Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Использование индуцируемых мышей с нокаутом Stat3 , специфичных для остеобластической линии, для изучения ремоделирования альвеолярной кости во время ортодонтического перемещения зубов

Published: July 21, 2023 doi: 10.3791/65613
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, *6, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 2,3,4,5,7, 1,2,3,4,5
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University, 3National Center for Stomatology, 4National Clinical Research Center for Oral Diseases, 5Shanghai Key Laboratory of Stomatology, 6Shanghai Starriver Bilingual School, 7The 2nd Dental Center, Ninth People’s Hospital, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

В этом исследовании представлен протокол использования мышей с нокаутом Stat3 , специфичных для индуцируемой линии остеобластов, для изучения ремоделирования кости под действием ортодонтической силы и описаны методы анализа ремоделирования альвеолярной кости во время ортодонтического перемещения зубов, что проливает свет на механическую биологию скелета.

Abstract

Альвеолярная кость с высокой скоростью обновления является наиболее активно ремоделирующей костью в организме. Ортодонтическое перемещение зубов (OTM) является распространенным искусственным процессом ремоделирования альвеолярной кости в ответ на механическую силу, но основной механизм остается неуловимым. Предыдущие исследования не смогли выявить точный механизм ремоделирования костной ткани в любое время и пространстве из-за ограничений, связанных с животными моделями. Сигнальный преобразователь и активатор транскрипции 3 (STAT3) важен в метаболизме костной ткани, но его роль в остеобластах во время ОТМ неясна. Чтобы предоставить in vivo доказательства того, что STAT3 участвует в OTM в определенные моменты времени и в определенных клетках во время OTM, мы создали тамоксифен-индуцируемую модель остеобластов Stat3 на мышах, применили ортодонтическую силу и проанализировали фенотип альвеолярной кости.

Для доступа к расстоянию ОТМ использовали микрокомпьютерную томографию (Micro-CT) и стереомикроскопию. Гистологический анализ выбрал область, расположенную в пределах трех корней первого моляра (M1) в поперечном сечении верхнечелюстной кости, в качестве области интереса (ROI) для оценки метаболической активности остеобластов и остеокластов, указывающей на влияние ортодонтической силы на альвеолярную кость. Вкратце, мы предлагаем протокол использования индуцируемых остеобласт-специфичных нокаут-мышей Stat3 для изучения ремоделирования костной ткани под действием ортодонтической силы и описываем методы анализа ремоделирования альвеолярной кости во время ОТМ, тем самым проливая новый свет на скелетную механическую биологию.

Introduction

Общеизвестно, что кость подвергается постоянной реконструкции на протяжении всей жизни, реагируя на механические силы в соответствии с законом Вольфа 1,2. Соответствующая механическая стимуляция, такая как гравитация и ежедневные физические упражнения, поддерживает костную массу и прочность и предотвращает потерю костной массы, стимулируя как остеобласты, так и остеокласты. Остеокласты, ответственные за резорбцию костной ткани 3,4,5,6,7, и остеобласты, ответственные за формирование костной ткани 8,9,10, поддерживают гомеостаз костной ткани и совместно функционируют в биологическом процессе ремоделирования костной ткани. Напротив, при отсутствии нагрузочных стимулов, как у астронавтов в условиях длительной микрогравитации, кости страдают от потери минеральной плотности костной ткани на 10%, что увеличивает риск развития остеопороза11,12. Кроме того, неинвазивные и удобные методы лечения, включая ортодонтию и дистракционный остеогенез, появились в качестве методов лечения заболеваний костей13,14. Все это показало, что механическая сила играет решающую роль в поддержании качества и количества костной ткани. В недавних исследованиях, как правило, анализировалось ремоделирование костей в ответ на механическую нагрузку с использованием трудоемких моделей, таких как испытания ходового колеса и хвостовой подвески, которые обычно занимали 4 недели или более для имитации силовой нагрузки или разгрузки15,16. Поэтому существует спрос на удобную и эффективную животную модель для изучения ремоделирования костей под действием силовой нагрузки.

Альвеолярная кость является наиболее активной с точки зрения ремоделирования кости, с высокой частотой обновления17. Ортодонтическое перемещение зубов (OTM), распространенный метод лечения неправильного прикуса, представляет собой искусственный процесс ремоделирования альвеолярной кости в ответ на механическую силу. Тем не менее, OTM, который индуцирует быстрое ремоделирование кости18, также является экономящим время способом изучения влияния механической силы на ремоделирование кости по сравнению с другими моделями с длительным экспериментальным периодом. Таким образом, ОТМ является идеальной моделью для изучения ремоделирования костной ткани при механических раздражителях. Примечательно, что механизм ремоделирования альвеолярной кости часто чувствителен ко времени, и необходимо наблюдать изменения в ремоделировании альвеолярной кости в определенные моменты времени после моделирования. Обладая двойными преимуществами временного и пространственного контроля рекомбинации ДНК и тканевой специфичности, индуцируемая условная модель нокаута гена мыши является подходящим выбором для исследований OTM.

Условно, OTM-опосредованное ремоделирование альвеолярной кости было разделено на зоны натяжения, связанные с формированием костной ткани, и зоны давления, включающие резорбцию костной ткани 19,20,21, которая является более детальной, но трудно регулируемой. Кроме того, Yuri et al. сообщили, что время формирования костной ткани при ОТМ различалось на стороне растяжения и компрессии22. Кроме того, предыдущее исследование продемонстрировало, что первый моляр может инициировать широкое ремоделирование верхнечелюстной альвеолярной кости под действием ортодонтической силы, которая не ограничена зонами растяжения и давления23. Таким образом, в качестве области интереса (ROI) мы выбрали область, расположенную в пределах трех корней М1 в поперечном сечении верхнечелюстной кости, и описали методы оценки активности остеобластов и остеокластов в той же области для оценки ремоделирования альвеолярной кости при ОТМ.

