Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Brug af inducerbare osteoblastiske afstamningsspecifikke stat3 knockout-mus til at studere alveolær knoglemodellering under ortodontisk tandbevægelse

Published: July 21, 2023 doi: 10.3791/65613
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, *6, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 2,3,4,5,7, 1,2,3,4,5
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University, 3National Center for Stomatology, 4National Clinical Research Center for Oral Diseases, 5Shanghai Key Laboratory of Stomatology, 6Shanghai Starriver Bilingual School, 7The 2nd Dental Center, Ninth People’s Hospital, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Denne undersøgelse giver en protokol til brug af inducerbare osteoblastafstamningsspecifikke Stat3 knockout-mus til at studere knoglemodellering under ortodontisk kraft og beskriver metoder til analyse af alveolær knoglemodellering under ortodontisk tandbevægelse og kaster således lys over skeletmekanisk biologi.

Abstract

Den alveolære knogle, med en høj omsætningshastighed, er den mest aktivt ombyggende knogle i kroppen. Ortodontisk tandbevægelse (OTM) er en almindelig kunstig proces med alveolær knoglemodellering som reaktion på mekanisk kraft, men den underliggende mekanisme forbliver undvigende. Tidligere undersøgelser har ikke været i stand til at afsløre den præcise mekanisme for knoglemodellering på noget tidspunkt og rum på grund af dyremodelrelaterede begrænsninger. Signaltransduceren og aktivatoren af transkription 3 (STAT3) er vigtig i knoglemetabolisme, men dens rolle i osteoblaster under OTM er uklar. For at tilvejebringe in vivo-bevis for, at STAT3 deltager i OTM på bestemte tidspunkter og i bestemte celler under OTM, genererede vi en tamoxifen-inducerbar osteoblastafstamningsspecifik Stat3 knockout-musemodel, anvendte ortodontisk kraft og analyserede den alveolære knoglefænotype.

Mikrocomputertomografi (Micro-CT) og stereomikroskopi blev brugt til at få adgang til OTM-afstand. Histologisk analyse valgte området inden for tre rødder af den første molære (M1) i tværsnittet af den maksillære knogle som interesseområde (ROI) for at evaluere den metaboliske aktivitet af osteoblaster og osteoklaster, hvilket indikerer effekten af ortodontisk kraft på alveolær knogle. Kort sagt leverer vi en protokol til brug af inducerbare osteoblastafstamningsspecifikke Stat3 knockout-mus til at studere knoglemodellering under ortodontisk kraft og beskrive metoder til analyse af alveolær knoglemodellering under OTM og dermed kaste nyt lys over skeletmekanisk biologi.

Introduction

Det er almindeligt kendt, at knogle er under konstant genopbygning gennem hele livet som reaktion på mekaniske kræfter i henhold til Wolffs lov 1,2. Passende mekanisk stimulering, såsom tyngdekraft og daglig motion, opretholder knoglemasse og styrke og forhindrer knogletab ved at stimulere både osteoblaster og osteoklaster. Osteoklaster, der er ansvarlige for knogleresorption 3,4,5,6,7, og osteoblaster, der er ansvarlige for knogledannelse 8,9,10, opretholder knoglehomeostase og fungerer sammen i den biologiske proces med knoglemodellering. I modsætning hertil lider knogler i mangel af belastningsstimuli, som hos astronauter under langvarig mikrogravity, 10% knoglemineraltæthedstab, hvilket øger risikoen for osteoporose11,12. Desuden er ikke-invasive og bekvemme mekaniske terapier, herunder tandregulering og distraktionsosteogenese, opstået som behandlinger for knoglesygdomme13,14. Alle disse har vist, at mekanisk kraft spiller en afgørende rolle for at opretholde knoglekvalitet og kvantitet. Nylige undersøgelser analyserede generelt knoglemodellering som reaktion på mekanisk belastning ved hjælp af tidskrævende modeller såsom løbehjuls- og haleophængstest, som normalt tog 4 uger eller mere at simulere kraftbelastning eller losning15,16. Derfor er der efterspørgsel efter en bekvem og effektiv dyremodel til at studere knogleremodellering drevet af kraftbelastning.

Den alveolære knogle er den mest aktive med hensyn til knoglemodellering med en høj omsætningshastighed17. Ortodontisk tandbevægelse (OTM), en almindelig behandling for malokklusion, er en kunstig proces med alveolær knoglemodellering som reaktion på mekanisk kraft. OTM, som inducerer hurtig knoglemodellering18, er imidlertid også en tidsbesparende måde at studere virkningerne af mekanisk kraft på knoglemodellering sammenlignet med andre modeller med en lang eksperimentel periode. Derfor er OTM en ideel model til at studere knoglemodellering under mekaniske stimuli. Det er bemærkelsesværdigt, at mekanismen for alveolær knoglemodellering ofte er tidsfølsom, og det er nødvendigt at observere ændringerne i alveolær knoglemodellering på bestemte tidspunkter efter modellering. Med de dobbelte fordele ved tidsmæssig og rumlig kontrol af DNA-rekombination og vævsspecificitet er en inducerbar betinget gen-knockout-musemodel et passende valg til OTM-undersøgelser.

Konventionelt er OTM-medieret alveolær knoglemodellering blevet opdelt i spændingszoner, der involverer knogledannelse og trykzoner, der involverer knogleresorption 19,20,21, hvilket er mere detaljeret, men vanskeligt at regulere. Desuden rapporterede Yuri et al., at tidspunktet for knogledannelse i OTM varierede på spændings- og kompressionssiderne22. Derudover havde en tidligere undersøgelse vist, at den første molære kunne indlede bred ombygning af den maksillære alveolære knogle under ortodontisk kraft, som ikke var begrænset til spændings- og trykzonerne23. Derfor valgte vi området inden for tre rødder af M1 i tværsnittet af den maksillære knogle som interesseområde (ROI) og beskrev metoder til at vurdere aktiviteten af osteoblaster og osteoklaster i samme område for at evaluere alveolær knoglemodellering under OTM.

Som en nuklear transkriptionsfaktor har signaltransducer og aktivator af transkription 3 (STAT3) vist sig kritisk i knoglehomeostase24,25. Tidligere undersøgelser har rapporteret lav knoglemineraltæthed og tilbagevendende patologiske frakturer hos Stat3-mutante mus26,27. Vores tidligere undersøgelse viste, at sletning af Stat3 i Osx + osteoblaster forårsagede kraniofacial misdannelse og osteoporose samt spontan knoglebrud28. For nylig leverede vi in vivo-bevis med en inducerbar osteoblastspecifik Stat3-deletionsmusemodel (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, i det følgende kaldet Stat3Col1α2ERT2), at STAT3 er afgørende for formidling af virkningerne af ortodontisk kraft, der driver alveolær knoglemodellering29. I denne undersøgelse leverer vi metoder og protokoller til brug af inducerbare osteoblastafstamningsspecifikke Stat3 knockout-mus til at studere knoglemodellering under ortodontisk kraft og beskrive metoder til analyse af alveolær knoglemodellering under OTM og dermed kaste lys over skeletmekanisk biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder, der involverer dyr, der er beskrevet her, blev godkendt af den etiske komité på Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (nr. 82101048).

1. Etablering af inducerbare osteoblastafstamningsspecifikke Stat3 knockout-mus

BEMÆRK: Stat3 fl/fl mus blev anskaffet kommercielt; Col1α2CreERT2-stammenvar en gave (se materialetabellen for alle detaljer). Standardiseret laboratoriepelletfoder og vand og standard laboratoriemiljøforhold (stuetemperatur ved 22 °C til 26 °C og fugtighed ved 50% -55%) blev leveret til alle dyrene.

  1. Sæt en kønsmoden hanmus med to hunmus i samme bur. Efter 18 dage skal du kontrollere for nyfødte hver dag. Fjern eventuelle drægtige hunmus til et tomt bur og hold dem alene, hvis det er nødvendigt. Sæt hanmus i andre forskellige avlsbure, hvis hunmusene ikke er drægtige inden for 30 dage.
  2. Generer Stat3fl/+; Col1α2 CreERT2-mus ved at hybridisere Stat3 fl/ fl-mus med Col1α2CreERT2-mus; vedligeholde alle disse mus på C57BL/6 baggrunden. Saml 2-5 mm halespidser til genotypebestemmelse og hold hannen Stat3fl/+; Col1α2CreERT2-mus, indtil de er kønsmodne (F1).
  3. Hybridiser 6 uger gammel han Stat3fl / +; Col1α2CreERT2-mus med hunmus med Stat3-fl/fl-hunmus. Saml 2-5 mm halespidser, når mus er 2 uger gamle til genotypning, og hold hannen Stat3 fl/ fl; Col1α2 CreERT2(Stat3Col1α2ERT2) mus, indtil de er kønsmodne (F2).
  4. Hybridiser 6 uger gammel han Stat3 fl/ fl; Col1α2CreERT2-mus med hunmus med Stat3-fl/fl-hunmus (F3). Saml 2-5 mm halespidser, når mus er 2 uger gamle, til genotypebestemmelse, og brug de yngre mus af samme genotype til at erstatte ældre avlsmus, når det er relevant (F3+N).
    BEMÆRK: Musens reproduktionsevne falder efter 8 måneders alderen, så musene i avlsburene skal overvåges nøje og udskiftes efter behov. Desuden bør antallet af avlsbure øges passende i overensstemmelse med forsøgskravene for at undgå udryddelse af målgenmusene.

2. Inducerbar deletion af Stat3 i Col1α2-ekspressive osteoblaster af tamoxifen

  1. Opløs tamoxifen i majsolie til 20 mg / ml i et centrifugerør og beskyt mod lys ved indpakning i folie. Sæt det foliedækkede centrifugerør på en roterende mixer og bland ved stuetemperatur, indtil det er helt opløst.
    BEMÆRK: Tamoxifen blev opnået kommercielt og opbevaret i mørke ved 4 ° C.
  2. Vælg ti 6 uger gamle hanmus, og del dem op i Stat3 fl/fl- og Stat3Col1α2ERT2-grupper med fem mus i hver gruppe. Administrer tamoxifen (100 mg · kg-1 · bw) hver 2. dag i 1 uge ved intraperitoneal injektion.

3. Ortodontisk tandbevægelse (OTM) model

  1. Forbered en steriliseret plastikmusedissektionsplatform som operationsbord for at immobilisere musene.
    BEMÆRK: Musens dissektionsbord blev opnået kommercielt og bestod af fire justerbare gummistolper og en metalstang til immobilisering af musene. Brug sterile instrumenter og værktøjer under hele proceduren.
  2. Fastgør et elastikbånd til hver gummistolpe til fastgørelse af lemmer.
  3. Bind et elastikbånd mellem de to øverste gummistolper; binde en tråd til elastikken for at holde de nederste forænder; og binde en anden tråd til metalstangen for at holde de øvre fortænder.
  4. Bedøv 7 uger gamle hanmus med 0,1 ml opløsning af dexmedetomidinhydrochlorid (0,1 mg·kg-1·bw) og zoletil (tiletaminhydrochlorid til 20 mg·kg-1·bw og zolazepamhydrochlorid til 20 mg·kg-1·bw) opløst i saltvand ved intraperitoneal injektion før operationen. Sørg for, at musene er under korrekt bedøvelse under hele operationen.
    BEMÆRK: Vær opmærksom på den effektive brugsdato for stoffer, og brug ikke udløbne lægemidler.
  5. Bekræft, at musene er under korrekt anæstesi ved at klemme tæerne på bagbenene med fingrene.
    BEMÆRK: Hvis musene ikke reagerer på testen, betyder det, at de er bevidstløse, og bedøvelsen har nået den ønskede dybde. På det tidspunkt er musene i en tilstand af afslapning af lemmer med glat vejrtrækning og puls, og operationen kan startes.
  6. Brug dyrlægesalve på musenes øjne for at forhindre tørhed og læg den bedøvede mus i liggende stilling på operationsbordet. Brug fire elastikker på gummistolperne til at fastgøre lemmerne, en tråd fastgjort til metalstangen for at holde de øvre fortænder og en anden fastgjort til et elastikbånd mellem de to øverste gummistolper for at kroge over de nedre fortænder for at holde underkæben åben.
  7. Forbered lukkede spiralfjedre (0,25 mm ledningsstørrelse, 0,76 mm diameter, 1 mm længde) til ortodontisk kraftapparat.
    BEMÆRK: Skær otte tråde fjeder til hver mus. Fire gevind på 1 mm længde i midten til kraftapparat og to gevind i hver ende til ligaturering ved hjælp af stålligaturtråd.
  8. Ligate den ene ende af foråret forberedt til den maksillære venstre første molar. Ligate den anden ende til den centrale fortænder med en 0,1 mm stålligaturtråd forstærket med lyshærdende genoprettende harpiks efter påføring af klæbemiddel på fortænderne med Q-spidsen for at generere en stabil kraft på en størrelse på 10 g målt ved hjælp af et dynamometer.
  9. Efter afslutningen af operationen skal du sætte musene i et bur med andre af samme stamme i genopretning eller sætte hver mus i et tomt bur alene. Sørg for, at musene ikke efterlades uden opsyn, før de har genvundet tilstrækkelig bevidsthed 2-4 timer efter operationen for at opretholde brystliggende. I de næste par dage skal du fodre musene med en blød kost og observere dem regelmæssigt for at sikre, at der ikke opstår komplikationer og for at fastslå graden af postkirurgisk smerte; Administrer smertestillende lægemidler efter behov.
    BEMÆRK: Mus, der har gennemgået operation, bør ikke returneres til selskab med andre mus, før de er helt raske. Sæt ikke postkirurgiske mus i bedring med mus, der ikke er bedøvet. Mus skal holdes varme under genopretning.
  10. Kontroller det ortodontiske apparat hver dag, og ekskluder eventuelle eksperimentelle mus med løsrivelse.

4. Prøvesamling

  1. Aflive musene på tre forskellige tidspunkter via cervikal dislokation: 4 dage (d4), 7 dage (d7) og 10 dage (d10) efter starten af OTM.
  2. Brug oftalmisk saks til at afskære huden lodret fra livmoderhalsområdet og derefter adskille hovedet fra kroppen med hele hovedets hud dissekeret.
  3. Afskær huden og buccinator musklerne fra den bilaterale angulus oris til den bageste del af underkæben. Afbryd bukkalmusklerne og senerne, der er fastgjort til coracoiderne, helt for at fjerne underkæben og trimme ekstra knogler for at opnå komplet maxillae. Fjern derefter knoglen bag de bilaterale tredje molarer og riv den palatale slimhinde af. Til sidst skal du frakoble det ortodontiske apparat og afskære knoglen mellem forænderne langs median palatinsuturen for at opnå den alveolære knogle i højre og venstre side.
    BEMÆRK: Sørg for, at regionen fra forænderne til den tredje molære holdes intakt på begge sider.

5. Forberedelse til paraffinsektion

  1. Fastgørelse: Nedsænk den høstede alveolære knogle i 4% paraformaldehyd i 48 timer og trim med oftalmisk saks i stinkhætten til sektion 6 og 7.
  2. Afkalkning: Vask forsigtigt prøverne med 1x PBS i 3 x 10 min. Afkalk prøverne i universelt vævsfikseringsmiddel (pH 8,0), erstattet med frisk opløsning hver 2. dag i 5 uger, indtil knoglerne let kan trænge ind i en nålespids.
  3. Dehydrering: Vask prøverne i 1x PBS i 3 x 10 minutter, og nedsænk dem derefter sekventielt i 95% ethanol, 100% ethanol og xylen i 2 x 1 time hver opløsning.
  4. Dyp prøverne i en 1:1 blanding af xylen og paraffin i 30 minutter og derefter i paraffin ved 65 °C natten over.
  5. Indlejring: Vælg egnede indlejringstanke. Placer den alveolære knogle ensartet med tænderne op på samme niveau. Fjern prøverne fra indlejringstanken, og overfør dem til en -20 °C fryser, og nummerer dem derefter, når paraffinen er helt afkølet og fast.
  6. Brug et mikrotomt til at skære tyve til fyrre 4 μm tykke sektioner kontinuerligt i tværplanet og flyde på 37 ° C vand. Fastgør sektionerne til mikroskopglas og bages ved 42 ° C natten over.

6. Måling af OTM-afstand

  1. Fotoprøver fra tre tidspunkter lodret fra okklusalplanet ved stereomikroskopi.
  2. Scan den alveolære knogle med en Micro-CT-scanner. Rekonstruer 3D-billeder af det maksimale sagittale plan for den maksillære alveolære knogle, hvor tre molarer er helt synlige, ved hjælp af scannerens understøttende software efter producentens anvisninger.
  3. Mål OTM-afstanden ved hjælp af ImageJ-software:
    1. Åbn ImageJ-softwaren, og brug værktøjet Lige linje til at oprette et linjesegment med kendt afstand.
    2. Klik på Analysér , og vælg Indstil skala for at indtaste værdien af den tegnede linjeafstand i Kendt afstand og angive enheder i Længdeenhed.
    3. Tegn en linje mellem midtpunkterne på den mesielle marginalryg på M2 og den distale marginale ryg på M1, og klik på Måling. Resultaterne vist i kolonnen Længde repræsenterer OTM-afstanden.

7. Histologisk analyse

  1. Valg af interesseregion (ROI): Definer den alveolære knogle i den første molære (M1) som ROI, der ligger nøjagtigt inden for tre rødder af M1 i tværsnittet ved den maksillære knogle. Denne region når ikke kun den kortikale knogle af den første molære i buccal-lingual retning, men strækker sig også til midten af mesiobukkalrotens lange akse, herunder halvområdet mellem den distobukkale rod og den palatale rod.
  2. Analyse af osteogenese
    1. Calcein og alizarin rød dobbelt mærkning og analyse
      1. Calcein og alizarinrødt præparat: Calcein opløses i 2 % NaHCO3-opløsning til 1 mg/ml og alizarinrødt S iH2Otil 2 mg/ml.
        BEMÆRK: I denne undersøgelse blev calcein og alizarinrød opnået kommercielt.
      2. Calcein (20 mg·kg-1·bw) administreres på dag 1 og alizarinrød S (40 mg·kg-1·bw) på dag 8 ved intraperitoneal injektion efter påbegyndelse af OTM. Aflive musene på dag 10 og høst den alveolære knogle.
      3. Forbered prøver og indlejr dem ved at følge trin 5.1 og 5.3-5.5. For flere detaljer, se Yang et al.30.
      4. Brug et roterende mikrotomt til at skære 5 μm tykke sektioner kontinuerligt i tværplanet. Fastgør sektionerne til mikroskopglas og monter med dæksler ved hjælp af neutral balsam.
        BEMÆRK: Resten af prøverne skal opbevares med tørremiddel ved stuetemperatur.
      5. Sektionerne under et fluorescensmikroskop undersøges og beregnes, mineralappositionshastigheden (MAR) og knogledannelseshastigheden (BFR/BS) beregnes efter den tidligere beskrevne metode30.
    2. Immunofluorescens
      1. Vælg passende paraffinsektioner og bag ved 65 °C i 30 min.
      2. Afvoksning: Nedsænk sektionerne i xylen i 5 minutter og gentag to gange med frisk xylen hver gang.
      3. Rehydrering: Nedsænk sektionerne sekventielt i 95% ethanol, 75% ethanol, 50% ethanol og ddH2O, hver i 5 min.
      4. Vask forsigtigt sektionerne med 1 x PBS i 2 x 5 min.
      5. Antigenudtagning: Sektionerne nedsænkes i en blanding af Tris-HCl (0,05 M, pH 8,0), EDTA (0,01 M, pH 8,0) og protease K (10 μg/ml) i ddH2O og inkuberes ved 37 °C i 15 minutter.
      6. Vask forsigtigt sektionerne med 1 x PBS i 3 x 5 min.
      7. Bloker: Fjern ekstra væske fra sektionerne og tegn en cirkel rundt om målområdet ved hjælp af en hydrofob markør. For at blokere uspecifik binding dækkes med en blokerende buffer indeholdende 10% bovint serumalbumin og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
        BEMÆRK: Pas på ikke at tørre sektionerne for længe for ikke at påvirke resultaterne.
      8. Primær antistofinkubation: Anti-osteopontin-antistoffet (OPN) fortyndes med antistoffortyndingsmiddel til den anbefalede koncentration, og der tilsættes 30-50 μL til hver prøve; Der inkuberes ved 4 °C natten over i et befugtet kammer.
        BEMÆRK: Sørg for at efterlade noget vand i kammeret og dække det for at forhindre antistofvæsken i at fordampe.
      9. Vask forsigtigt sektionerne med 1 x PBS i 3 x 10 min.
        BEMÆRK: Trin 7.2.2.10-7.2.2.12 skal udføres i mørke.
      10. Fluorescerende sekundær antistofinkubation: Vælg et passende fluorescerende sekundært antistof svarende til det primære antistof, og fortynd det til den anbefalede koncentration. Der tilsættes 30-50 μL til hver prøve, og der inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
      11. Vask forsigtigt sektionerne med 1 x PBS i 2 x 10 min.
      12. Brug et antifade monteringsmedium med 4'6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) til at montere prøverne. Opbevar sektionerne i mørke og fotografer dem så hurtigt som muligt.
      13. Udfør fluorescensmikroskopi med et digitalt kamera til at undersøge og fotografere sektionerne og tælle positive celler i interesseområderne (ROI'er).
  3. Analyse af osteoklastogenese
    1. Tartratresistent syrefosfatase (TRAP) farvning
      1. Vælg passende paraffinsektioner. Der afvokses og rehydreres efter trin 7.2.2.1-7.2.2.3.
      2. Forbered frisk farvningsopløsning ved hjælp af TRAP-farvningssættet i henhold til producentens anvisninger, og forvarm til 37 °C.
      3. Der tilsættes 30-50 μL farvningsopløsning til hver prøve, og den inkuberes ved 37 °C i et befugtet kammer i 20-30 minutter. Kontroller hvert 5. minut, indtil røde multinucleated osteoklaster ses under et lysmikroskop. Stop reaktionen med ddH2O.
      4. Modfarve i hæmatoxylinopløsning i 30 s og nedsænkes i 1% ammoniakopløsning i 1 min for stabil blå farve. Skyl under langsomt rindende ledningsvand.
      5. Monter sektionerne med dæksedler ved hjælp af neutral balsam og tør natten over.
      6. Tag billeder under et mikroskop og tæl antallet af TRAP-positive celler med mere end tre kerner efter vores tidligere protokol30.
    2. Immunfluorescens: Brug cathepsin K (CTSK) antistof i den anbefalede koncentration for immunfluorescens og følg protokollen beskrevet i afsnit 7 ovenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af denne protokol etablerede vi en inducerbar osteoblastafstamningsspecifik Stat3 knockout-mus (Stat3Col1α2ERT2) model for at undersøge virkningerne af STAT3-sletning på ortodontisk kraftdrevet alveolær knoglemodellering (figur 1A, B). STAT3-deletion i osteoblaster blev bekræftet ved immunofluorescensfarvning af alveolær knogle (figur 1C).

Stereomikroskopi indikerede, at OTM-afstanden for WT-mus steg på d4, d7 og d10. I Stat3Col1α2ERT2-mus blev OTM-afstanden imidlertid reduceret (figur 2B). Dette fænomen blev også bekræftet af Micro-CT-analyse på d10, hvilket indikerer, at osteoblastisk Stat3-deletion decelererede OTM (figur 2C).

Til histologisk analyse blev området inden for tre rødder af M1 i tværsnittet ved den maksillære knogle defineret som ROI, hvilket viser den samlede situation for alveolær knoglemodellering (figur 3A). Hæmatoxylin-eosinfarvning og OPN-immunofluorescerende farvning viste hele den alveolære knogle af ROI (figur 3B, C).

Til osteogen analyse indikerede alizarinrød og calceinmærkning, at ortodontisk kraft øgede mineralappositionshastigheden (MAR) af alveolær knogle i WT-mus, men MAR i OTM-gruppen af Stat3Col1α2ERT2-mus blev reduceret sammenlignet med WT-musene (figur 4A). Desuden viste immunofluorescensfarvning, at antallet af OPN + osteoblaster steg under ortodontisk kraft, men der var færre OPN + osteoblaster i OTM-gruppen af Stat3Col1α2ERT2-mus end i WT-musene (figur 4B). Til osteoklastogen analyse indikerede TRAP-farvning, at antallet af osteoklaster steg i WT-mus under ortodontisk kraft, men der var færre osteoklaster i OTM-gruppen hos Stat3Col1α2ERT2-mus end hos WT-musene (figur 4C). Dette fænomen blev også bekræftet ved immunofluorescensfarvning af CTSK (figur 4D). Disse resultater afslørede, at osteoblastisk Stat3-mangel reducerede aktiviteten af både osteoblaster og osteoklaster som reaktion på ortodontisk kraft og nedsat knoglemodellering under tandbevægelse.

Figure 1
Figur 1: Illustration af inducerbar osteoblastafstamningsspecifik Stat3 knockout musemodelgenerering. (A) Skematisk diagram over Stat3 knockout i Col1α2-ekspressive osteoblaster induceret af tamoxifen (venstre). Eksperimentets skema: 6 uger gamle vilde hanmus og Stat3Col1ERT2-mus blev administreret TA (100 mg·kg-1·bw) hver 2. dag fra en uge før OTM-modelkonstruktion og ofret til analyse på d4, d7 og d10 efter OTM (højre). (B) Hybridiseringsfremskridt af inducerbare osteoblastafstamningsspecifikke Stat3-knockout-mus. (C) Dobbelt immunfluorescensfarvning af STAT3 og OPN i den alveolære knogle hos WT- og Stat3Col1ERT2-mus på d10 efter OTM og kvantificering af dobbeltpositive celler på ikke-OTM-sider og OTM-sider. n = 5; skalastænger = 50 μm. Dette tal er fra Gong et al. 26. Forkortelser: STAT3 = signaltransducer og aktivator af transkription 3; Col1α = kollagen 1-alfa; TA = tamoxifen; WT = vildtype; OTM = ortodontisk tandbevægelse; OPN = osteopontin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Osteoblastisk mangel på Stat3 decelereret ortodontisk tandbevægelse (A) Det skematiske diagram over OTM-modellen in vivo. Fjederen ligerede mellem fortænderne og den første molære (M1) og inducerede ortodontisk kraft til at bevæge M1 mod mesialryggen. B) OTM-afstanden på d0, d4, d7 og d10 efter OTM i WT-mus og Stat3Col1α2ERT2-mus . (C) Repræsentative billeder af ikke-OTM-sider og OTM-sider i WT- og Stat3Col1α2ERT2-mus på d10 efter OTM ved mikro-CT. n = 5. Skalastænger = 1 mm (B), 500 μm (C). Dette tal er fra Gong et al.26. Forkortelser: STAT3 = signaltransducer og aktivator af transkription 3; Col1α = kollagen 1-alfa; WT = vildtype; OTM = ortodontisk tandbevægelse; SAG = sagittalplan. Stiplede kurver angiver OTM-afstanden. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Illustration af interesseområder . (A) Skematisk diagram over regionerne med investeringsafkast. Det stiplede område placeret inden for tre rødder af M1 i tværsnittet af maxillae blev valgt som ROI. De tre rødder af M1 inkluderer mesiobuccal rod, distobuccal rod og palatal rod. B) farvning af hele den alveolære knogle i M1 hos mus. (C) Immunofluorescerende farvning af OPN i hele den alveolære knogle i M1 hos mus. Skalastænger = 200 μm (B), 100 μm (C). Dette tal er fra Gong et al.26. Forkortelser: ROI'er = regioner af interesse; MB = mesiobukkal rod; DB = distobuccal rod; P = palatal rod; HE = hæmatoxylin-eosin; OPN = osteopontin; PDL = periodontalt ledbånd. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Osteoblastisk mangel på Stat3 nedsat ortodontisk kraftinduceret knogledannelse og resorption . (A) Sekventiel fluorkrommærkning med calcein og alizarinrød S i WT- og Stat3Col1α2ERT2-mus under OTM og kvantificering af mineralappositionshastigheder. n = 5. (B) Immunofluorescensfarvning og kvantificering af OPN+-celler i alveolær knogle på d10 efter OTM i WT- og Stat3Col1α2ERT2-mus. n = 5. (C) TRAP-farvning og kvantificering af TRAP-positive celler i alveolær knogle på d4 efter OTM i WT- og Stat3Col1α2ERT2-mus. n = 5. (D) Immunofluorescensfarvning og kvantificering af CTSK+-celler i alveolær knogle på d4 efter OTM i WT- og Stat3Col1α2ERT2-mus. n = 5. Skalastænger = 10 μm (A), 50 μm (B-D). Dette tal er fra Gong et al.26. Forkortelser: STAT3 = signaltransducer og aktivator af transkription 3; Col1α = kollagen 1-alfa; WT = vildtype; OTM = ortodontisk tandbevægelse; OPN = osteopontin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; TRAP = tartrat resistent syrephosphatase; MAR = mineralappositionssatser; CTSK = katepsin K. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Da malokklusion er blandt de mest almindelige orale lidelser, der forringer vejrtrækning, mastication, tale og endda udseende, stiger efterspørgslen efter tandregulering dag for dag, hvor forekomsten stiger fra 70% til 93% ifølge en tidligere epidemiologisk undersøgelse31,32. Hvordan man fremskynder alveolær knoglemodellering for at øge effektiviteten af tandregulering sikkert er blevet et varmt emne på dette område; derfor er det nødvendigt at præcisere mekanismen for alveolær knoglemodellering drevet af OTM. I tidligere undersøgelser brugte forskere in vivo-lægemiddelinjektion til at studere mekanismen for OTM i dyremodeller21,33, hvilket var enkelt og let, men det var svært at udelukke lægemidlers indflydelse på cellerne i andre systemer. Derfor er det meget nødvendigt at studere mekanismen for knoglemodellering under ortodontisk kraft in vivo.

I de senere år er genknockout-mus blevet brugt i vid udstrækning, hvilket giver et solidt fundament for studiet af genfunktion og udforskningen af terapeutiske mål34. Blandt disse teknikker var hele gen-knockout-teknologien den tidligste tilgang. Adrb2-/- adrenerge receptor (Adrb2) knockout musemodel blev brugt til at undersøge det sympatiske nervesystems rolle i alveolær knoglemodellering under OTM35. Imidlertid kan totale gen-knockout-mus i nogle tilfælde resultere i embryonal dødelighed, hvilket forhindrer undersøgelsen af genfunktion. Derfor blev der udviklet betingede knockout-mus, der var målrettet mod et gen i specifikke celletyper. Men fordi forskning relateret til alveolær knoglemodellering ofte er tidsfølsom, er det derfor nødvendigt at observere ændringerne i alveolær knogle på bestemte tidspunkter efter modellering.

Inducerbare betingede gen-knockout-mus har de dobbelte fordele ved tidsmæssig og rumlig kontrol af DNA-rekombination og vævsspecificitet, og genknockout kan opnås på bestemte tidspunkter og specifikke væv ved anvendelse af lægemidler eller hormoner, som bedre kan imødekomme forskningsbehovene. Derudover er STAT3 en transkriptionsfaktor, der i vid udstrækning udtrykkes i knogler og andre væv og har funktionerne til at regulere celleproliferation, differentiering, apoptose og immun- og andre vigtige funktioner25. Vi har tidligere rapporteret, at knoglemineraltætheden hos ikke-inducerede osteoblastspecifikke Stat3-knockout-mus blev reduceret28, hvilket tyder på, at ikke-inducerede betingede Stat3-knockout-mus ikke er egnede til den mekanistiske undersøgelse af alveolær knoglemodellering, som skal udelukke udviklingsindflydelsen.

Derfor genererede vi i denne undersøgelse tamoxifen-inducerbare osteoblastspecifikke Stat3-genknockoutmus, Stat3Col1α2ERT2, ved at anvende inducerbar betinget genknockout-teknologi baseret på Cre/loxP-systemet, som er kontrollerbart i tid og rum og mere egnet til undersøgelse af mekanismen for alveolær knoglemodellering samt tillader yderligere undersøgelse af funktionen af specifikke celler og gener kombineret med afstamningssporing. Før induktionen af tamoxifen var der ingen tydelig forskel mellem Stat3Col1α2ERT2 og vildtypemus og intet særligt i avlen. Vi har tidligere fundet ud af, at den inducerbare sletning af Stat3 i Col1α2+ osteoblaster forringede knogledannelsen og reducerede knoglemassen hos voksne mus28. I denne undersøgelse faldt knoglemetabolismeniveauet for Stat3Col1α2ERT2-mus i ikke-OTM-grupper, hvilket var i overensstemmelse med de tidligere resultater. Da knoglemetabolismeniveauet for OTM-gruppen faldt mere signifikant som reaktion på ortodontisk kraft, kunne det desuden overvejes, at Stat3 spillede en vigtig rolle i reguleringen af knoglemetabolisme under mekanisk kraft. Vi undersøgte yderligere mekanismen for knoglemodellering reguleret af Stat3. Resultaterne viste, at Stat3 direkte kunne fremme osteoblastdifferentiering 28,29 og påvirkede osteoklastdifferentiering ved at regulere krydstalen mellem osteoblaster og osteoklaster gennem modulering af Mmp3-transkription 29.

I denne protokol valgte vi området inden for tre rødder af M1 i tværsnittet ved musens maksillære knogle som ROI for at evaluere alveolær knoglemodellering. Med dette område er analysen af alveolær knogle tættere på den af lange knogler, hvor aktiviteten af osteogenese og osteoklastogenese analyseres i samme region snarere end den traditionelle metode til analyse af egenskaberne ved forskellige sider. Desuden bør der ifølge den klassiske hypotese anvendes to lægemidler med modsatte virkninger på henholdsvis tryk- og spændingssiderne for at fremskynde tandbevægelseshastigheden. Denne metode gav et teoretisk grundlag for at overvinde disse flaskehalse. I denne OTM-model blev størrelsen af tandreguleringskraften målt ved hjælp af et dynamometer. Imidlertid ville kraften blive lidt svækket med reduktionen i afstanden mellem den første molære og forænder. Derfor er det nødvendigt at etablere et standardiseret mekanisk system for at generere en mere konstant og stabil ortodontisk kraft.

Inden for protokollen er der nogle kritiske trin, der skal huskes. For det første skal den første molære og snit i processen med OTM-modelkonstruktion ligeres fast for at undgå svigt i kraftanvendelse ved løsrivelse. For det andet skal man være opmærksom på kraftretningen, og vandret kraft skal påføres den første molære for at undgå tandekstraktion forårsaget af anvendelse af lodret kraft. Endelig skal prøvens orientering bestemmes i henhold til måltværsnittet ved indlejring, og sektionerne skal observeres i tide til at justere retningen for at opnå ideelle sektioner.

Afslutningsvis leverer vi protokoller til en inducerbar, specifik, gen-knockout-musemodel af OTM, som afslører alveolær knoglemodellering på forskellige tidspunkter. Vi vil yderligere bruge dette til at studere funktionen af specifikke celler og gener kombineret med afstamningssporing. Vi oprettede derefter et dynamisk og cellespecifikt mønster in vivo inden for OTM-mekanismeforskning, der tilbyder bevis for tandregulering i klinikken. Derudover giver denne undersøgelse detaljerede protokoller til konstruktion af en OTM-model, som muliggør hurtig knoglemodellering ved at stimulere osteoblaster og osteoklaster og giver en ideel model til undersøgelse af knoglemodellering som reaktion på mekanisk kraft. Mere end det beskriver vi metoder til analyse af alveolær knoglemodellering under OTM for at give en ny strategi til studiet af skeletmekanisk biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); Natural Science Foundation of Shanghai (21ZR1436900, 22ZR1436700); Programmet for Shanghai Academic / Technology Research Leader (20XD1422300); Klinisk forskningsplan for SHDC (SHDC2020CR4084); den tværfaglige forskningsfond for Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYJC201902, JYJC202116) innovationsforskningsteamet ved lokale universiteter på højt niveau i Shanghai (SSMUZLCX20180501) Forskningsdisciplinfonden nr. KQYJXK2020 fra Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine og College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University; Oprindeligt efterforskningsprojekt for Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYYC003); Tohundrede talentprojekt fra Shanghai Jiao Tong University School of Medicine; Biomaterials and Regenerative Medicine Institute Cooperative Research Project Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (2022LHB02); Projektet fra Biobank of Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (YBKB201909, YBKB202216).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  P1020
4% paraformaldehyde Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1101
Alizarin red Sigma-Aldrich A5533
Anti-CTSK antibody Santa Cruz sc-48353
Anti-OPN antibody R&D Systems, Minneapolis, MN, USA AF808
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Closed-coil springs Innovative Material and Devices, Shanghai, China CS1006B
Col1α2CreERT2 mice A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences.
Dexmedetomidine hydrochloride Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTA Beyotime Biotechanology ST069
Embedding tanks Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd 80106-1100-16
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 100092183
ImageJ software NIH, Bethesda, MD, USA
Mounting medium with DAPI Beyotime Biotechanology P0131
Mouse dissection platform Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. HK105
Paraffin Sangon biotech Co., Ltd. A601889
Primers for genotyping Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease K Sigma-Aldrich 539480
Self-curing restorative resin 3M ESPE, St. Paul, MN, USA 712-035
Stat3fl/fl mice GemPharmatech Co., Ltd D000527
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648
TRAP staining kit Sigma-Aldrich 387A
Tris-HCl Beyotime Biotechanology ST780
Universal tissue fixative Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1105
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10023418
Zoletil VIRBAC 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frost, H. M. The Utah paradigm of skeletal physiology: an overview of its insights for bone, cartilage and collagenous tissue organs. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 18 (6), 305-316 (2000).
  2. Frost, H. M. Wolff's Law and bone's structural adaptations to mechanical usage: an overview for clinicians. The Angle Orthodontist. 64 (3), 175-188 (1994).
  3. Gothlin, G., Ericsson, J. L. The osteoclast: review of ultrastructure, origin, and structure-function relationship. Clinical Orthopaedics and Related Research. (120), 201-231 (1976).
  4. Feng, X., Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: New Insights. Bone Research. 1 (1), 11-26 (2013).
  5. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  6. Zhu, L. X., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), eaaw6143 (2020).
  7. Dai, Q., et al. A RANKL-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mTORC1 in osteoclast formation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), 56468 (2018).
  8. Karsenty, G., Kronenberg, H. M., Settembre, C. Genetic control of bone formation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 629-648 (2009).
  9. Long, F. Building strong bones: molecular regulation of the osteoblast lineage. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (1), 27-38 (2011).
  10. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).
  11. Lang, T., et al. Cortical and trabecular bone mineral loss from the spine and hip in long-duration spaceflight. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (6), 1006-1012 (2004).
  12. Sibonga, J. D. Spaceflight-induced bone loss: is there an osteoporosis risk. Current Osteoporosis Reports. 11 (2), 92-98 (2013).
  13. Yang, Y., et al. Administration of allogeneic mesenchymal stem cells in lengthening phase accelerates early bone consolidation in rat distraction osteogenesis model. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 129 (2020).
  14. Huang, C., Holfeld, J., Schaden, W., Orgill, D., Ogawa, R. Mechanotherapy: revisiting physical therapy and recruiting mechanobiology for a new era in medicine. Trends in Molecular Medicine. 19 (9), 555-564 (2013).
  15. Shu, H. S., et al. Tracing the skeletal progenitor transition during postnatal bone formation. Cell Stem Cell. 28 (12), 2122-2136 (2021).
  16. Wang, X., et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation. Nature Medicine. 19 (1), 93-100 (2013).
  17. Huja, S. S., Fernandez, S. A., Hill, K. J., Li, Y. Remodeling dynamics in the alveolar process in skeletally mature dogs. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (12), 1243-1249 (2006).
  18. Jin, A., et al. FOXO3 mediates tooth movement by regulating force-induced osteogenesis. Journal of Dental Research. 101 (2), 196-205 (2022).
  19. Bumann, A., Carvalho, R. S., Schwarzer, C. L., Yen, E. H. Collagen synthesis from human PDL cells following orthodontic tooth movement. European Journal of Orthodontics. 19 (1), 29-37 (1997).
  20. Kitaura, H., et al. Effect of cytokines on osteoclast formation and bone resorption during mechanical force loading of the periodontal membrane. The Scientific World Journal. 2014, 617032 (2014).
  21. Lu, W., et al. Sclerostin injection enhances orthodontic tooth movement in rats. Archives of Oral Biology. 99, 43-50 (2019).
  22. Seki, Y., et al. Differentiation ability of Gli1(+) cells during orthodontic tooth movement. Bone. 166, 116609 (2023).
  23. Gong, X. Y., et al. Local orthodontic force initiates widespread remodelling of the maxillary alveolar bone. Australasian Orthodontic Journal. 36 (2), 175-183 (2020).
  24. Liu, Y., et al. STAT3 and its targeting inhibitors in osteosarcoma. Cell Proliferation. 54 (2), e12974 (2021).
  25. Guadagnin, E., Mazala, D., Chen, Y. W. STAT3 in skeletal muscle function and disorders. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2265 (2018).
  26. Saikia, B., et al. Clinical profile of hyper-IgE syndrome in India. Frontiers in Immunology. 12, 626593 (2021).
  27. van de Veen, W., et al. Impaired memory B-cell development and antibody maturation with a skewing toward IgE in patients with STAT3 hyper-IgE syndrome. Allergy. 74 (12), 2394-2405 (2019).
  28. Zhou, S. R., et al. STAT3 is critical for skeletal development and bone homeostasis by regulating osteogenesis. Nature Communications. 12 (1), 6891 (2021).
  29. Gong, X. Y., et al. Osteoblastic STAT3 is crucial for orthodontic force driving alveolar bone remodeling and tooth movement. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (1), 214-227 (2023).
  30. Yang, Y., et al. Skeletal phenotype analysis of a conditional Stat3 deletion mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), 61390 (2020).
  31. Egic, B. Prevalence of orthodontic malocclusion in schoolchildren in Slovenia. A prospective aepidemiological study. European Journal of Paediatric Dentistry. 23 (1), 39-43 (2022).
  32. Gois, E. G., et al. Incidence of malocclusion between primary and mixed dentitions among Brazilian children A 5-year longitudinal study. The Angle Orthodontist. 82 (3), 495-500 (2012).
  33. Yang, F., et al. Effects Of triptolide on tooth movement and root resorption in rats. Drug Design, Development and Therapy. 13, 3963-3975 (2019).
  34. Wang, C., Sun, H. Progress in gene knockout mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 35 (5), 784-794 (2019).
  35. Cao, H., et al. Force-induced Adrb2 in periodontal ligament cells promotes tooth movement. Journal of Dental Research. 93 (11), 1163-1169 (2014).

Tags

Medicin udgave 197 Ortodontisk tandbevægelse knoglemetabolisme mekanisk kraft dyremodel STAT3-rolle i osteoblaster Tamoxifen-inducerbar musemodel ortodontisk kraft alveolær knoglefænotype mikro-CT stereomikroskopi histologisk analyse osteoblaster osteoklaster
Brug af inducerbare osteoblastiske afstamningsspecifikke <em>stat3</em> knockout-mus til at studere alveolær knoglemodellering under ortodontisk tandbevægelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong,… More

Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong, X., Yang, Y., Zhu, Y., Xu, H., Jin, A., Huang, X., Gao, X., Lu, T., Liu, J., Wang, X., Dai, Q., Jiang, L. Using Inducible Osteoblastic Lineage-Specific Stat3 Knockout Mice to Study Alveolar Bone Remodeling During Orthodontic Tooth Movement. J. Vis. Exp. (197), e65613, doi:10.3791/65613 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter