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Medicine

使用诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠研究正畸牙齿移动过程中的牙槽骨重塑

Published: July 21, 2023 doi: 10.3791/65613
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, *6, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 2,3,4,5,7, 1,2,3,4,5
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University, 3National Center for Stomatology, 4National Clinical Research Center for Oral Diseases, 5Shanghai Key Laboratory of Stomatology, 6Shanghai Starriver Bilingual School, 7The 2nd Dental Center, Ninth People’s Hospital, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

本研究提供了一种使用诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠研究正畸力下骨重塑的方案，并描述了分析正畸牙齿移动过程中牙槽骨重塑的方法，从而揭示了骨骼机械生物学。

Abstract

牙槽骨，周转率高，是人体重塑最活跃的骨骼。正畸牙齿移动 （OTM） 是一种常见的人工过程，即响应机械力进行牙槽骨重塑，但其潜在机制仍然难以捉摸。由于动物模型相关的限制，以往的研究无法揭示任何时间和空间骨重塑的确切机制。信号转导和转录激活因子 3 （STAT3） 在骨代谢中很重要，但其在 OTM 期间成骨细胞中的作用尚不清楚。为了提供 体内 证据证明 STAT3 在特定时间点参与 OTM，特别是在 OTM 期间参与细胞，我们生成了他莫昔芬诱导的成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠模型，施加正畸力，并分析牙槽骨表型。

显微计算机断层扫描（Micro-CT）和立体显微镜用于访问OTM距离。组织学分析选择位于上颌骨横截面第一磨牙（M1）三个根部内的区域作为感兴趣区域（ROI），评估成骨细胞和破骨细胞的代谢活性，表明正畸力对牙槽骨的影响。简而言之，我们提供了一种使用诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠来研究正畸力下的骨重塑的方案，并描述了分析 OTM 期间牙槽骨重塑的方法，从而为骨骼机械生物学提供了新的思路。

Introduction

众所周知，根据沃尔夫定律1,2，骨骼在一生中不断进行重建，以响应机械力。适当的机械刺激，如重力和日常锻炼，通过刺激成骨细胞和破骨细胞来维持骨量和力量，并防止骨质流失。负责骨吸收的破骨细胞 3,4,5,6,7 和负责骨形成的成骨细胞 8,9,10 维持骨稳态并在骨重塑的生物过程中共同发挥作用。相反，在没有负荷刺激的情况下，如宇航员在长期微重力下，骨骼会遭受 10% 的骨密度损失，从而增加骨质疏松症的风险11,12。此外，非侵入性和方便的机械疗法，包括正畸和牵张成骨术，已成为骨骼疾病的治疗方法13,14。所有这些都表明，机械力在维持骨骼质量和数量方面起着至关重要的作用。最近的研究通常使用耗时的模型（例如跑轮和尾部悬架测试）分析响应机械负载的骨骼重塑，这些模型通常需要 4 周或更长时间来模拟力加载或卸载15,16。因此，需要一种方便高效的动物模型来研究受力载荷驱动的骨重塑。

牙槽骨在骨重塑方面最为活跃，周转率高17。牙齿正畸移位 （OTM） 是咬合不正的常见治疗方法，是一种响应机械力的牙槽骨重塑的人工过程。然而，与其他实验周期较长的模型相比，诱导快速骨重塑的OTM18也是一种节省时间的研究机械力对骨重塑影响的方法。因此，OTM是研究机械刺激下骨重塑的理想模型。值得注意的是，牙槽骨重塑的机制往往具有时效性，需要观察建模后某些时间点牙槽骨重塑的变化。具有DNA重组的时空调控和组织特异性的双重优势，诱导条件基因敲除小鼠模型是OTM研究的合适选择。

传统上，OTM介导的牙槽骨重塑分为涉及骨形成的张力区和涉及骨吸收的压力区19,20,21，这更详细但难以调节。此外，Yuri 等人报告说，OTM 中的骨形成时间在拉伸和压缩侧不同22。此外，先前的一项研究表明，第一磨牙可以在正畸力下启动上颌牙槽骨的广泛重塑，而正畸力不受张力和压力区的限制23。因此，我们选择位于上颌骨横截面 M1 三个根部内的区域作为感兴趣区域 （ROI），并描述了评估同一区域成骨细胞和破骨细胞活性的方法，以评估 OTM 下的牙槽骨重塑。

作为一种核转录因子，信号转导和转录激活因子 3 （STAT3） 已被证明在骨稳态中至关重要24,25。先前的研究报道了 Stat3 突变小鼠的低骨密度和复发性病理性骨折26,27。我们之前的研究表明，Osx+ 成骨细胞中 Stat3 的缺失会导致颅面畸形和骨质疏松症，以及自发性骨折28。最近，我们提供了诱导型成骨细胞特异性 Stat3 缺失小鼠模型 （Col1α2CreERT2;Stat3 fl/fl，以下称为 Stat3Col1α2ERT2），STAT3 在介导正畸力驱动牙槽骨重塑的影响中至关重要29.在这项研究中，我们提供了使用诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠研究正畸力下骨重塑的方法和方案，并描述了分析 OTM 过程中牙槽骨重塑的方法，从而阐明骨骼力学生物学。

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Protocol

本文所述涉及动物的所有方法均经上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会（第82101048号）批准。

1. 建立诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠

注： Stat3 fl/fl小鼠是商业获得的; Col1α2CreERT2菌株是一份礼物（详见 材料表 ）。为所有动物提供标准化的实验室颗粒食物和水以及标准的实验室环境条件（室温为22°C至26°C，湿度为50%-55%）。

  1. 将一只性成熟的雄性小鼠和两只雌性小鼠放在同一个笼子里。18 天后，每天检查新生儿。将任何怀孕的雌性小鼠移到空笼子中，必要时单独饲养它们。如果雌性小鼠在30天内未怀孕，则将雄性小鼠放入其他不同的繁殖笼中。
  2. 生成 Stat3fl/+;通过将 Stat3 fl/fl 小鼠与 Col1α2 CreERT2 小鼠杂交来 Col1α2 CreERT2 小鼠;将所有这些小鼠保持在C57BL / 6背景上。收集 2-5 mm 尾尖进行基因分型，并保持雄性 Stat3fl/+;Col1α2CreERT2 小鼠直到它们性成熟 （F1）。
  3. 杂交 6 周龄雄性 Stat3fl/ +;Col1α2CreERT2 小鼠与雌性 Stat3 fl/ fl 小鼠。当小鼠2周龄时收集2-5毫米尾尖进行基因分型，并保持雄性 Stat3 fl/ fl; Col1α2CreERT2（Stat3Col1α2ERT2）小鼠，直到它们性成熟（F2）。
  4. 杂交 6 周龄雄性 Stat3 fl/ fl;Col1α2CreERT2 小鼠与雌性 Stat3 fl/fl 小鼠 （F3）。当小鼠2周龄时收集2-5毫米尾尖进行基因分型，并在适当时使用相同基因型的年轻小鼠替换较老的繁殖小鼠（F3 + N）。
    注意：小鼠的繁殖能力在8个月大后下降，因此必须仔细监测繁殖笼中的小鼠，并根据需要进行更换。此外，根据实验要求，应适当增加繁殖笼的数量，以避免目标基因小鼠灭绝。

2. 他莫昔芬诱导表达 Col1α2 的成骨细胞中 Stat3 的缺失

  1. 在离心管中将他莫昔芬溶解在玉米油中至20mg / mL，并用箔纸包裹避光。将铝箔覆盖的离心管放在旋转混合器上，在室温下混合直至完全溶解。
    注：他莫昔芬是商业获得的，并在4°C的黑暗中储存。
  2. 选择10只6周龄雄性小鼠，将它们分为Stat3 fl / fl和Stat3 Col1α2ERT2组，每组5只小鼠。他莫昔芬（100 mg·kg-1·bw）每2天一次，腹腔注射1周。

3. 正畸牙齿移动 （OTM） 模型

  1. 准备一个灭菌的塑料小鼠解剖平台作为手术台，以固定小鼠。
    注：小鼠解剖台是商业获得的，由四个可调节的橡胶柱和一个用于固定小鼠的金属棒组成。在整个手术过程中使用无菌器械和工具。
  2. 在每个橡胶柱上系上松紧带以固定肢体。
  3. 在两个上部橡胶柱之间系上一条松紧带;将一根线系在松紧带上以固定下切牙;并将另一根线系在金属杆上以固定上门牙。
  4. 术前腹腔注射用0.1mL盐酸右美托咪定（0.1mg·kg-1·bw）和唑来地尔（盐酸替他明20mg·kg-1·bw和盐酸唑拉西泮20mg·kg-1·bw）溶于盐水中的溶液麻醉7周龄雄性小鼠。确保小鼠在整个手术过程中处于适当的麻醉状态。
    注意：注意药品的有效使用日期，不要使用过期药品。
  5. 通过用手指挤压后肢的脚趾来确认小鼠处于适当的麻醉状态。
    注意：如果小鼠对测试没有反应，则意味着它们失去知觉并且麻醉已达到所需的深度。此时，小鼠处于肢体肌肉松弛状态，呼吸和心率平稳，可以开始手术。
  6. 在小鼠的眼睛上使用兽医软膏以防止干燥，并将麻醉的小鼠置于手术台上的仰卧位。使用橡胶柱上的四根松紧带固定四肢，一根线连接到金属棒上以固定上门牙，另一根连接到两根上橡胶柱之间的松紧带以钩住下门牙以保持下颌张开。
  7. 准备闭合螺旋弹簧（0.25 毫米线径，直径 0.76 毫米，长度 1 毫米）用于正畸力矫治器。
    注意： 为每只鼠标剪下八根弹簧线。中间有四根长度为 1 毫米的螺纹用于受力器具，两端各有两根螺纹，用于使用钢结扎线进行结扎。
  8. 将弹簧的一端结扎到上颌骨左第一磨牙。用Q-tip在门牙上涂上粘合剂后，用0.1mm的钢结扎线将另一端绑扎到中切牙上，用光固化修复树脂加固，产生10g的稳定力，用测力计测量。
  9. 完成手术后，将小鼠与其他相同品系的小鼠一起放入笼子中，或将每只小鼠单独放入空笼中。确保小鼠在手术后2-4小时恢复足够的意识以保持胸骨卧位之前不会无人看管。在接下来的几天里，给小鼠喂食软食并定期观察，以确保没有并发症发生并确定术后疼痛的程度;根据需要给予镇痛药。
    注意：在完全康复之前，接受过手术的小鼠不应返回其他小鼠的陪伴。不要让术后小鼠与未麻醉的小鼠一起恢复。小鼠在恢复期间必须保持温暖。
  10. 每天检查正畸矫治器，排除任何移位的实验小鼠。

4. 标本采集

  1. 通过颈椎脱位在三个不同的时间点对小鼠实施安乐死：OTM开始后4天（d4），7天（d7）和10天（d10）。
  2. 用眼科剪刀将皮肤从颈部垂直切下，然后将头部与身体分开，并解剖头部的整个皮肤。
  3. 切除从双侧口鳃口肌到下颌骨后部区域的皮肤和颊肌。完全断开颊肌和附着在喙突上的肌腱，以去除下颌骨并修剪多余的骨头以获得完整的上颌骨。然后，去除双侧第三磨牙后面的骨头，撕下腭粘膜。最后，断开正畸矫治器，沿腭正中缝合线切断切牙之间的骨头，得到左右两侧的牙槽骨。
    注意： 确保从门牙到第三磨牙的区域两侧保持完整。

5.石蜡切片的准备

  1. 固定：将收获的牙槽骨浸入4%多聚甲醛中48小时，并在通风橱中用眼科剪刀修剪第6节和第7节。
  2. 脱钙：用1x PBS轻轻洗涤标本3 x 10分钟。在通用组织固定剂（pH 8.0）中脱钙标本，每2天用新鲜溶液更换一次，持续5周，直到骨头可以很容易地被针尖穿透。
  3. 脱水：在1x PBS中洗涤标本3 x 10分钟，然后依次将其浸入95%乙醇，100%乙醇和二甲苯中，每个溶液2 x 1小时。
  4. 将样品浸入二甲苯和石蜡的1：1混合物中30分钟，然后在65°C下浸入石蜡中过夜。
  5. 包埋：选择合适的包埋槽。将牙槽骨均匀放置，牙齿朝上在同一水平。从包埋槽中取出标本并将其转移到-20°C冰箱中，然后在石蜡完全冷却和固体时对它们进行编号。
  6. 使用切片机，在横向平面上连续切割20至40个4μm厚的切片，并漂浮在37°C的水面上。将切片粘附在显微镜载玻片上，并在42°C下烘烤过夜。

6. OTM距离测量

  1. 通过立体显微镜从咬合平面垂直拍摄三个时间点的标本。
  2. 用Micro-CT扫描仪扫描牙槽骨。按照制造商的说明，使用扫描仪的支持软件重建上颌牙槽骨最大矢状面的 3D 图像，其中三颗臼齿完全可见。
  3. 使用 ImageJ 软件测量 OTM 距离：
    1. 打开 ImageJ 软件并使用 直线工具 创建已知距离的线段。
    2. 单击 “分析 ”（Analyze），然后选择 “设置比例”（Set Scale ），在“已知距离”（ Known distance ） 中输入绘制的线距离值，并在“长度单位”（ Unit of length） 中输入单位。
    3. 在 M2 的近中边缘脊的中点和 M1 的远端边缘脊之间画一条线，然后单击 测量。“长度”列中显示的结果表示 OTM 距离。

7. 组织学分析

  1. 感兴趣区域 （ROI） 选择：将第一磨牙 （M1） 的牙槽骨定义为 ROI，正好位于上颌骨横截面 M1 的三个根内。该区域不仅在颊舌方向到达第一磨牙的皮质骨，而且还延伸到近颊根长轴的中部，包括远颊根和腭根之间的半区域。
  2. 成骨分析
    1. 钙黄绿素和茜素红双标记分析
      1. 钙黄绿素和茜素红制剂：将钙黄绿素溶解在 2% NaHCO3 溶液中至 1 mg/mL 中，将茜素红 S 溶解在 H 2 O 至2mg/mL 中。
        注：在这项研究中，钙黄绿素和茜素红是商业获得的。
      2. OTM 开始后，在第 1 天通过腹腔注射给予钙黄绿素 （20 mg·kg-1·bw），在第 8 天给予茜素红 S （40 mg·kg-1·bw）。在第10天对小鼠实施安乐死并收获肺泡骨。
      3. 按照步骤 5.1 和 5.3-5.5 准备标本并嵌入它们。有关详细信息，请参阅 Yang et al.30。
      4. 使用旋转切片机，在横向平面上连续切割5μm厚的切片。将切片粘附在显微镜载玻片上，并使用中性香脂用盖玻片安装。
        注意：其余样品必须在室温下用干燥剂储存。
      5. 在荧光显微镜下检查和拍摄切片，并根据前面描述的方法计算矿物质吸收率（MAR）和骨形成率（BFR / BS）30。
    2. 免疫荧光
      1. 选择合适的石蜡切片，在65°C烘烤30分钟。
      2. 脱蜡：将切片浸入二甲苯中5分钟，每次用新鲜二甲苯重复两次。
      3. 再水化：将切片依次浸入95%乙醇，75%乙醇，50%乙醇和ddH2O中，每次浸泡5分钟。
      4. 用1 x PBS轻轻洗涤切片2 x 5分钟。
      5. 抗原修复：将切片浸入Tris-HCl（0.05M，pH 8.0），EDTA（0.01M，pH 8.0）和蛋白酶K（10μg/ mL）的混合物中ddH2O中，并在37°C下孵育15分钟。
      6. 用 1 x PBS 轻轻洗涤切片 3 x 5 分钟。
      7. 阻塞：从切片中去除多余的液体，并使用疏水性记号笔在目标区域周围画一个圆圈。为了阻断非特异性结合，用含有10%牛血清白蛋白的封闭缓冲液覆盖，并在室温下孵育1小时。
        注意： 注意不要将切片干燥太久，以免影响结果。
      8. 一抗孵育：用抗体稀释液将抗骨桥蛋白（OPN）抗体稀释至推荐浓度，每个样品中加入30-50μL;在加湿室中在4°C孵育过夜。
        注意：务必在腔室中留下一些水并盖上盖子，以防止抗体液蒸发。
      9. 用1 x PBS轻轻洗涤切片3 x 10分钟。
        注意：步骤 7.2.2.10-7.2.2.12 应在黑暗中执行。
      10. 荧光二抗孵育：选择与一抗相对应的合适荧光二抗，稀释至推荐浓度。向每个样品中加入30-50μL，并在室温下孵育1小时。
      11. 用1 x PBS轻轻洗涤切片2 x 10分钟。
      12. 使用含有 4'6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 的抗淬灭封固剂封片试样。将这些部分存放在黑暗中并尽快拍照。
      13. 使用数码相机进行荧光显微镜检查和拍照切片，并对感兴趣区域 （ROI） 中的阳性细胞进行计数。
  3. 破骨细胞生成分析
    1. 抗酒石酸盐酸性磷酸酶 （TRAP） 染色
      1. 选择合适的石蜡切片。按照步骤7.2.2.1-7.2.2.3进行脱蜡和再水化。
      2. 根据制造商的说明，使用 TRAP 染色试剂盒制备新鲜染色溶液，并预热至 37°C。
      3. 向每个样品中加入30-50μL染色溶液，并在37°C下在加湿室中孵育20-30分钟。每 5 分钟检查一次，直到在光学显微镜下看到红色多核破骨细胞。用ddH2O终止反应。
      4. 在苏木精溶液中复染30秒，在1%氨溶液中浸泡1分钟，使蓝色稳定。用缓慢流动的自来水冲洗。
      5. 使用中性香脂用盖玻片安装切片并干燥过夜。
      6. 在显微镜下拍摄照片，并按照我们之前的方案30计算具有三个以上细胞核的TRAP阳性细胞的数量。
    2. 免疫荧光：使用推荐浓度的组织蛋白酶K（CTSK）抗体进行免疫荧光，并遵循上述第7节中描述的方案。

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Representative Results

使用该协议，我们建立了诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠 （Stat3Col1α2ERT2） 模型，以检查 STAT3 缺失对正畸力驱动的牙槽骨重塑的影响（图 1A、B）。通过牙槽骨的免疫荧光染色证实成骨细胞中的STAT3缺失（图1C）。

立体显微镜检查显示，WT小鼠在d4、d7和d10处的OTM距离增加。然而，在 Stat3Col1α2ERT2 小鼠中，OTM距离减小（图2B）。d10 的显微 CT 分析也证实了这一现象，表明成骨细胞 Stat3 缺失使 OTM 减速（图 2C）。

对于组织学分析，位于上颌骨横切面M1三个根内的区域被定义为ROI，它显示了牙槽骨重塑的整体情况（图3A）。苏木精-伊红染色和OPN免疫荧光染色显示ROI的整个牙槽骨（图3B，C）。

对于成骨分析，茜素红和钙黄绿素标记表明，正畸力增加了WT小鼠牙槽骨的矿物质附着率（MAR），但与WT小鼠相比，Stat3Col1α2ERT2小鼠OTM组的MAR降低（图4A）。此外，免疫荧光染色表明，在正畸力下，OPN+成骨细胞的数量增加，但Stat3Col1α2ERT2小鼠OTM组的OPN+成骨细胞少于WT小鼠（图4B）。对于破骨细胞分析，TRAP染色表明，在正畸力下，WT小鼠的破骨细胞数量增加，但Stat3Col1α2ERT2小鼠OTM组的破骨细胞少于WT小鼠（图4C）。CTSK的免疫荧光染色也证实了这一现象（图4D）。这些结果表明，成骨细胞 Stat3 缺乏会降低成骨细胞和破骨细胞对正畸力的活性，并损害牙齿运动过程中的骨重塑。

Figure 1
图 1：诱导型成骨细胞谱系特异性 Stat3 敲除小鼠模型生成的图示。 （A） 他莫昔芬诱导的表达 Col1α2 的成骨细胞中 Stat3 敲除的示意图（左）。实验方案：6周龄雄性野生型和Stat3Col1ERT2小鼠，自OTM模型构建前一周起，每2天给予TA（100 mg·kg-1·bw），并在OTM后处死对d4、d7和d10进行分析（右）。（B）诱导型成骨细胞谱系特异性Stat3敲除小鼠的杂交进展。（C） OTM 后 WT 和 Stat3Col1ERT2 小鼠第 10 天牙槽骨中 STAT3 和 OPN 的双重免疫荧光染色，以及非 OTM 侧和 OTM 侧双阳性细胞的定量。n = 5;比例尺 = 50 μm。该图来自Gong等人，26。缩写：STAT3=信号转导和转录激活因子3;Col1α = 胶原蛋白 1-α;TA = 他莫昔芬;WT = 野生型;OTM = 正畸牙齿移动;OPN = 骨桥蛋白;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2：Stat3 减速正畸牙齿移动的成骨细胞缺陷 （A） 体内 OTM 模型示意图。弹簧在切牙和第一磨牙 （M1） 之间结扎，并诱导正畸力将 M1 移向近中嵴。（B） WT 小鼠和 Stat3Col1α2ERT2 小鼠 OTM 后 d0、d4、d7 和 d10 的 OTM 距离。（C） 显微 CT 在 OTM 后 d10 上 WT 和 Stat3Col1α2ERT2 小鼠非 OTM 侧和 OTM 侧的代表性图像。n = 5。比例尺 = 1 mm （B）， 500 μm （C）。该图来自Gong等人26。缩写：STAT3=信号转导和转录激活因子3;Col1α = 胶原蛋白 1-α;WT = 野生型;OTM = 正畸牙齿移动;SAG = 矢状面。虚线表示 OTM 距离。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3：感兴趣区域的图示。 （A） ROI区域示意图。选择位于上颌骨横截面M1三个根部内的虚线区域作为ROI。M1的三个根包括近颊根、远颊根和腭根。（B） 小鼠 M1 整个牙槽骨的 HE 染色。（C） 小鼠 M1 整个肺泡骨中 OPN 的免疫荧光染色。比例尺 = 200 μm （B）， 100 μm （C）。该图来自Gong等人26。缩写：ROI = 感兴趣区域;MB = 近颊根;DB = 颊根;P = 腭根;HE = 苏木精-伊红;OPN = 骨桥蛋白;PDL = 牙周韧带。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4：Stat3 的成骨细胞缺乏损害了正畸力诱导的骨形成和吸收。 （A） 在 OTM 期间，WT 和 Stat3Col1α2ERT2 小鼠中钙黄绿素和茜素红 S 的连续荧光染料标记以及矿物质并集率的定量。n = 5。（B） WT 和 Stat3Col1α2ERT2 小鼠 OTM 后 d10 肺泡骨中 OPN+ 细胞的免疫荧光染色和定量。n = 5。（C） WT 和 Stat3Col1α2ERT2 小鼠 OTM 后 d4 肺泡骨中 TRAP 阳性细胞的 TRAP 染色和定量。n = 5。（D） WT 和 Stat3Col1α2ERT2 小鼠 OTM 后 d4 肺泡骨中 CTSK+ 细胞的免疫荧光染色和定量。n = 5。比例尺 = 10 μm （A）， 50 μm （B-D）。该图来自Gong等人26。缩写：STAT3=信号转导和转录激活因子3;Col1α = 胶原蛋白 1-α;WT = 野生型;OTM = 正畸牙齿移动;OPN = 骨桥蛋白;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;TRAP = 抗酒石酸盐酸性磷酸酶;MAR = 矿物并集率;CTSK = 组织蛋白酶 K. 请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

由于咬合不正是影响呼吸、咀嚼、说话甚至外观的最常见口腔疾病之一，因此对正畸的需求与日俱增，发病率从 70% 上升到 93%，根据之前的流行病学调查31,32。如何加速牙槽骨重塑，安全地提高正畸治疗效率，成为该领域的热点话题;因此，有必要阐明OTM驱动的牙槽骨重塑机制。在以往的研究中，研究人员利用体内药物注射来研究动物模型中OTM的机制21,33，简单易行，但很难排除药物对其他系统细胞的影响。因此，研究体内正畸力下骨重塑的机理十分必要。

近年来，基因敲除小鼠得到了广泛的应用，为基因功能的研究和治疗靶点的探索提供了坚实的基础34。在这些技术中，全基因敲除技术是最早的方法。采用Adrb2-/- 肾上腺素能受体（Adrb2）敲除小鼠模型探讨交感神经系统在OTM35期间牙槽骨重塑中的作用。然而，在某些情况下，全基因敲除小鼠可能导致胚胎致死，从而阻碍基因功能的研究。因此，开发了条件性敲除小鼠，靶向特定细胞类型中的基因。然而，由于与牙槽骨重塑相关的研究通常具有时效性，因此有必要在建模后观察牙槽骨在特定时间点的变化。

诱导条件性基因敲除小鼠具有DNA重组和组织特异性的时空调控双重优势，通过药物或激素的应用，可以在特定时间点和特定组织实现基因敲除，可以更好地满足研究需求。此外，STAT3是一种在骨等组织中广泛表达的转录因子，具有调节细胞增殖、分化、凋亡和免疫等重要功能25。我们之前报道过，非诱导成骨细胞特异性 Stat3 敲除小鼠的骨密度降低了28，表明非诱导条件性 Stat3 敲除小鼠不适合需要排除发育影响的牙槽骨重塑的机制研究。

因此，本研究采用基于Cre/loxP系统的诱导条件性基因敲除技术，制备了他莫昔芬诱导型成骨细胞特异性Stat3基因敲除小鼠Stat3Col1α2ERT2，该技术在时间和空间上是可控的，更适合于牙槽骨重塑机制的研究，以及结合谱系追踪进一步研究特定细胞和基因的功能。在他莫昔芬诱导前，Stat3Col1α2ERT2与野生型小鼠无明显差异，育种无特殊性。我们之前发现，Col1α2+ 成骨细胞中 Stat3 的诱导性缺失损害了成年小鼠的骨形成并减少了骨量28。本研究非OTM组Stat3Col1α2ERT2小鼠骨代谢水平下降，与既往结果一致。此外，由于OTM组的骨代谢水平在正畸力作用下下降更为显著，因此可以认为Stat3在机械力作用下对骨代谢的调节中发挥了重要作用。我们进一步探讨了Stat3调控骨重塑的机制。结果表明，Stat3通过调节Mmp3转录29，调节成骨细胞与破骨细胞之间的串扰，可直接促进成骨细胞分化28,29，并影响破骨细胞分化。

在该协议中，我们选择位于小鼠上颌骨横截面中M1三个根内的区域作为ROI来评估牙槽骨重塑。有了这个区域，牙槽骨的分析更接近于长骨的分析，在同一区域分析成骨和破骨细胞的活性，而不是传统的分析不同侧面特征的方法。此外，根据经典假设，应分别在压力侧和张力侧应用两种效果相反的药物，以加快牙齿移动速度。该方法为克服这些瓶颈提供了理论依据。在这个OTM模型中，正畸力的大小是通过使用测力计来测量的。然而，随着第一磨牙和门牙之间距离的减少，力会略有减弱。因此，有必要建立标准化的机械系统，以产生更恒定、更稳定的正畸力。

在协议中，应牢记一些关键步骤。首先，在OTM模型构建过程中，应牢固地结扎第一磨牙和切牙，以避免因移位而施力失败。其次，必须注意受力的方向，应将水平力施加到第一磨牙上，以避免施加垂直力造成拔牙。最后，在包埋时，应根据目标截面确定试件的取向，并及时观察切面，调整取向，以获得理想的切面。

总之，我们为OTM的诱导型、特异性基因敲除小鼠模型提供了方案，该模型揭示了不同时间点的牙槽骨重塑。我们将进一步利用这一点来研究特定细胞和基因的功能，并结合谱系追踪。然后，我们在OTM机制研究领域建立了 动态 和细胞特异性的体内模式，为临床正畸提供了证据。此外，本研究为构建OTM模型提供了详细的方案，该模型通过刺激成骨细胞和破骨细胞来实现快速骨重塑，并为研究响应机械力的骨重塑提供了理想的模型。不仅如此，我们还描述了分析OTM过程中牙槽骨重塑的方法，为骨骼力学生物学的研究提供了新的策略。

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Disclosures

作者没有利益冲突需要声明。

Acknowledgments

这项工作得到了中国国家自然科学基金（81870740、82071083、82271006、82101048、81800949）的部分资助;上海市自然科学基金资助项目（21ZR1436900， 22ZR1436700）;上海市学术/技术研究带头人计划（20XD1422300）;上海发展局临床研究计划（SHDC2020CR4084）;上海交通大学医学院附属第九人民医院交叉科研基金（JYJC201902、JYJC202116）;上海地方高水平高校创新研究团队（SSMUZLCX20180501）;研究学科基金编号上海交通大学医学院附属第九人民医院、上海交通大学口腔医学院KQYJXK2020;上海交通大学医学院附属第九人民医院原勘探项目（JYYC003）;上海交通大学医学院二百人才工程;上海交通大学医学院生物材料与再生医学研究院合作研究项目（2022LHB02）;上海交通大学医学院附属第九人民医院生物样本库项目（YBKB201909，YBKB202216）。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  P1020
4% paraformaldehyde Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1101
Alizarin red Sigma-Aldrich A5533
Anti-CTSK antibody Santa Cruz sc-48353
Anti-OPN antibody R&D Systems, Minneapolis, MN, USA AF808
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Closed-coil springs Innovative Material and Devices, Shanghai, China CS1006B
Col1α2CreERT2 mice A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences.
Dexmedetomidine hydrochloride Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTA Beyotime Biotechanology ST069
Embedding tanks Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd 80106-1100-16
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 100092183
ImageJ software NIH, Bethesda, MD, USA
Mounting medium with DAPI Beyotime Biotechanology P0131
Mouse dissection platform Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. HK105
Paraffin Sangon biotech Co., Ltd. A601889
Primers for genotyping Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease K Sigma-Aldrich 539480
Self-curing restorative resin 3M ESPE, St. Paul, MN, USA 712-035
Stat3fl/fl mice GemPharmatech Co., Ltd D000527
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648
TRAP staining kit Sigma-Aldrich 387A
Tris-HCl Beyotime Biotechanology ST780
Universal tissue fixative Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1105
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10023418
Zoletil VIRBAC 

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References

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医学，第 197 期，正畸牙齿移动、骨代谢、机械力、动物模型、STAT3 在成骨细胞中的作用、他莫昔芬诱导小鼠模型、正畸力、牙槽骨表型、显微 CT、立体显微镜、组织学分析、成骨细胞、破骨细胞
使用诱导型成骨细胞谱系特异性 <em>Stat3</em> 敲除小鼠研究正畸牙齿移动过程中的牙槽骨重塑
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Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong,… More

Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong, X., Yang, Y., Zhu, Y., Xu, H., Jin, A., Huang, X., Gao, X., Lu, T., Liu, J., Wang, X., Dai, Q., Jiang, L. Using Inducible Osteoblastic Lineage-Specific Stat3 Knockout Mice to Study Alveolar Bone Remodeling During Orthodontic Tooth Movement. J. Vis. Exp. (197), e65613, doi:10.3791/65613 (2023).

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