Доказано, что ядерный транскрипционный фактор, преобразователь сигналов и активатор транскрипции 3 (STAT3) имеет решающее значение для костного гомеостаза24,25. Предыдущие исследования сообщали о низкой минеральной плотности костной ткани и рецидивирующих патологических переломах у мышей с мутацией Stat3 26,27. Наше предыдущее исследование показало, что делеция Stat3 в остеобластах Osx+ вызывает черепно-лицевые пороки развития и остеопороз, а также спонтанный перелом костей28. Недавно мы предоставили доказательства in vivo с индуцируемой остеобласт-специфичной моделью делеции Stat3 у мышей (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, далее именуемый Stat3Col1α2ERT2), что STAT3 имеет решающее значение в опосредовании эффектов ортодонтической силы, приводящей к ремоделированию альвеолярной кости29. В этом исследовании мы предлагаем методы и протоколы использования индуцируемых остеобласт-специфичных нокаут-мышей Stat3 для изучения ремоделирования костной ткани под действием ортодонтической силы и описываем методы анализа ремоделирования альвеолярной кости во время ОТМ, тем самым проливая свет на скелетную механическую биологию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все описанные здесь методы с участием животных были одобрены комитетом по этике Шанхайской девятой народной больницы Шанхайского медицинского факультета Университета Цзяо Тун (No 82101048).

1. Установление индуцируемых остеобласт-специфичных мышей с нокаутом Stat3

ПРИМЕЧАНИЕ: МышиStat3 fl/fl были получены коммерческим путем; штамм Col1α2CreERT2был подарком (подробности см. в Таблице материалов ). Всем животным были предоставлены стандартизированные лабораторные гранулы, корм и вода, а также стандартные лабораторные условия окружающей среды (комнатная температура от 22 °C до 26 °C и влажность 50%-55%).

  1. Посадите одного половозрелого самца мыши с двумя самками мышей в одну клетку. После 18 дней проверяйте наличие новорожденных каждый день. Переместите беременных самок мышей в пустую клетку и при необходимости оставьте их в покое. Помещайте самцов мышей в другие клетки для размножения, если самки мышей не беременны в течение 30 дней.
  2. Генерация Stat3fl/+; Мышей Col1α2 CreERT2 путем гибридизации мышей Stat3 fl/fl с мышами Col1α2 CreERT2; содержать всех этих мышей на фоне C57BL/6. Соберите кончики хвоста 2-5 мм для генотипирования и оставьте самца Stat3fl/+; МышейCol1α2 CreERT2 до тех пор, пока они не достигнут половой зрелости (F1).
  3. Гибридизация 6-недельного самца Stat3fl/ +; Мыши Col1α2CreERT2 с самками мышей Stat3 fl/fl. Собирайте кончики хвостов 2-5 мм в возрасте 2 недель для генотипирования мышей и сохраняйте самца Stat3 fl/fl; Мышей Col1α2 CreERT2 (Stat3Col1α2ERT2) до тех пор, пока они не достигнут половой зрелости (F2).
  4. Гибридизация 6-недельного самца Stat3 fl/fl; Мыши Col1α2CreERT2 с самками мышейStat3 fl/fl (F3). Собирайте кончики хвостов диаметром 2-5 мм в возрасте 2 недель для генотипирования и используйте молодых мышей того же генотипа для замены более старых племенных мышей, когда это необходимо (F3+N).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Репродуктивная способность мышей снижается после 8 месяцев, поэтому мыши в клетках для разведения должны тщательно контролироваться и заменяться по мере необходимости. Кроме того, в соответствии с экспериментальными требованиями, количество клеток для разведения должно быть соответствующим образом увеличено, чтобы избежать вымирания мышей-мишеней с целевым геном.

2. Индуцируемая делеция Stat3 в остеобластах, экспрессирующих Col1α2, тамоксифеном

  1. Растворите тамоксифен в кукурузном масле до 20 мг/мл в центрифужной пробирке и защитите от света, завернув в фольгу. Поместите покрытую фольгой центрифужную пробирку на ротационный миксер и перемешайте при комнатной температуре до полного растворения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тамоксифен был получен коммерческим путем и хранился в темноте при температуре 4 °C.
  2. Выберите десять 6-недельных самцов мышей и разделите их на группы Stat3 fl/fl и Stat3 Col1α2ERT2 по пять мышей в каждой группе. Вводят тамоксифен (100 мг·кг-1·м.т.) каждые 2 дня в течение 1 недели путем внутрибрюшинной инъекции.

3. Ортодонтическая модель перемещения зубов (OTM)

  1. Подготовьте стерилизованную пластиковую платформу для препарирования мышей в качестве операционного стола для иммобилизации мышей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стол для препарирования мышей был получен коммерчески и состоял из четырех регулируемых резиновых штифтов и одного металлического стержня для обездвиживания мышей. Используйте стерильные инструменты и инструменты на протяжении всей процедуры.
  2. К каждому резиновому столбику прикрепите резинку для фиксации конечности.
  3. Завяжите одну резинку между двумя верхними резиновыми стойками; привяжите нитку к резинке, чтобы удерживать нижние резцы; и привяжите еще одну нить к металлическому стержню, чтобы удерживать верхние резцы.
  4. Обезболивайте 7-недельных мышей-самцов 0,1 мл раствором дексмедетомидина гидрохлорида (0,1 мг·кг-1·м.н.) и золетила (тилетамина гидрохлорид в дозе 20 мг·кг-1.м.т. и золазепама гидрохлорид в дозе 20 мг·кг-1·м.н.), растворенных в физиологическом растворе путем внутрибрюшинного введения перед операцией. Убедитесь, что мыши находятся под надлежащей анестезией на протяжении всей операции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайте внимание на дату эффективного использования лекарств и не используйте препараты с истекшим сроком годности.
  5. Убедитесь, что мыши находятся под надлежащей анестезией, сжав пальцами пальцы задних конечностей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если мыши не реагируют на тест, это означает, что они без сознания и анестезия достигла желаемой глубины. В это время мыши находятся в состоянии расслабления мышц конечностей, с ровным дыханием и частотой сердечных сокращений, и можно приступать к операции.
  6. Нанесите ветеринарную мазь на глаза мышей, чтобы предотвратить сухость, и поместите мышь под наркозом в положение лежа на операционном столе. Используйте четыре эластичные ленты на резиновых штифтах, чтобы зафиксировать конечности, одну нить, прикрепленную к металлическому стержню, чтобы удерживать верхние резцы, и другую, прикрепленную к эластичной ленте между двумя верхними резиновыми штифтами, чтобы зацепить нижние резцы, чтобы держать нижнюю челюсть открытой.
  7. Подготовьте пружины с закрытой спиралью (размер проволоки 0,25 мм, диаметр 0,76 мм, длина 1 мм) для ортодонтического силового аппарата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обрежьте восемь нитей пружины для каждой мыши. Четыре нити длиной 1 мм посередине для применения силы и две нити на каждом конце для лигатурирования стальной лигатурной проволокой.
  8. Перевязывают один конец пружины, подготовленной к верхнечелюстному левому первому моляру. Привяжите другой конец к центральному резцу стальной лигатурной проволокой толщиной 0,1 мм, армированной светоотверждаемой реставрационной смолой, после нанесения клея на резцы с помощью ватной палочки для создания стабильной силы величиной 10 g, измеренной с помощью динамометра.
  9. После завершения операции поместите мышей в клетку с другими мышами того же штамма, находящимися в процессе выздоровления, или поместите каждую мышь в пустую клетку по отдельности. Следите за тем, чтобы мышей не оставляли без присмотра до тех пор, пока они не придут в сознание в достаточной степени через 2−4 ч после операции, чтобы сохранить положение грудины. В течение следующих нескольких дней кормите мышей мягкой пищей и регулярно наблюдайте за ними, чтобы убедиться в отсутствии осложнений и выяснить степень послеоперационной боли; При необходимости вводят обезболивающие препараты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей, перенесших операцию, не следует возвращать в компанию других мышей до полного выздоровления. Не помещайте послеоперационных мышей в период восстановления вместе с мышами, которые не находятся под наркозом. Мышей необходимо держать в тепле во время выздоровления.
  10. Проверяйте ортодонтический аппарат каждый день и исключите всех экспериментальных мышей со смещением.

4. Сбор образцов

  1. Усыпляйте мышей в три разных временных момента с помощью вывиха шейки матки: через 4 дня (d4), через 7 дней (d7) и через 10 дней (d10) после начала OTM.
  2. С помощью офтальмологических ножниц срежьте кожу вертикально от шейного отдела, а затем отделите голову от туловища с препарированием всей кожи головы.
  3. Срежьте кожу и букцинаторные мышцы от двустороннего angulus oris до задней области нижней челюсти. Полностью отсоедините щечные мышцы и сухожилия, прикрепленные к коракоидам, чтобы удалить нижнюю челюсть и обрезать лишние кости, чтобы получить полноценные верхние челюсти. Затем удаляют кость за двусторонними третьими молярами и отрывают слизистую оболочку неба. Наконец, отсоедините ортодонтический аппарат и отрежьте кость между резцами по срединному небному шву, чтобы получить альвеолярную кость правой и левой сторон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что область от резцов до третьего моляра остается нетронутой с обеих сторон.

5. Подготовка к парафиновой секции

  1. Фиксация: Заготовленную альвеолярную кость погрузить в 4% параформальдегид на 48 ч и обрезать офтальмологическими ножницами в вытяжном шкафу для секций 6 и 7.
  2. Удаление накипи: Осторожно промойте образцы 1x PBS в течение 3 x 10 минут. Декальцинировать образцы в универсальном тканефиксаторе (рН 8,0), заменяя свежим раствором каждые 2 дня, в течение 5 недель до тех пор, пока в кости не будет легко проникнуть кончиком иглы.
  3. Обезвоживание: Промывают образцы в 1x PBS в течение 3 x 10 мин, а затем последовательно погружают их в 95% этанол, 100% этанол и ксилол на 2 x 1 ч каждый раствор.
  4. Погрузите образцы в смесь ксилола и парафина в соотношении 1:1 на 30 минут, а затем в парафин при температуре 65 °C на ночь.
  5. Встраивание: Выберите подходящие резервуары для встраивания. Расположите альвеолярную кость равномерно зубцами вверх на одном уровне. Выньте образцы из емкости для закладных и переложите их в морозильную камеру с температурой -20 °C, затем пронумеруйте их, когда парафин полностью остынет и затвердеет.
  6. С помощью микротома непрерывно разрезают от двадцати до сорока срезов толщиной 4 мкм в поперечной плоскости и плавают на воде с температурой 37 °C. Приклейте срезы к предметным стеклам микроскопа и выпекайте при температуре 42 °C в течение ночи.

6. Измерение расстояния OTM

  1. Фотографируйте образцы из трех временных точек вертикально от окклюзионной плоскости с помощью стереомикроскопии.
  2. Отсканируйте альвеолярную кость с помощью микрокомпьютерного томографа. Реконструируйте 3D-изображения максимальной сагиттальной плоскости альвеолярной кости верхней челюсти, в которой полностью видны три моляра, с помощью вспомогательного программного обеспечения сканера в соответствии с инструкциями производителя.
  3. Измерьте расстояние OTM с помощью программного обеспечения ImageJ:
    1. Откройте программу ImageJ и используйте инструмент Прямая линия , чтобы создать отрезок линии с известным расстоянием.
    2. Щелкните Анализ и выберите Задать масштаб, чтобы ввести значение расстояния нарисованной линии в поле Известное расстояние и ввести единицы измерения в поле Единица длины.
    3. Нарисуйте линию между средними точками мезиального краевого гребня M2 и дистального краевого гребня M1 и щелкните Измерение. Результаты, показанные в столбце Длина, представляют собой расстояние OTM.

7. Гистологический анализ

  1. Выбор области интереса (ROI): Определите альвеолярную кость первого моляра (M1) как ROI, расположенную точно в пределах трех корней M1 в поперечном сечении верхнечелюстной кости. Эта область не только достигает кортикальной кости первого моляра в щечно-язычном направлении, но и простирается до середины длинной оси мезиобуккального корня, включая половину области между дистоброккальным корнем и небным корнем.
  2. Анализ остеогенеза
    1. Двойное мечение кальцеина и ализарина красного цвета и анализ
      1. Препарат кальцеина и ализарина красного: Растворяют кальцеин в 2% растворе NaHCO3 до 1 мг/мл и ализарин красный S вH2Oдо 2 мг/мл.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании кальцеин и ализарин красный были получены коммерчески.
      2. Назначают кальцеин (20 мг·кг-1·м.т.) в 1-й день и ализарин красный S (40 мг·кг-1·м.т.) на 8-й день путем внутрибрюшинной инъекции после начала ОТМ. Усыпите мышей на 10-й день и соберите альвеолярную кость.
      3. Подготовьте образцы и заложите их, выполнив шаги 5.1 и 5.3-5.5. Для получения более подробной информации см. Yang et al.30.
      4. С помощью ротационного микротома непрерывно вырезайте срезы толщиной 5 мкм в поперечной плоскости. Приклейте срезы к предметным стеклам микроскопа и закрепите покровными стеклами с помощью нейтрального бальзама.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные образцы должны храниться с влагопоглотителем при комнатной температуре.
      5. Осмотрите и сфотографируйте срезы под флуоресцентным микроскопом и рассчитайте скорость аппозиции минералов (MAR) и скорость костеобразования (BFR/BS) в соответствии с методом, описанным ранее30.
    2. Иммунофлюоресценция
      1. Выберите подходящие секции парафина и выпекайте при температуре 65 °C в течение 30 минут.
      2. Депарафинизация: Погрузите срезы в ксилол на 5 минут и повторите дважды с каждым разом со свежим ксилолом.
      3. Регидратация: Последовательно погрузите срезы в 95% этанола, 75% этанола, 50% этанола и ddH2O, каждый на 5 минут.
      4. Аккуратно промойте секции 1 x PBS в течение 2 x 5 минут.
      5. Извлечение антигена: Погрузите срезы в смесь Tris-HCl (0,05 М, pH 8,0), ЭДТА (0,01 М, pH 8,0) и протеазы K (10 мкг/мл) в ddH2O и инкубируйте при 37 °C в течение 15 мин.
      6. Аккуратно вымойте секции 1 x PBS в течение 3 x 5 минут.
      7. Блок: Удалите лишнюю жидкость с участков и нарисуйте круг вокруг целевой области с помощью гидрофобного маркера. Для блокирования неспецифического связывания накрывают блокирующим буфером, содержащим 10% бычьего сывороточного альбумина, и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не сушить срезы слишком долго, чтобы не повлиять на результаты.
      8. Первичная инкубация антител: Разбавьте антитело к остеопонтину (OPN) разбавителем антител до рекомендуемой концентрации и добавьте 30-50 мкл к каждому образцу; инкубируют при температуре 4 °C в течение ночи в увлажненной камере.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно оставьте немного воды в камере и накройте ее, чтобы предотвратить испарение жидкости антител.
      9. Аккуратно вымойте секции с помощью 1 x PBS в течение 3 x 10 минут.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 7.2.2.10-7.2.2.12 следует выполнять в темноте.
      10. Инкубация флуоресцентных вторичных антител: Выберите подходящее флуоресцентное вторичное антитело, соответствующее первичному антителу, и разбавьте его до рекомендуемой концентрации. Добавьте 30-50 мкл к каждому образцу и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч.
      11. Аккуратно промойте секции 1 x PBS в течение 2 x 10 минут.
      12. Для монтажа образцов используйте монтажную среду, препятствующую выцветанию, с 4'6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI). Храните срезы в темноте и фотографируйте их как можно скорее.
      13. Проведите флуоресцентную микроскопию с цифровой камерой для изучения и фотографирования срезов и подсчета положительных клеток в областях интереса (ROI).
  3. Анализ остеокластогенеза
    1. Окрашивание тартрат-резистентной кислой фосфатазой (TRAP)
      1. Выберите подходящие парафиновые срезы. Депарафинизацию и регидратацию, выполнив шаги 7.2.2.1-7.2.2.3.
      2. Приготовьте свежий раствор для окрашивания с помощью набора для окрашивания TRAP в соответствии с инструкциями производителя и предварительно нагрейте до 37°C.
      3. К каждому образцу добавляют 30-50 мкл красящего раствора и инкубируют при 37 °C в увлажненной камере в течение 20-30 мин. Проверяйте каждые 5 минут до тех пор, пока под световым микроскопом не будут видны красные многоядерные остеокласты. Остановите реакцию с помощью ddH2O.
      4. Контрокрашивают в растворе гематоксилина на 30 с и погружают в 1% раствор аммиака на 1 мин для получения стабильного синего цвета. Промыть под медленно проточной водопроводной водой.
      5. Смонтируйте срезы с помощью покровных стеблей с помощью нейтрального бальзама и просушите в течение ночи.
      6. Сделайте фотографии под микроскопом и подсчитайте количество TRAP-положительных клеток с более чем тремя ядрами, следуя нашему предыдущему протоколу30.
    2. Иммунофлюоресценция: Используйте антитела к катепсину К (CTSK) в рекомендуемой концентрации для иммунофлюоресценции и следуйте протоколу, описанному в разделе 7 выше.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Используя этот протокол, мы создали индуцируемую модель мышей с нокаутом Stat3 (Stat3Col1α2ERT2), специфичную для линии остеобластов, для изучения влияния делеции STAT3 на ортодонтическое форс-управляемое ремоделирование альвеолярной кости (рис. 1A, B). Делеция STAT3 в остеобластах была подтверждена иммунофлуоресцентным окрашиванием альвеолярной кости (рис. 1С).

Стереомикроскопия показала, что расстояние OTM у мышей WT увеличилось на d4, d7 и d10. Однако у мышей Stat3Col1α2ERT2 расстояние OTM было уменьшено (рис. 2B). Это явление также было подтверждено микро-КТ-анализом на d10, что указывает на то, что остеобластическая делеция Stat3 замедляет OTM (рис. 2C).

Для гистологического анализа область, расположенная в пределах трех корней М1 в поперечном срезе у верхнечелюстной кости, была определена как ROI, что показывает общую ситуацию ремоделирования альвеолярной кости (рис. 3А). Окрашивание гематоксилин-эозином и иммунофлуоресцентное окрашивание ОПН показали всю альвеолярную кость ROI (рис. 3B, C).

Для остеогенного анализа мечение ализарином красным и кальцеином показало, что ортодонтическая сила увеличивала скорость аппозиции минералов (MAR) альвеолярной кости у мышей WT, но MAR в группе OTM мышей Stat3Col1α2ERT2 был снижен по сравнению с мышами WT (рис. 4A). Кроме того, иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что количество остеобластов OPN+ увеличивалось под действием ортодонтической силы, но в группе OTM мышей Stat3Col1α2ERT2 остеобластов было меньше, чем у мышей WT (рис. 4B). Для остеокластагенного анализа окрашивание TRAP показало, что под действием ортодонтической силы количество остеокластов увеличилось у мышей WT, но в группе OTM мышей Stat3 Col1α2ERT2 было меньше остеокластов, чем у мышей WT (рис. 4C). Это явление также было подтверждено иммунофлуоресцентным окрашиванием ЦЦК (рис. 4D). Эти результаты показали, что остеобластический дефицит Stat3 снижает активность как остеобластов, так и остеокластов в ответ на ортодонтическую силу и нарушение ремоделирования кости во время движения зубов.

Figure 1
Рисунок 1: Иллюстрация генерации индуцируемой остеобласт-специфичной линии Stat3 модели нокаута мыши. (A) Схематическая диаграмма нокаута Stat3 в остеобластах, экспрессирующих Col1α2, индуцированных тамоксифеном (слева). Схема эксперимента: 6-недельным самцам дикого типа и мышам Stat3Col1ERT2 вводили ТК (100 мг·кг-1·мт) каждые 2 дня, начиная с недели до построения модели ОТМ, и жертвовали для анализа на d4, d7 и d10 после ОТМ (справа). (B) Прогресс гибридизации мышей с нокаутом Stat3 , специфичных для индуцируемой линии остеобластов. (C) Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание STAT3 и OPN в альвеолярной кости мышей WT и Stat3Col1ERT2 на d10 после ОТМ и количественное определение двойных положительных клеток на сторонах, отличных от ОТМ, и сторонах ОТМ. n = 5; Масштабные линейки = 50 мкм. Эта цифра взята из Gong et al. 26. Сокращения: STAT3 = преобразователь сигнала и активатор транскрипции 3; Col1α = коллаген 1-альфа; ТА = тамоксифен; WT = дикий тип; OTM = ортодонтическое перемещение зубов; ОПН = остеопонтин; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Остеобластический дефицит Stat3 с замедленным ортодонтическим движением зубов (A) Принципиальная схема модели OTM in vivo. Пружина лигировалась между резцами и первым моляром (М1) и индуцировала ортодонтическое усилие для перемещения М1 в сторону мезиального гребня. (B) Расстояние OTM d0, d4, d7 и d10 после OTM у мышей WT и мышей Stat3Col1α2ERT2 . (C) Репрезентативные изображения сторон, не отменяющих OTM, и сторон OTM у мышей WT и Stat3Col1α2ERT2 на d10 после OTM с помощью микро-КТ. n = 5. Масштабные линейки = 1 мм (B), 500 мкм (C). Эта цифра взята из Gong et al.26. Сокращения: STAT3 = преобразователь сигнала и активатор транскрипции 3; Col1α = коллаген 1-альфа; WT = дикий тип; OTM = ортодонтическое перемещение зубов; SAG = сагиттальная плоскость. Пунктирные кривые обозначают расстояние OTM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Иллюстрация областей интереса . (А) Принципиальная схема регионов ROI. Пунктирная область, расположенная в пределах трех корней М1 в поперечном сечении верхней челюсти, была выбрана в качестве ROI. Три корня М1 включают мезиобуккальный корень, дистоброккальный корень и небный корень. (B) HE-окрашивание всей альвеолярной кости М1 у мышей. (C) Иммунофлуоресцентное окрашивание OPN во всей альвеолярной кости M1 у мышей. Масштабные линейки = 200 мкм (B), 100 мкм (C). Эта цифра взята из Gong et al.26. Аббревиатуры: ROI = интересующие регионы; MB = мезиобуккальный корень; DB = дистобуккальный корень; P = небный корень; HE = гематоксилин-эозин; ОПН = остеопонтин; PDL = периодонтальная связка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Остеобластический дефицит Stat3 нарушает ортодонтическое форсирование, индуцированное формированием и резорбцией костной ткани. (A) Последовательное мечение флуорохрома кальцеином и ализариновым красным S у мышей WT и Stat3Col1α2ERT2 во время OTM и количественная оценка скорости аппозиции минералов. n = 5. (B) Иммунофлуоресцентное окрашивание и количественное определение клеток OPN+ в альвеолярной кости на d10 после OTM у мышей WT и Stat3Col1α2ERT2. n = 5. (C) Окрашивание TRAP и количественное определение TRAP-положительных клеток в альвеолярной кости на d4 после OTM у мышей WT и Stat3Col1α2ERT2. n = 5. (D) Иммунофлуоресцентное окрашивание и количественное определение клеток CTSK+ в альвеолярной кости на d4 после OTM у мышей WT и Stat3Col1α2ERT2. n = 5. Масштабные линейки = 10 мкм (A), 50 мкм (B-D). Эта цифра взята из Gong et al.26. Сокращения: STAT3 = преобразователь сигнала и активатор транскрипции 3; Col1α = коллаген 1-альфа; WT = дикий тип; OTM = ортодонтическое перемещение зубов; ОПН = остеопонтин; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; TRAP = тартрат-резистентная кислая фосфатаза; MAR = нормы внесения минералов; CTSK = катепсин К. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Поскольку неправильный прикус является одним из наиболее распространенных заболеваний полости рта, ухудшающих дыхание, жевание, речь и даже внешний вид, спрос на ортодонтию растет день ото дня, а заболеваемость растет с 70% до 93%, согласно предыдущему эпидемиологическому обследованию31,32. Как ускорить ремоделирование альвеолярной кости для безопасного повышения эффективности ортодонтического лечения стало актуальной темой в этой области; Поэтому необходимо прояснить механизм ремоделирования альвеолярной кости, управляемый ОТМ. В предыдущих исследованиях ученые использовали инъекцию препарата in vivo для изучения механизма ОТМ на животных моделях21,33, что было просто и легко, но было трудно исключить влияние лекарств на клетки других систем. Поэтому крайне необходимо изучить механизм ремоделирования костной ткани под действием ортодонтической силы in vivo.

В последние годы широко используются мыши с генным нокаутом, обеспечивающие прочную основу для изучения функции генов и исследования терапевтическихмишеней. Среди этих методов технология нокаута целых генов была самым ранним подходом. Модель мышей с нокаутом адрb2-/- адренорецепторов (Adrb2) была использована для изучения роли симпатической нервной системы в ремоделировании альвеолярной кости во время OTM35. Тем не менее, в некоторых случаях полный генный нокаут у мышей может привести к эмбриональной летальности, что затрудняет изучение функции генов. Поэтому были разработаны мыши с условным нокаутом, нацеленные на ген в определенных типах клеток. Однако, поскольку исследования, связанные с ремоделированием альвеолярной кости, часто чувствительны ко времени, необходимо наблюдать за изменениями в альвеолярной кости в определенные моменты времени после моделирования.

Мыши с индуцируемым условным нокаутом генов обладают двойным преимуществом: временным и пространственным контролем рекомбинации ДНК и тканевой специфичностью, и нокаут гена может быть достигнут в определенные моменты времени и в определенных тканях путем применения лекарств или гормонов, которые могут лучше удовлетворить потребности исследований. Кроме того, STAT3 является транскрипционным фактором, широко экспрессируемым в костных и других тканях и выполняет функции регуляции клеточной пролиферации, дифференцировки, апоптоза, а также иммунных и других важных функций25. Ранее мы сообщали, что минеральная плотность костной ткани у мышей с неиндуцированным остеобласт-специфичным нокаутом Stat3 была снижена28, что позволяет предположить, что мыши с неиндуцированным условным нокаутом Stat3 не подходят для механистического изучения ремоделирования альвеолярной кости, которое должно исключить влияние развития.

Таким образом, в данном исследовании мы получили тамоксифен-индуцируемые остеобласт-специфичные мыши с нокаутом гена Stat3, Stat3 Col1α2ERT2, используя технологию индуцируемого условного нокаута генов на основе системы Cre/loxP, которая является контролируемой во времени и пространстве и более подходящей для изучения механизма ремоделирования альвеолярной кости, а также позволяющей продолжить изучение функции конкретных клеток и генов в сочетании с отслеживанием родословной. До индукции тамоксифена не было очевидной разницы между мышами Stat3Col1α2ERT2 и мышами дикого типа и ничего особенного в разведении. Ранее мы обнаружили, что индуцируемая делеция Stat3 в остеобластах Col1α2+ нарушает формирование костной ткани и снижает костную массу у взрослых мышей28. В этом исследовании уровень костного метаболизма мышей Stat3Col1α2ERT2 в группах, не принимавших ОТМ, снизился, что согласуется с предыдущими результатами. Более того, поскольку уровень костного метаболизма в группе OTM снижался более значительно в ответ на ортодонтическую силу, можно считать, что Stat3 играет важную роль в регуляции метаболизма костной ткани под действием механического воздействия. Далее мы изучили механизм ремоделирования костной ткани, регулируемый Stat3. Результаты показали, что Stat3 может непосредственно способствовать дифференцировке остеобластов 28,29 и влиять на дифференцировку остеокластов, регулируя перекрестные помехи между остеобластами и остеокластами посредством модуляции транскрипции Mmp3 29.

В этом протоколе мы выбрали область, расположенную в пределах трех корней M1 в поперечном сечении на верхнечелюстной кости мышей, в качестве ROI для оценки ремоделирования альвеолярной кости. При этом анализ альвеолярной кости ближе к анализу длинных костей, в котором активность остеогенеза и остеокластогенеза анализируется в одной и той же области, а не традиционный метод анализа характеристик разных сторон. Кроме того, согласно классической гипотезе, для ускорения скорости движения зубов необходимо применять два препарата с противоположными эффектами на стороне давления и натяжения соответственно. Этот метод обеспечил теоретическую основу для преодоления этих узких мест. В этой модели OTM величина ортодонтической силы измерялась с помощью динамометра. Тем не менее, сила будет немного ослаблена с уменьшением расстояния между первым моляром и резцами. Поэтому необходимо создать стандартизированную механическую систему для создания более постоянной и стабильной ортодонтической силы.

В протоколе есть несколько важных шагов, о которых следует помнить. Во-первых, в процессе построения модели ОТМ первый моляр и резец должны быть прочно перевязаны, чтобы избежать отказа приложения силы при смещении. Во-вторых, необходимо обратить внимание на направление силы, и горизонтальная сила должна быть приложена к первому моляру, чтобы избежать удаления зуба, вызванного приложением вертикальной силы. Наконец, при заделке ориентация образца должна быть определена в соответствии с целевым поперечным сечением, и сечения должны быть вовремя соблюдены, чтобы отрегулировать ориентацию для получения идеальных сечений.

В заключение, мы приводим протоколы для индуцируемой, специфичной, мышиной модели OTM с нокаутом генов, которая выявляет ремоделирование альвеолярной кости в разные моменты времени. В дальнейшем мы будем использовать это для изучения функций конкретных клеток и генов в сочетании с отслеживанием родословной. Затем мы установили динамический и клеточно-специфичный паттерн in vivo в области исследования механизма OTM, предлагая доказательства ортодонтии в клинике. Кроме того, в этом исследовании представлены подробные протоколы для построения модели OTM, которая обеспечивает быстрое ремоделирование костной ткани путем стимуляции остеобластов и остеокластов и обеспечивает идеальную модель для изучения ремоделирования кости в ответ на механическую силу. Более того, мы описываем методы анализа ремоделирования альвеолярной кости во время ОТМ, чтобы обеспечить новую стратегию для изучения механической биологии скелета.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.

Acknowledgments

Эта работа была частично поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); Шанхайский фонд естественных наук (21ZR1436900, 22ZR1436700); Программа Шанхайского лидера по академическим/технологическим исследованиям (20XD1422300); План клинических исследований SHDC (SHDC2020CR4084); Междисциплинарный исследовательский фонд Шанхайской девятой народной больницы, Медицинский факультет Шанхайского университета Цзяотун (JYJC201902, JYJC202116); Группа инновационных исследований местных университетов высокого уровня в Шанхае (SSMUZLCX20180501); Фонд научно-исследовательских дисциплин No KQYJXK2020 из Девятой народной больницы, Школы медицины Шанхайского университета Цзяотун и Колледжа стоматологии, Шанхайского университета Цзяотун; Первоначальный исследовательский проект Шанхайской девятой народной больницы, Медицинский факультет Шанхайского университета Цзяотун (JYYC003); Проект «Двести талантов» Школы медицины Шанхайского университета Цзяо Тун; Совместный исследовательский проект Института биоматериалов и регенеративной медицины Шанхайского университета Цзяо Тун (2022LHB02); Проект Биобанка Шанхайской девятой народной больницы Шанхайского медицинского факультета Университета Цзяо Тун (YBKB201909, YBKB202216).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  P1020
4% paraformaldehyde Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1101
Alizarin red Sigma-Aldrich A5533
Anti-CTSK antibody Santa Cruz sc-48353
Anti-OPN antibody R&D Systems, Minneapolis, MN, USA AF808
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Closed-coil springs Innovative Material and Devices, Shanghai, China CS1006B
Col1α2CreERT2 mice A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences.
Dexmedetomidine hydrochloride Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTA Beyotime Biotechanology ST069
Embedding tanks Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd 80106-1100-16
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 100092183
ImageJ software NIH, Bethesda, MD, USA
Mounting medium with DAPI Beyotime Biotechanology P0131
Mouse dissection platform Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. HK105
Paraffin Sangon biotech Co., Ltd. A601889
Primers for genotyping Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease K Sigma-Aldrich 539480
Self-curing restorative resin 3M ESPE, St. Paul, MN, USA 712-035
Stat3fl/fl mice GemPharmatech Co., Ltd D000527
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648
TRAP staining kit Sigma-Aldrich 387A
Tris-HCl Beyotime Biotechanology ST780
Universal tissue fixative Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1105
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10023418
Zoletil VIRBAC 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frost, H. M. The Utah paradigm of skeletal physiology: an overview of its insights for bone, cartilage and collagenous tissue organs. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 18 (6), 305-316 (2000).
  2. Frost, H. M. Wolff's Law and bone's structural adaptations to mechanical usage: an overview for clinicians. The Angle Orthodontist. 64 (3), 175-188 (1994).
  3. Gothlin, G., Ericsson, J. L. The osteoclast: review of ultrastructure, origin, and structure-function relationship. Clinical Orthopaedics and Related Research. (120), 201-231 (1976).
  4. Feng, X., Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: New Insights. Bone Research. 1 (1), 11-26 (2013).
  5. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  6. Zhu, L. X., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), eaaw6143 (2020).
  7. Dai, Q., et al. A RANKL-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mTORC1 in osteoclast formation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), 56468 (2018).
  8. Karsenty, G., Kronenberg, H. M., Settembre, C. Genetic control of bone formation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 629-648 (2009).
  9. Long, F. Building strong bones: molecular regulation of the osteoblast lineage. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (1), 27-38 (2011).
  10. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).
  11. Lang, T., et al. Cortical and trabecular bone mineral loss from the spine and hip in long-duration spaceflight. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (6), 1006-1012 (2004).
  12. Sibonga, J. D. Spaceflight-induced bone loss: is there an osteoporosis risk. Current Osteoporosis Reports. 11 (2), 92-98 (2013).
  13. Yang, Y., et al. Administration of allogeneic mesenchymal stem cells in lengthening phase accelerates early bone consolidation in rat distraction osteogenesis model. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 129 (2020).
  14. Huang, C., Holfeld, J., Schaden, W., Orgill, D., Ogawa, R. Mechanotherapy: revisiting physical therapy and recruiting mechanobiology for a new era in medicine. Trends in Molecular Medicine. 19 (9), 555-564 (2013).
  15. Shu, H. S., et al. Tracing the skeletal progenitor transition during postnatal bone formation. Cell Stem Cell. 28 (12), 2122-2136 (2021).
  16. Wang, X., et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation. Nature Medicine. 19 (1), 93-100 (2013).
  17. Huja, S. S., Fernandez, S. A., Hill, K. J., Li, Y. Remodeling dynamics in the alveolar process in skeletally mature dogs. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (12), 1243-1249 (2006).
  18. Jin, A., et al. FOXO3 mediates tooth movement by regulating force-induced osteogenesis. Journal of Dental Research. 101 (2), 196-205 (2022).
  19. Bumann, A., Carvalho, R. S., Schwarzer, C. L., Yen, E. H. Collagen synthesis from human PDL cells following orthodontic tooth movement. European Journal of Orthodontics. 19 (1), 29-37 (1997).
  20. Kitaura, H., et al. Effect of cytokines on osteoclast formation and bone resorption during mechanical force loading of the periodontal membrane. The Scientific World Journal. 2014, 617032 (2014).
  21. Lu, W., et al. Sclerostin injection enhances orthodontic tooth movement in rats. Archives of Oral Biology. 99, 43-50 (2019).
  22. Seki, Y., et al. Differentiation ability of Gli1(+) cells during orthodontic tooth movement. Bone. 166, 116609 (2023).
  23. Gong, X. Y., et al. Local orthodontic force initiates widespread remodelling of the maxillary alveolar bone. Australasian Orthodontic Journal. 36 (2), 175-183 (2020).
  24. Liu, Y., et al. STAT3 and its targeting inhibitors in osteosarcoma. Cell Proliferation. 54 (2), e12974 (2021).
  25. Guadagnin, E., Mazala, D., Chen, Y. W. STAT3 in skeletal muscle function and disorders. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2265 (2018).
  26. Saikia, B., et al. Clinical profile of hyper-IgE syndrome in India. Frontiers in Immunology. 12, 626593 (2021).
  27. van de Veen, W., et al. Impaired memory B-cell development and antibody maturation with a skewing toward IgE in patients with STAT3 hyper-IgE syndrome. Allergy. 74 (12), 2394-2405 (2019).
  28. Zhou, S. R., et al. STAT3 is critical for skeletal development and bone homeostasis by regulating osteogenesis. Nature Communications. 12 (1), 6891 (2021).
  29. Gong, X. Y., et al. Osteoblastic STAT3 is crucial for orthodontic force driving alveolar bone remodeling and tooth movement. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (1), 214-227 (2023).
  30. Yang, Y., et al. Skeletal phenotype analysis of a conditional Stat3 deletion mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), 61390 (2020).
  31. Egic, B. Prevalence of orthodontic malocclusion in schoolchildren in Slovenia. A prospective aepidemiological study. European Journal of Paediatric Dentistry. 23 (1), 39-43 (2022).
  32. Gois, E. G., et al. Incidence of malocclusion between primary and mixed dentitions among Brazilian children A 5-year longitudinal study. The Angle Orthodontist. 82 (3), 495-500 (2012).
  33. Yang, F., et al. Effects Of triptolide on tooth movement and root resorption in rats. Drug Design, Development and Therapy. 13, 3963-3975 (2019).
  34. Wang, C., Sun, H. Progress in gene knockout mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 35 (5), 784-794 (2019).
  35. Cao, H., et al. Force-induced Adrb2 in periodontal ligament cells promotes tooth movement. Journal of Dental Research. 93 (11), 1163-1169 (2014).

Tags

Медицина выпуск 197 Ортодонтическое перемещение зубов Метаболизм костной ткани Механическая сила Животная модель Роль STAT3 в остеобластах Тамоксифен-индуцируемая мышиная модель Ортодонтическая сила Альвеолярный костный фенотип Микро-КТ Стереомикроскопия Гистологический анализ Остеобласты Остеокласты
Использование индуцируемых мышей с нокаутом <em>Stat3</em> , специфичных для остеобластической линии, для изучения ремоделирования альвеолярной кости во время ортодонтического перемещения зубов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong,… More

Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong, X., Yang, Y., Zhu, Y., Xu, H., Jin, A., Huang, X., Gao, X., Lu, T., Liu, J., Wang, X., Dai, Q., Jiang, L. Using Inducible Osteoblastic Lineage-Specific Stat3 Knockout Mice to Study Alveolar Bone Remodeling During Orthodontic Tooth Movement. J. Vis. Exp. (197), e65613, doi:10.3791/65613 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter