthodontische kracht en verminderde botremodellering tijdens tandbeweging.
Figuur 1: Illustratie van induceerbare osteoblast lineage-specifieke Stat3 knock-out muismodelgeneratie. (A) Schematisch diagram van Stat3-knock-out in osteoblasten die Col1α2 tot expressie brengen, geïnduceerd door tamoxifen (links). Het schema van het experiment: 6 weken oude mannelijke wildtype en Stat3Col1ERT2-muizen kregen TA (100 mg·kg-1·bw) om de 2 dagen toegediend vanaf een week vóór de bouw van het OTM-model en opgeofferd voor analyse op d4, d7 en d10 na OTM (rechts). (B) Hybridisatievoortgang van induceerbare osteoblast afstammingsspecifieke Stat3 knock-out muizen. (C) Dubbele immunofluorescentiekleuring van STAT3 en OPN in het alveolaire bot van WT- en Stat3Col1ERT2-muizen op d10 na OTM en de kwantificering van dubbelpositieve cellen op niet-OTM-zijden en OTM-zijden. n = 5; schaalbalken = 50 μm. Dit cijfer komt uit Gong et al. 26. Afkortingen: STAT3 = signaaltransducer en activator van transcriptie 3; Col1α = collageen 1-alfa; TA = tamoxifen; WT = wildtype; OTM = orthodontische tandbeweging; OPN = osteopontine; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Osteoblastische deficiëntie van Stat3 vertraagde orthodontische tandbeweging (A) Het schematische diagram van het OTM-model in vivo. De veer ligeerde tussen de snijtanden en de eerste kies (M1) en induceerde orthodontische kracht om M1 naar de mesiale kam te verplaatsen. (B) De OTM-afstand van d0, d4, d7 en d10 na OTM in WT-muizen en Stat3Col1α2ERT2-muizen . (C) Representatieve beelden van niet-OTM-zijden en OTM-zijden in WT- en Stat3Col1α2ERT2-muizen op d10 na OTM door micro-CT. n = 5. Schaalbalken = 1 mm (B), 500 μm (C). Dit cijfer is afkomstig van Gong et al.26. Afkortingen: STAT3 = signaaltransducer en activator van transcriptie 3; Col1α = collageen 1-alfa; WT = wildtype; OTM = orthodontische tandbeweging; SAG = sagittaal vlak. Gestippelde curven geven de OTM-afstand aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Illustratie van de regio's van belang. (A) Schematisch diagram van de regio's met een ROI. Het gestippelde gebied binnen drie wortels van M1 in de dwarsdoorsnede van de bovenkaak werd geselecteerd als ROI. De drie wortels van M1 omvatten de mesiobuccale wortel, de distobuccale wortel en de palatinale wortel. (B) HE-kleuring van het gehele alveolaire bot van M1 bij muizen. (C) Immunofluorescerende kleuring van OPN in het gehele alveolaire bot van M1 bij muizen. Schaalbalken = 200 μm (B), 100 μm (C). Dit cijfer is afkomstig van Gong et al.26. Afkortingen: ROI's = regio's van belang; MB = mesiobuccale wortel; DB = distobuccale wortel; P = palatinale wortel; HE = hematoxyline-eosine; OPN = osteopontine; PDL = parodontaal ligament. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Osteoblastische deficiëntie van Stat3 verstoorde orthodontische krachtgeïnduceerde botvorming en -resorptie . (A) Sequentiële fluorochroom labeling door calceïne en alizarine rode S in WT en Stat3Col1α2ERT2 muizen tijdens OTM en kwantificering van minerale appositiesnelheden. n = 5. (B) Immunofluorescentiekleuring en kwantificering van OPN+-cellen in alveolair bot op d10 na OTM in WT- en Stat3Col1α2ERT2-muizen. n = 5. (C) TRAP-kleuring en kwantificering van TRAP-positieve cellen in alveolair bot op d4 na OTM in WT- en Stat3Col1α2ERT2-muizen. n = 5. (D) Immunofluorescentiekleuring en kwantificering van CTSK+-cellen in alveolair bot op d4 na OTM in WT- en Stat3Col1α2ERT2-muizen. n = 5. Schaalbalken = 10 μm (A), 50 μm (B-D). Dit cijfer is afkomstig van Gong et al.26. Afkortingen: STAT3 = signaaltransducer en activator van transcriptie 3; Col1α = collageen 1-alfa; WT = wildtype; OTM = orthodontische tandbeweging; OPN = osteopontine; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylinderol; TRAP = tartraatresistente zure fosfatase; MAR = afzettingspercentages van mineralen; CTSK = cathepsine K. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aangezien malocclusie een van de meest voorkomende mondaandoeningen is die de ademhaling, kauwen, spreken en zelfs het uiterlijk aantasten, neemt de vraag naar orthodontie met de dag toe, waarbij de incidentie stijgt van 70% naar 93% volgens een eerder epidemiologisch onderzoek31,32. Hoe de remodellering van alveolair bot kan worden versneld om de efficiëntie van orthodontische behandeling veilig te verhogen, is een hot topic geworden op dit gebied; daarom is het noodzakelijk om het mechanisme van alveolaire botremodellering aangedreven door OTM te verduidelijken. In eerdere studies gebruikten onderzoekers in vivo medicijninjectie om het mechanisme van OTM in diermodellen te bestuderen21,33, wat eenvoudig en gemakkelijk was, maar het was moeilijk om de invloed van medicijnen op de cellen van andere systemen uit te sluiten. Daarom is het hoogst noodzakelijk om het mechanisme van botremodellering onder orthodontische kracht in vivo te bestuderen.
In de afgelopen jaren zijn gen-knock-outmuizen op grote schaal gebruikt, wat een solide basis biedt voor de studie van genfunctie en de verkenning van therapeutische doelen34. Van deze technieken was de knock-outtechnologie voor hele genen de vroegste benadering. Het Adrb2-/- adrenerge receptor (Adrb2) knock-out muismodel werd gebruikt om de rol van het sympathische zenuwstelsel bij alveolaire botremodellering tijdens OTM35 te onderzoeken. Totale gen-knock-out muizen kunnen echter in sommige gevallen leiden tot embryonale letaliteit, waardoor de studie van de genfunctie wordt belemmerd. Daarom werden voorwaardelijke knock-outmuizen ontwikkeld, gericht op een gen in specifieke celtypen. Omdat onderzoek met betrekking tot alveolaire botremodellering echter vaak tijdgevoelig is, is het daarom noodzakelijk om de veranderingen in alveolair bot op specifieke tijdstippen na modellering te observeren.
Induceerbare voorwaardelijke gen-knock-outmuizen hebben de dubbele voordelen van temporele en ruimtelijke controle van DNA-recombinatie en weefselspecificiteit, en gen-knock-out kan worden bereikt op specifieke tijdstippen en specifieke weefsels door de toepassing van medicijnen of hormonen, die beter aan de onderzoeksbehoeften kunnen voldoen. Bovendien is STAT3 een transcriptiefactor die op grote schaal tot expressie komt in botten en andere weefsels en heeft het de functies van het reguleren van celproliferatie, differentiatie, apoptose en immuun- en andere belangrijke functies25. We meldden eerder dat de botmineraaldichtheid van niet-geïnduceerde osteoblast-specifieke Stat3-knock-outmuizen was verminderd28, wat suggereert dat niet-geïnduceerde conditionele Stat3-knock-outmuizen niet geschikt zijn voor de mechanistische studie van alveolaire botremodellering die de invloed van ontwikkeling moet uitsluiten.
Daarom hebben we in deze studie tamoxifen-induceerbare osteoblast-specifieke Stat3-gen-knock-outmuizen, Stat3Col1α2ERT2, gegenereerd door gebruik te maken van induceerbare conditionele gen-knock-outtechnologie op basis van het Cre/loxP-systeem, dat controleerbaar is in tijd en ruimte en meer geschikt is voor de studie van het mechanisme van alveolaire botremodellering, en om verdere studie van de functie van specifieke cellen en genen mogelijk te maken in combinatie met het traceren van afstamming. Vóór de inductie van tamoxifen was er geen duidelijk verschil tussen Stat3Col1α2ERT2 en wildtype muizen en niets bijzonders in de fokkerij. We hebben eerder gevonden dat de induceerbare deletie van Stat3 in Col1α2+ osteoblasten de botvorming verminderde en de botmassa verminderde bij volwassen muizen28. In deze studie nam het botmetabolismeniveau van Stat3Col1α2ERT2-muizen in niet-OTM-groepen af, wat consistent was met de eerdere resultaten. Bovendien, aangezien het botmetabolismeniveau van de OTM-groep significanter daalde als reactie op orthodontische kracht, zou kunnen worden aangenomen dat Stat3 een belangrijke rol speelde bij de regulatie van het botmetabolisme onder mechanische kracht. We hebben het mechanisme van botremodellering verder onderzocht, gereguleerd door Stat3. De resultaten gaven aan dat Stat3 de differentiatie van osteoblasten28,29 direct kon bevorderen en de differentiatie van osteoclasten beïnvloedde door de overspraak tussen osteoblasten en osteoclasten te reguleren door de modulatie van Mmp3-transcriptie 29.
In dit protocol selecteerden we het gebied binnen drie wortels van M1 in de dwarsdoorsnede bij het maxillaire bot van muizen als de ROI om alveolaire botremodellering te evalueren. Met dit gebied ligt de analyse van alveolair bot dichter bij die van lange botten, waarbij de activiteit van osteogenese en osteoclastogenese in dezelfde regio wordt geanalyseerd, in plaats van de traditionele methode om de kenmerken van verschillende kanten te analyseren. Bovendien moeten volgens de klassieke hypothese twee geneesmiddelen met tegengestelde effecten worden toegepast op respectievelijk de druk- en spanningszijde om de tandbewegingssnelheid te versnellen. Deze methode bood een theoretische basis voor het overwinnen van deze knelpunten. In dit OTM-model werd de grootte van de orthodontische kracht gemeten met behulp van een dynamometer. De kracht zou echter iets worden verzwakt met de verkleining van de afstand tussen de eerste kies en de snijtanden. Daarom is het noodzakelijk om een gestandaardiseerd mechanisch systeem op te zetten om een meer constante en stabiele orthodontische kracht te genereren.
Binnen het protocol zijn er enkele cruciale stappen die in gedachten moeten worden gehouden. Ten eerste moeten bij het bouwen van OTM-modellen de eerste kies en snijtand stevig worden vastgemaakt om te voorkomen dat de kracht wordt uitgeoefend door losraken. Ten tweede moet aandacht worden besteed aan de richting van de kracht en moet horizontale kracht worden uitgeoefend op de eerste kies om tandextractie veroorzaakt door de toepassing van verticale kracht te voorkomen. Ten slotte moet bij het inbedden de oriëntatie van het monster worden bepaald aan de hand van de doeldoorsnede en moeten de secties op tijd worden geobserveerd om de oriëntatie aan te passen om ideale doorsneden te verkrijgen.
Concluderend bieden we protocollen voor een induceerbaar, specifiek, gen-knock-out muismodel van OTM, dat alveolaire botremodellering op verschillende tijdstippen onthult. We zullen dit verder gebruiken om de functie van specifieke cellen en genen te bestuderen in combinatie met lineage tracing. Vervolgens hebben we in vivo een dynamisch en celspecifiek patroon opgezet op het gebied van OTM-mechanismeonderzoek, waarmee we bewijs bieden voor orthodontie in de kliniek. Bovendien biedt deze studie gedetailleerde protocollen voor het construeren van een OTM-model, dat snelle botremodellering mogelijk maakt door osteoblasten en osteoclasten te stimuleren en een ideaal model biedt voor de studie van botremodellering als reactie op mechanische kracht. Meer dan dat, we beschrijven methoden voor het analyseren van alveolaire botremodellering tijdens OTM om een nieuwe strategie te bieden voor de studie van skeletmechanische biologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); de Natuurwetenschappelijke Stichting van Shanghai (21ZR1436900, 22ZR1436700); het programma van Shanghai Academic/Technology Research Leader (20XD1422300); Klinisch onderzoeksplan van SHDC (SHDC2020CR4084); het Cross-disciplinary Research Fund van het Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYJC201902, JYJC202116); het Innovation Research Team van lokale universiteiten op hoog niveau in Shanghai (SSMUZLCX20180501); het Fonds voor Onderzoeksdiscipline nr. KQYJXK2020 van het Ninth People's Hospital, de Shanghai Jiao Tong University School of Medicine en het College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University; Origineel exploratieproject van het Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYYC003); Tweehonderd talentenproject van de Shanghai Jiao Tong University School of Medicine; het Coöperatieve onderzoeksproject van het Biomaterials and Regenerative Medicine Institute Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (2022LHB02); het project van de biobank van het Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (YBKB201909, YBKB202216).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P1020 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1101 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Anti-CTSK antibody | Santa Cruz | sc-48353 | |
| Anti-OPN antibody | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | AF808 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Closed-coil springs | Innovative Material and Devices, Shanghai, China | CS1006B | |
| Col1α2CreERT2 mice | A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. | ||
| Dexmedetomidine hydrochloride | Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site | ||
| EDTA | Beyotime Biotechanology | ST069 | |
| Embedding tanks | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 80106-1100-16 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092183 | |
| ImageJ software | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| Mounting medium with DAPI | Beyotime Biotechanology | P0131 | |
| Mouse dissection platform | Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. | HK105 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| Primers for genotyping | Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC | ||
| Protease K | Sigma-Aldrich | 539480 | |
| Self-curing restorative resin | 3M ESPE, St. Paul, MN, USA | 712-035 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Tris-HCl | Beyotime Biotechanology | ST780 | |
| Universal tissue fixative | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1105 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 | |
| Zoletil | VIRBAC |
References
- Frost, H. M. The Utah paradigm of skeletal physiology: an overview of its insights for bone, cartilage and collagenous tissue organs. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 18 (6), 305-316 (2000).
- Frost, H. M. Wolff's Law and bone's structural adaptations to mechanical usage: an overview for clinicians. The Angle Orthodontist. 64 (3), 175-188 (1994).
- Gothlin, G., Ericsson, J. L. The osteoclast: review of ultrastructure, origin, and structure-function relationship. Clinical Orthopaedics and Related Research. (120), 201-231 (1976).
- Feng, X., Teitelbaum, S. L.
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L.
- Zhu, L. X., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), eaaw6143 (2020).
- Dai, Q., et al. A RANKL-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mTORC1 in osteoclast formation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), 56468 (2018).
- Karsenty, G., Kronenberg, H. M., Settembre, C.
- Long, F. Building strong bones: molecular regulation of the osteoblast lineage. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (1), 27-38 (2011).
- Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).
- Lang, T., et al. Cortical and trabecular bone mineral loss from the spine and hip in long-duration spaceflight. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (6), 1006-1012 (2004).
- Sibonga, J. D. Spaceflight-induced bone loss: is there an osteoporosis risk. Current Osteoporosis Reports. 11 (2), 92-98 (2013).
- Yang, Y., et al. Administration of allogeneic mesenchymal stem cells in lengthening phase accelerates early bone consolidation in rat distraction osteogenesis model. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 129 (2020).
- Huang, C., Holfeld, J., Schaden, W., Orgill, D., Ogawa, R. Mechanotherapy: revisiting physical therapy and recruiting mechanobiology for a new era in medicine. Trends in Molecular Medicine. 19 (9), 555-564 (2013).
- Shu, H. S., et al. Tracing the skeletal progenitor transition during postnatal bone formation. Cell Stem Cell. 28 (12), 2122-2136 (2021).
- Wang, X., et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation. Nature Medicine. 19 (1), 93-100 (2013).
- Huja, S. S., Fernandez, S. A., Hill, K. J., Li, Y. Remodeling dynamics in the alveolar process in skeletally mature dogs. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (12), 1243-1249 (2006).
- Jin, A., et al. FOXO3 mediates tooth movement by regulating force-induced osteogenesis. Journal of Dental Research. 101 (2), 196-205 (2022).
- Bumann, A., Carvalho, R. S., Schwarzer, C. L., Yen, E. H. Collagen synthesis from human PDL cells following orthodontic tooth movement. European Journal of Orthodontics. 19 (1), 29-37 (1997).
- Kitaura, H., et al. Effect of cytokines on osteoclast formation and bone resorption during mechanical force loading of the periodontal membrane. The Scientific World Journal. 2014, 617032 (2014).
- Lu, W., et al. Sclerostin injection enhances orthodontic tooth movement in rats. Archives of Oral Biology. 99, 43-50 (2019).
- Seki, Y., et al. Differentiation ability of Gli1(+) cells during orthodontic tooth movement. Bone. 166, 116609 (2023).
- Gong, X. Y., et al. Local orthodontic force initiates widespread remodelling of the maxillary alveolar bone. Australasian Orthodontic Journal. 36 (2), 175-183 (2020).
- Liu, Y., et al. STAT3 and its targeting inhibitors in osteosarcoma. Cell Proliferation. 54 (2), e12974 (2021).
- Guadagnin, E., Mazala, D., Chen, Y. W. STAT3 in skeletal muscle function and disorders. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2265 (2018).
- Saikia, B., et al. Clinical profile of hyper-IgE syndrome in India. Frontiers in Immunology. 12, 626593 (2021).
- van de Veen, W., et al. Impaired memory B-cell development and antibody maturation with a skewing toward IgE in patients with STAT3 hyper-IgE syndrome. Allergy. 74 (12), 2394-2405 (2019).
- Zhou, S. R., et al. STAT3 is critical for skeletal development and bone homeostasis by regulating osteogenesis. Nature Communications. 12 (1), 6891 (2021).
- Gong, X. Y., et al. Osteoblastic STAT3 is crucial for orthodontic force driving alveolar bone remodeling and tooth movement. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (1), 214-227 (2023).
- Yang, Y., et al. Skeletal phenotype analysis of a conditional Stat3 deletion mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), 61390 (2020).
- Egic, B. Prevalence of orthodontic malocclusion in schoolchildren in Slovenia. A prospective aepidemiological study. European Journal of Paediatric Dentistry. 23 (1), 39-43 (2022).
- Gois, E. G., et al. Incidence of malocclusion between primary and mixed dentitions among Brazilian children A 5-year longitudinal study. The Angle Orthodontist. 82 (3), 495-500 (2012).
- Yang, F., et al. Effects Of triptolide on tooth movement and root resorption in rats. Drug Design, Development and Therapy. 13, 3963-3975 (2019).
- Wang, C., Sun, H.
- Cao, H., et al. Force-induced Adrb2 in periodontal ligament cells promotes tooth movement. Journal of Dental Research. 93 (11), 1163-1169 (2014).
