Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

استخدام الفئران بالضربة القاضية Stat3 الخاصة بالنسب العظمية لدراسة إعادة تشكيل العظام السنخية أثناء حركة الأسنان التقويمية

Published: July 21, 2023 doi: 10.3791/65613
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, *6, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 2,3,4,5,7, 1,2,3,4,5
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University, 3National Center for Stomatology, 4National Clinical Research Center for Oral Diseases, 5Shanghai Key Laboratory of Stomatology, 6Shanghai Starriver Bilingual School, 7The 2nd Dental Center, Ninth People’s Hospital, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

توفر هذه الدراسة بروتوكولا لاستخدام الفئران بالضربة القاضية Stat3 الخاصة بنسب بانيات العظم لدراسة إعادة تشكيل العظام تحت قوة تقويم الأسنان وتصف طرق تحليل إعادة تشكيل العظام السنخية أثناء حركة الأسنان التقويمية ، وبالتالي إلقاء الضوء على البيولوجيا الميكانيكية للهيكل العظمي.

Abstract

العظم السنخي ، مع معدل دوران مرتفع ، هو العظم الأكثر نشاطا في إعادة تشكيل الجسم. حركة الأسنان التقويمية (OTM) هي عملية اصطناعية شائعة لإعادة تشكيل العظام السنخية استجابة للقوة الميكانيكية ، لكن الآلية الأساسية تظل بعيدة المنال. لم تتمكن الدراسات السابقة من الكشف عن الآلية الدقيقة لإعادة تشكيل العظام في أي زمان ومكان بسبب القيود المتعلقة بالنماذج الحيوانية. يعد محول الإشارة ومنشط النسخ 3 (STAT3) مهما في استقلاب العظام ، لكن دوره في بانيات العظم أثناء OTM غير واضح. لتقديم دليل في الجسم الحي على أن STAT3 يشارك في OTM في نقاط زمنية محددة وفي خلايا معينة أثناء OTM ، قمنا بإنشاء نموذج فأر Stat3 بالضربة القاضية الخاص بسلالة عقار تاموكسيفين ، وطبقنا قوة تقويم الأسنان ، وحللنا النمط الظاهري للعظام السنخية.

تم استخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (Micro-CT) والفحص المجهري الاستريو للوصول إلى مسافة OTM. اختار التحليل النسيجي المنطقة الواقعة داخل ثلاثة جذور من الضرس الأول (M1) في المقطع العرضي لعظم الفك العلوي كمنطقة الاهتمام (ROI) لتقييم النشاط الأيضي لبانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم ، مما يشير إلى تأثير قوة تقويم الأسنان على العظم السنخي. باختصار ، نحن نقدم بروتوكولا لاستخدام الفئران بالضربة القاضية Stat3 ذات النسب المستحثة لدراسة إعادة تشكيل العظام تحت قوة تقويم الأسنان ووصف طرق تحليل إعادة تشكيل العظام السنخية أثناء OTM ، وبالتالي إلقاء ضوء جديد على البيولوجيا الميكانيكية للهيكل العظمي.

Introduction

من المعروف عموما أن العظام تخضع لإعادة بناء مستمرة طوال الحياة ، استجابة للقوى الميكانيكية وفقا لقانون وولف 1,2. يحافظ التحفيز الميكانيكي المناسب ، مثل الجاذبية والتمارين اليومية ، على كتلة العظام وقوتها ويمنع فقدان العظام عن طريق تحفيز كل من بانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم. تحافظ الخلايا العظمية ، المسؤولة عن ارتشاف العظام3،4،5،6،7 ، وبانيات العظم ، المسؤولة عن تكوين العظام8،9،10 ، على توازن العظام وتعمل بشكل مشترك في العملية البيولوجية لإعادة تشكيل العظام. في المقابل ، في غياب محفزات التحميل ، كما هو الحال في رواد الفضاء تحت الجاذبية الصغرى طويلة الأجل ، تعاني العظام من فقدان كثافة المعادن في العظام بنسبة 10٪ ، مما يزيد من خطر الإصابة بهشاشة العظام11,12. علاوة على ذلك ، ظهرت العلاجات الميكانيكية غير الغازية والمريحة ، بما في ذلك تقويم الأسنان وتكوين العظم المشتت ، كعلاجات لأمراض العظام13،14. كل هذه أظهرت أن القوة الميكانيكية تلعب دورا حاسما في الحفاظ على جودة العظام وكميتها. قامت الدراسات الحديثة بشكل عام بتحليل إعادة تشكيل العظام استجابة للتحميل الميكانيكي باستخدام نماذج تستغرق وقتا طويلا مثل اختبارات تعليق عجلة الجري والذيل ، والتي تستغرق عادة 4 أسابيع أو أكثر لمحاكاة تحميل القوة أو التفريغ15,16. لذلك ، هناك طلب على نموذج حيواني مناسب وفعال لدراسة إعادة تشكيل العظام مدفوعة بتحميل القوة.

العظم السنخي هو الأكثر نشاطا من حيث إعادة تشكيل العظام ، مع معدل دوران مرتفع17. حركة تقويم الأسنان (OTM) ، وهي علاج شائع لسوء الإطباق ، هي عملية اصطناعية لإعادة تشكيل العظام السنخية استجابة للقوة الميكانيكية. ومع ذلك ، فإن OTM ، الذي يحفز إعادة تشكيل العظامبسرعة 18 ، هو أيضا وسيلة موفرة للوقت لدراسة آثار القوة الميكانيكية على إعادة تشكيل العظام مقارنة بالنماذج الأخرى ذات الفترة التجريبية الطويلة. لذلك ، يعد OTM نموذجا مثاليا لدراسة إعادة تشكيل العظام تحت المحفزات الميكانيكية. من الجدير بالذكر أن آلية إعادة تشكيل العظام السنخية غالبا ما تكون حساسة للوقت ، ومن الضروري ملاحظة التغيرات في إعادة تشكيل العظام السنخية في نقاط زمنية معينة بعد النمذجة. مع المزايا المزدوجة للتحكم الزماني والمكاني في إعادة تركيب الحمض النووي وخصوصية الأنسجة ، يعد نموذج فأر الضربة القاضية للجين الشرطي المستحث خيارا مناسبا لدراسات OTM.

تقليديا ، تم تقسيم إعادة تشكيل العظام السنخية بوساطة OTM إلى مناطق توتر تتضمن تكوين العظام ومناطق ضغط تتضمن ارتشاف العظام19،20،21 ، وهو أكثر تفصيلا ولكن يصعب تنظيمه. علاوة على ذلك ، أفاد يوري وآخرون أن وقت تكوين العظام في OTM يختلف على جانبي التوتر والضغط22. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت دراسة سابقة أن الضرس الأول يمكن أن يبدأ إعادة تشكيل واسعة للعظم السنخي الفكي العلوي تحت قوة تقويم الأسنان ، والتي لم تكن مقيدة بمناطق التوتر والضغط23. لذلك ، اخترنا المنطقة الواقعة داخل ثلاثة جذور من M1 في المقطع العرضي لعظم الفك العلوي كمنطقة الاهتمام (ROI) ووصفنا طرقا لتقييم نشاط بانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم في نفس المنطقة لتقييم إعادة تشكيل العظم السنخي تحت OTM.

كعامل نسخ نووي ، ثبت أن محول الإشارة ومنشط النسخ 3 (STAT3) حاسمان في توازن العظام24,25. أفادت الدراسات السابقة عن انخفاض كثافة المعادن في العظام والكسور المرضية المتكررة في الفئران الطافرة Stat3 26,27. أظهرت دراستنا السابقة أن حذف Stat3 في بانيات العظم Osx + تسبب في تشوه قحفي وجهي وهشاشة العظام ، بالإضافة إلى كسر العظام التلقائي28. في الآونة الأخيرة ، قدمنا أدلة في الجسم الحي مع نموذج ماوس حذف Stat3 خاص ببانيات العظم (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/ fl ، المشار إليها فيما يلي Stat3Col1α2ERT2) أن STAT3 أمر بالغ الأهمية في التوسط في تأثيرات قوة تقويم الأسنان التي تقود إعادة تشكيل العظام السنخية29. في هذه الدراسة ، نقدم طرقا وبروتوكولات لاستخدام الفئران الضربة القاضية Stat3 الخاصة بنسب بانيات العظم لدراسة إعادة تشكيل العظام تحت قوة تقويم الأسنان ووصف طرق تحليل إعادة تشكيل العظام السنخية أثناء OTM ، وبالتالي إلقاء الضوء على البيولوجيا الميكانيكية للهيكل العظمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق التي تنطوي على الموصوفة هنا من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى شنغهاي الشعبي التاسع ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (رقم 82101048).

1. إنشاء فئران بالضربة القاضية Stat3 الخاصة بنسب بانيات العظم

ملاحظة: تم الحصول على الفئران Stat3 fl/ fl تجاريا. كانت سلالة Col1α2CreERT2هدية (انظر جدول المواد للحصول على جميع التفاصيل). تم توفير طعام وماء حبيبات المختبر الموحدة والظروف البيئية المختبرية القياسية (درجة حرارة الغرفة عند 22 درجة مئوية إلى 26 درجة مئوية والرطوبة عند 50٪ -55٪) لجميع.

  1. ضع فأرا ذكرا ناضجا جنسيا مع فأرتين إناث في نفس القفص. بعد 18 يوما ، تحقق من الأطفال حديثي الولادة كل يوم. أخرج أي إناث من الفئران الحوامل إلى قفص فارغ واحتفظ بها بمفردها إذا لزم الأمر. ضع الفئران الذكور في أقفاص تربية مختلفة أخرى إذا لم تكن إناث الفئران حاملا في غضون 30 يوما.
  2. توليد Stat3fl / + ؛ الفئران Col1α2 CreERT2 عن طريق تهجين الفئران Stat3 fl/ fl مع الفئران Col1α2CreERT2 ؛ الحفاظ على كل هذه الفئران على خلفية C57BL / 6. جمع نصائح الذيل 2-5 مم للتنميط الجيني والحفاظ على ذكر Stat3fl / + ؛ فئران Col1α2CreERT2 حتى تنضج جنسيا (F1).
  3. تهجين ذكر يبلغ من العمر 6 أسابيع Stat3fl/ + ؛ الفئران Col1α2CreERT2 مع إناث الفئران Stat3fl / fl. جمع أطراف الذيل 2-5 مم عندما يكون عمر الفئران أسبوعين للتنميط الجيني ، والحفاظ على ذكر Stat3 fl/ fl ؛ Col1α2 CreERT2 (Stat3Col1α2ERT2) الفئران حتى تنضج جنسيا (F2).
  4. تهجين ذكر Stat3 fl / fl البالغ من العمر 6 أسابيع ؛ الفئران Col1α2CreERT2 مع إناث الفئران Stat3fl / fl (F3). اجمع أطراف الذيل 2-5 مم عندما يبلغ عمر الفئران أسبوعين للتنميط الجيني ، واستخدم الفئران الأصغر سنا من نفس النمط الوراثي لتحل محل الفئران الأكبر سنا عند الاقتضاء (F3 + N).
    ملاحظة: تنخفض القدرة التناسلية للفئران بعد عمر 8 أشهر ، لذلك يجب مراقبة الفئران في أقفاص التكاثر بعناية واستبدالها حسب الحاجة. بالإضافة إلى ذلك ، وفقا للمتطلبات التجريبية ، يجب زيادة عدد أقفاص التكاثر بشكل مناسب لتجنب انقراض الفئران الجينية المستهدفة.

2. الحذف المستحث ل Stat3 في بانيات العظم المعبرة عن Col1α2 بواسطة عقار تاموكسيفين

  1. قم بإذابة عقار تاموكسيفين في زيت الذرة إلى 20 مجم / مل في أنبوب طرد مركزي ، وحفظه من الضوء عن طريق لفه بورق الألمنيوم. ضع أنبوب الطرد المركزي المغطى بالرقائق على خلاط دوار واخلطه في درجة حرارة الغرفة حتى يذوب تماما.
    ملاحظة: تم الحصول على عقار تاموكسيفين تجاريا وتخزينه في الظلام عند 4 درجات مئوية.
  2. اختر عشرة فئران ذكور تبلغ من العمر 6 أسابيع وقسمها إلى مجموعات Stat3 fl / fl و Stat3 Col1α2ERT2 مع خمسة فئران في كل مجموعة. تطبيق عقار تاموكسيفين (100 ملغ·كغ-1·وزن الجسم) كل يومين لمدة أسبوع واحد عن طريق الحقن داخل الصفاق.

3. نموذج حركة الأسنان التقويمية (OTM)

  1. قم بإعداد منصة تشريح فأر بلاستيكية معقمة كطاولة عمليات لشل حركة الفئران.
    ملاحظة: تم الحصول على طاولة تشريح الماوس تجاريا وتتألف من أربعة أعمدة مطاطية قابلة للتعديل وقضيب معدني واحد لشل حركة الفئران. استخدم الأدوات والأدوات المعقمة طوال العملية.
  2. قم بتوصيل شريط مطاطي بكل عمود مطاطي لتثبيت الأطراف.
  3. اربط شريطا مطاطيا واحدا بين العمودين المطاطيين العلويين ؛ اربط خيطا بالشريط المطاطي لتثبيت القواطع السفلية ؛ واربط خيطا آخر بالقضيب المعدني لتثبيت القواطع العلوية.
  4. تخدير ذكور الفئران البالغة من العمر 7 أسابيع بمحلول 0.1 مل من ديكسميديتوميدين هيدروكلوريد (0.1 ملغ·كغ-1· وزن الجسم) وزوليتيل (تيلتامين هيدروكلوريد ل 20 ملغ·كغ-1· وزن الجسم وزولازيبام هيدروكلوريد ل 20 ملغ·كغ-1· وزن الجسم) المذاب في محلول ملحي عن طريق الحقن داخل الصفاق قبل الجراحة. تأكد من أن الفئران تحت التخدير المناسب طوال العملية.
    ملاحظة: انتبه إلى تاريخ الاستخدام الفعال للأدوية ، ولا تستخدم الأدوية منتهية الصلاحية.
  5. تأكد من أن الفئران تحت التخدير المناسب عن طريق الضغط على أصابع الأطراف الخلفية بالأصابع.
    ملاحظة: إذا لم تستجب الفئران للاختبار ، فهذا يعني أنها فاقدة للوعي وأن التخدير قد وصل إلى العمق المطلوب. في ذلك الوقت ، تكون الفئران في حالة استرخاء عضلات الأطراف ، مع التنفس السلس ومعدل ضربات القلب ، ويمكن بدء العملية.
  6. استخدم مرهم الطبيب البيطري على عيون الفئران لمنع الجفاف ووضع الماوس المخدر في وضع ضعيف على طاولة العمليات. استخدم أربعة أشرطة مرنة على الأعمدة المطاطية لتثبيت الأطراف ، خيط واحد متصل بالقضيب المعدني لتثبيت القواطع العلوية وآخر متصل بشريط مطاطي بين العمودين المطاطيين العلويين للربط فوق القواطع السفلية لإبقاء الفك السفلي مفتوحا.
  7. قم بإعداد نوابض ملفوفة مغلقة (حجم سلك 0.25 مم ، قطر 0.76 مم ، طول 1 مم) لأجهزة قوة تقويم الأسنان.
    ملاحظة: قطع ثمانية خيوط من الربيع لكل ماوس. أربعة خيوط بطول 1 مم في المنتصف لجهاز القوة وخيطان على كل طرف للأربطة باستخدام سلك رباط فولاذي.
  8. ربط أحد طرفي الربيع المعد للضرس الأول الأيسر الفكي. اربط الطرف الآخر بالقاطعة المركزية بسلك رباط فولاذي 0.1 مم معزز براتنج ترميمي معالج بالضوء بعد وضع مادة لاصقة على القواطع باستخدام Q-tip لتوليد قوة مستقرة بحجم 10 g مقاسة باستخدام مقياس دينامومتر.
  9. بعد الانتهاء من العملية ، ضع الفئران في قفص مع آخرين من نفس السلالة في الانتعاش ، أو ضع كل فأر في قفص فارغ وحده. تأكد من عدم ترك الفئران دون مراقبة حتى تستعيد وعيها الكافي بعد 2-4 ساعات من العملية للحفاظ على الاستلقاء القصي. في الأيام القليلة المقبلة ، قم بإطعام الفئران نظاما غذائيا ناعما ومراقبتها بانتظام لضمان عدم حدوث مضاعفات والتأكد من درجة الألم بعد الجراحة ؛ تطبيق الأدوية المسكنة حسب الحاجة.
    ملاحظة: لا ينبغي إعادة الفئران التي خضعت لعملية جراحية إلى شركة الفئران الأخرى حتى تتعافى تماما. لا تضع الفئران بعد الجراحة في الشفاء مع الفئران التي لم يتم تخديرها. يجب أن تبقى الفئران دافئة أثناء الشفاء.
  10. افحص جهاز تقويم الأسنان كل يوم واستبعد أي فئران تجريبية مصابة بالإزاحة.

4. جمع العينات

  1. القتل الرحيم للفئران في ثلاث نقاط زمنية مختلفة عن طريق خلع عنق الرحم: 4 أيام (d4) ، 7 أيام (d7) ، و 10 أيام (d10) بعد بدء OTM.
  2. استخدم مقص العيون لقطع الجلد عموديا عن منطقة عنق الرحم ثم فصل الرأس عن الجسم مع تشريح جلد الرأس بالكامل.
  3. قطع الجلد والعضلات buccinator من angulus الثنائي oris إلى المنطقة الخلفية من الفك السفلي. افصل تماما عضلات الشدق والأوتار المرتبطة بالغرابي لإزالة الفك السفلي وتقليم العظام الزائدة للحصول على الفك العلوي الكامل. ثم ، قم بإزالة العظم خلف الأضراس الثالثة الثنائية وتمزيق الغشاء المخاطي الحنكي. أخيرا ، افصل جهاز تقويم الأسنان واقطع العظم بين القواطع على طول الخيط الحنكي المتوسط للحصول على العظم السنخي للجانبين الأيمن والأيسر.
    ملاحظة: تأكد من الحفاظ على المنطقة من القواطع إلى الضرس الثالث سليمة على كلا الجانبين.

5. التحضير لقسم البارافين

  1. التثبيت: اغمر العظم السنخي المحصود في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 48 ساعة وقم بتقليمه بمقص العيون في غطاء الدخان للقسمين 6 و 7.
  2. إزالة الكالكالس: اغسل العينات برفق باستخدام 1x PBS لمدة 3 × 10 دقائق. إزالة الكلسات من العينات في مثبت الأنسجة العالمي (درجة الحموضة 8.0) ، واستبدالها بمحلول جديد كل يومين ، لمدة 5 أسابيع حتى يمكن اختراق العظام بسهولة بواسطة طرف إبرة.
  3. الجفاف: اغسل العينات في 1x PBS لمدة 3 × 10 دقائق ، ثم اغمرها بالتتابع في 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول وزيلين لمدة 2 × 1 ساعة لكل محلول.
  4. اغمر العينات في مزيج 1: 1 من الزيلين والبارافين لمدة 30 دقيقة ثم في البارافين عند 65 درجة مئوية طوال الليل.
  5. التضمين: حدد خزانات التضمين المناسبة. ضع العظم السنخي بشكل موحد مع رفع الأسنان على نفس المستوى. قم بإزالة العينات من خزان التضمين وانقلها إلى مجمد -20 درجة مئوية ، ثم قم بترقيمها عندما يبرد البارافين تماما ويكون صلبا.
  6. باستخدام ميكروتوم ، قم بقطع عشرين إلى أربعين قسما بسمك 4 ميكرومتر بشكل مستمر في المستوى العرضي وتطفو على 37 درجة مئوية من الماء. قم بلصق الأقسام بشرائح المجهر واخبزها على حرارة 42 درجة مئوية طوال الليل.

6. قياس المسافة OTM

  1. صور عينات من ثلاث نقاط زمنية عموديا من مستوى الإطباق بواسطة المجهر الاستريو.
  2. افحص العظم السنخي باستخدام ماسح Micro-CT. إعادة بناء صور 3D للمستوى السهمي الأقصى للعظم السنخي الفكي العلوي ، حيث تكون ثلاثة أضراس مرئية تماما ، باستخدام برنامج دعم الماسح الضوئي باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  3. قياس مسافة OTM باستخدام برنامج ImageJ:
    1. افتح برنامج ImageJ واستخدم أداة الخط المستقيم لإنشاء قطعة خطية من المسافة المعروفة.
    2. انقر فوق تحليل واختر ضبط المقياس لإدخال قيمة مسافة الخط المرسوم في المسافة المعروفة وإدخال الوحدات بوحدة الطول.
    3. ارسم خطا بين نقاط المنتصف للحافة الهامشية المتوسطة ل M2 والحافة الهامشية البعيدة ل M1 وانقر فوق القياس. تمثل النتائج الموضحة في عمود الطول مسافة OTM.

7. التحليل النسيجي

  1. اختيار منطقة الاهتمام (ROI): حدد العظم السنخي للضرس الأول (M1) على أنه عائد الاستثمار ، الموجود بالضبط داخل ثلاثة جذور ل M1 في القسم العرضي عند عظم الفك العلوي. لا تصل هذه المنطقة إلى العظم القشري للضرس الأول في الاتجاه الشدقي اللساني فحسب ، بل تمتد أيضا إلى منتصف المحور الطويل لجذر منتصف الشدق ، بما في ذلك نصف المنطقة الواقعة بين جذر الشدق والجذر الحنكي.
  2. تحليل تكون العظم
    1. وضع العلامات والتحليل المزدوج على الكالسيين والأليزارين الأحمر
      1. تحضير الكالسيين والأليزارين الأحمر: يذوب الكالسيين في محلول NaHCO3 2٪ إلى 1 مجم / مل وأليزارين ريد إس في H 2 O إلى2مجم / مل.
        ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم الحصول على الكالسيين والأليزارين الأحمر تجاريا.
      2. يتم تطبيق الكالسيين (20 ملغ·كغ-1·وزن الجسم) في اليوم الأول وأليزارين ريد إس (40 ملغ·كغ-1·وزن الجسم) في اليوم 8 عن طريق الحقن داخل الصفاق بعد بدء استخدام OTM. القتل الرحيم للفئران في اليوم 10 وحصاد العظم السنخي.
      3. قم بإعداد العينات وتضمينها باتباع الخطوات 5.1 و 5.3-5.5. لمزيد من التفاصيل ، راجع Yang et al.30.
      4. باستخدام ميكروتوم دوار ، قم بقطع مقاطع بسمك 5 ميكرومتر بشكل مستمر في المستوى العرضي. التمسك المقاطع إلى شرائح المجهر وجبل مع أغطية باستخدام بلسم محايد.
        ملاحظة: يجب تخزين بقية العينات مع مادة مجففة في درجة حرارة الغرفة.
      5. فحص وتصوير الأقسام تحت المجهر الفلوري وحساب معدل تركيب المعادن (MAR) ومعدل تكوين العظام (BFR / BS) وفقا للطريقة الموضحة سابقا30.
    2. التألق المناعي
      1. اختر أقسام البارافين المناسبة واخبزها على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      2. إزالة الشمع: اغمر الأقسام في الزيلين لمدة 5 دقائق وكرر مرتين مع الزيلين الطازج في كل مرة.
      3. الإماهة: اغمر الأقسام بالتتابع في 95٪ إيثانول ، 75٪ إيثانول ، 50٪ إيثانول ، و ddH2O ، كل منها لمدة 5 دقائق.
      4. اغسل الأقسام برفق باستخدام 1 × PBS لمدة 2 × 5 دقائق.
      5. استرجاع المستضد: اغمر الأقسام في خليط من Tris-HCl (0.05 M ، pH 8.0) ، EDTA (0.01 M ، pH 8.0) ، والبروتياز K (10 ميكروغرام / مل) في ddH2O واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      6. اغسل الأقسام برفق باستخدام 1 × PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
      7. كتلة: قم بإزالة السوائل الزائدة من الأقسام وارسم دائرة حول المنطقة المستهدفة باستخدام علامة كارهة للماء. لمنع الربط غير النوعي ، قم بتغطيته بمخزن مؤقت مانع يحتوي على 10٪ من ألبومين مصل الأبقار واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
        ملاحظة: احرص على عدم تجفيف الأقسام لفترة طويلة ، حتى لا تؤثر على النتائج.
      8. حضانة الأجسام المضادة الأولية: تمييع الجسم المضاد للأوستيوبونتين (OPN) مع مخفف الأجسام المضادة إلى التركيز الموصى به ، وإضافة 30-50 ميكرولتر لكل عينة ؛ احتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها في غرفة مرطبة.
        ملاحظة: تأكد من ترك بعض الماء في الحجرة وتغطيته لمنع سائل الأجسام المضادة من التبخر.
      9. اغسل الأقسام برفق باستخدام 1 × PBS لمدة 3 × 10 دقائق.
        ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات 7.2.2.10-7.2.2.12 في الظلام.
      10. حضانة الأجسام المضادة الثانوية الفلورية: حدد جسما مضادا ثانويا فلوريا مناسبا يتوافق مع الجسم المضاد الأساسي وقم بتخفيفه إلى التركيز الموصى به. أضف 30-50 ميكرولتر لكل عينة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
      11. اغسل الأقسام برفق باستخدام 1 × PBS لمدة 2 × 10 دقائق.
      12. استخدم وسيط تركيب مضاد للتلاشي مع 4'6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) لتركيب العينات. قم بتخزين الأقسام في الظلام وتصويرها في أسرع وقت ممكن.
      13. قم بإجراء الفحص المجهري الفلوري الذي يتضمن كاميرا رقمية لفحص وتصوير الأقسام وحساب الخلايا الإيجابية في المناطق ذات الاهتمام (ROIs).
  3. تحليل تكوين العظم
    1. تلطيخ حمض الفوسفاتيز المقاوم للطرطرات (TRAP)
      1. حدد أقسام البارافين المناسبة. قم بإزالة الشمع وإعادة الترطيب باتباع الخطوات 7.2.2.1-7.2.2.3.
      2. قم بإعداد محلول تلطيخ جديد باستخدام مجموعة التلوين TRAP وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وقم بالتسخين المسبق إلى 37 درجة مئوية.
      3. أضف 30-50 ميكرولتر من محلول التلوين إلى كل عينة واحتضانها عند 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة لمدة 20-30 دقيقة. تحقق كل 5 دقائق حتى يتم رؤية الخلايا الآكلة للعظم الأحمر متعدد النوى تحت المجهر الضوئي. أوقف التفاعل مع ddH2O.
      4. مسحة مضادة في محلول الهيماتوكسيلين لمدة 30 ثانية وتغمر في محلول الأمونيا 1 ٪ لمدة 1 دقيقة للحصول على لون أزرق مستقر. شطف تحت ماء الصنبور بطيء الجريان.
      5. قم بتركيب الأقسام باستخدام أغطية باستخدام بلسم محايد وجففها طوال الليل.
      6. التقط صورا تحت المجهر واحسب عدد الخلايا الإيجابية ل TRAP التي تحتوي على أكثر من ثلاث نوى ، باتباع بروتوكولنا السابق30.
    2. التألق المناعي: استخدم الجسم المضاد للكاثيبسين K (CTSK) بالتركيز الموصى به للتألق المناعي واتبع البروتوكول الموضح في القسم 7 أعلاه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام هذا البروتوكول ، أنشأنا ماوس Stat3 بالضربة القاضية الخاص بنسب بانيات العظم (Stat3Col1α2ERT2) لفحص آثار حذف STAT3 على إعادة تشكيل العظام السنخية المدفوعة بقوة تقويم الأسنان (الشكل 1A ، B). تم تأكيد حذف STAT3 في بانيات العظم من خلال تلطيخ العظم المناعي للعظم السنخي (الشكل 1C).

أشار المجهر الاستريو إلى أن مسافة OTM لفئران WT زادت في d4 و d7 و d10. ومع ذلك ، في الفئران Stat3Col1α2ERT2 ، تم تقليل مسافة OTM (الشكل 2B). تم تأكيد هذه الظاهرة أيضا من خلال تحليل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق على d10 ، مما يشير إلى أن حذف Stat3 العظمي أدى إلى تباطؤ OTM (الشكل 2C).

للتحليل النسيجي ، تم تعريف المنطقة الواقعة داخل ثلاثة جذور من M1 في القسم العرضي في عظم الفك العلوي على أنها عائد استثمار ، مما يدل على الوضع العام لإعادة تشكيل العظام السنخية (الشكل 3 أ). أظهر تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين وتلطيخ OPN المناعي العظم السنخي بأكمله لعائد الاستثمار (الشكل 3B ، C).

بالنسبة للتحليل العظمي ، أشار وضع العلامات على أحمر الأليزارين والكالسيين إلى أن قوة تقويم الأسنان زادت من معدل وضع المعادن (MAR) للعظام السنخية في الفئران WT ، ولكن تم تقليل MAR في مجموعة OTM من الفئران Stat3Col1α2ERT2 مقارنة بفئران WT (الشكل 4A). علاوة على ذلك ، أظهر تلطيخ التألق المناعي أن عدد بانيات العظم OPN + زاد تحت قوة تقويم الأسنان ، ولكن كان هناك عدد أقل من بانيات العظم OPN + في مجموعة OTM من الفئران Stat3Col1α2ERT2 مقارنة بالفئران WT (الشكل 4B). بالنسبة لتحليل الخلايا العظمية ، أشار تلطيخ TRAP إلى أنه تحت قوة تقويم الأسنان ، زاد عدد الخلايا الآكلة للعظم في الفئران WT ، ولكن كان هناك عدد أقل من الخلايا الآكلة للعظم في مجموعة OTM من الفئران Stat3Col1α2ERT2 مقارنة بفئران WT (الشكل 4C). تم تأكيد هذه الظاهرة أيضا من خلال تلطيخ التألق المناعي ل CTSK (الشكل 4D). كشفت هذه النتائج أن نقص Stat3 العظمي يقلل من نشاط كل من بانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم استجابة لقوة تقويم الأسنان وضعف إعادة تشكيل العظام أثناء حركة الأسنان.

Figure 1
الشكل 1: رسم توضيحي لجيل نموذج ماوس Stat3 بالضربة القاضية الخاص بنسب بانيات العظم المستحثة. (أ) رسم تخطيطي للضربة القاضية Stat3 في بانيات العظم المعبرة عن Col1α2 التي يسببها عقار تاموكسيفين (يسار). مخطط التجربة: تم إعطاء ذكور الفئران البرية البالغة من العمر 6 أسابيع و Stat3Col1ERT2 TA (100 mg · kg-1 · bw) كل يومين من أسبوع قبل بناء نموذج OTM وتم التضحية بها للتحليل على d4 و d7 و d10 بعد OTM (يمين). (ب) تقدم التهجين لفئران Stat3 بالضربة القاضية الخاصة بنسب بانيات العظم المستحثة. (ج) تلطيخ مزدوج مناعي ل STAT3 و OPN في العظم السنخي لفئران WT و Stat3Col1ERT2 على d10 بعد OTM وتقدير كمية الخلايا الإيجابية المزدوجة على الجوانب غير OTM وجوانب OTM. ن = 5 ؛ قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. هذا الرقم مأخوذ من Gong et al. 26. الاختصارات: STAT3 = محول إشارة ومنشط النسخ 3 ؛ Col1α = الكولاجين 1-ألفا ؛ TA = تاموكسيفين ؛ WT = النوع البري ؛ OTM = حركة الأسنان التقويمية. OPN = أوستيوبونتين. DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: نقص بانيات العظم في Stat3 تباطؤ حركة تقويم الأسنان (A) الرسم التخطيطي لنموذج OTM في الجسم الحي. ربط الزنبرك بين القواطع والضرس الأول (M1) وحفز قوة تقويم الأسنان على تحريك M1 نحو التلال المتوسطة. (ب) مسافة OTM ل d0 و d4 و d7 و d10 بعد OTM في الفئران WT والفئران Stat3Col1α2ERT2 . (ج) صور تمثيلية للجوانب غير OTM وجوانب OTM في الفئران WT و Stat3Col1α2ERT2 على d10 بعد OTM بواسطة التصوير المقطعي المحوسب الدقيق. ن = 5. قضبان المقياس = 1 مم (B) ، 500 ميكرومتر (C). هذا الرقم مأخوذ من Gong et al.26. الاختصارات: STAT3 = محول إشارة ومنشط النسخ 3 ؛ Col1α = الكولاجين 1-ألفا ؛ WT = النوع البري ؛ OTM = حركة الأسنان التقويمية. SAG = المستوى السهمي. تشير المنحنيات المتقطعة إلى مسافة OTM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: رسم توضيحي لمناطق الاهتمام . (أ) رسم تخطيطي لمناطق عائد الاستثمار. تم اختيار المنطقة المنقطة الواقعة داخل ثلاثة جذور من M1 في المقطع العرضي للفك العلوي كعائد على الاستثمار. تشمل الجذور الثلاثة ل M1 جذر منتصف الشدق وجذر الشدق النقي والجذر الحنكي. ب: تلطيخ العظم السنخي M1 بالكامل في الفئران. (ج) تلطيخ OPN المناعي في العظم السنخي بأكمله ل M1 في الفئران. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر (B) ، 100 ميكرومتر (C). هذا الرقم مأخوذ من Gong et al.26. الاختصارات: ROIs = مناطق الاهتمام ؛ MB = جذر منتصف الشدق ؛ DB = جذر الشدق ؛ P = الجذر الحنكي. HE = الهيماتوكسيلين يوزين ؛ OPN = أوستيوبونتين. PDL = الرباط اللثوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: نقص بانيات العظم في Stat3 ضعف تكوين العظام الناجم عن قوة تقويم الأسنان والارتشاف . (أ) وضع العلامات الفلوروكرومية المتسلسلة بواسطة الكالسيين والأحمر الأليزارين S في الفئران WT و Stat3Col1α2ERT2 أثناء OTM والقياس الكمي لمعدلات الترسب المعدنية. ن = 5. (ب) تلطيخ التألق المناعي والقياس الكمي لخلايا OPN + في العظم السنخي على d10 بعد OTM في الفئران WT و Stat3Col1α2ERT2. ن = 5. (ج) تلطيخ TRAP وتحديد كمية الخلايا الإيجابية ل TRAP في العظم السنخي على d4 بعد OTM في الفئران WT و Stat3Col1α2ERT2. ن = 5. (د) تلطيخ التألق المناعي والقياس الكمي لخلايا CTSK + في العظم السنخي على d4 بعد OTM في الفئران WT و Stat3Col1α2ERT2. ن = 5. قضبان المقياس = 10 ميكرومتر (A) ، 50 ميكرومتر (B-D). هذا الرقم مأخوذ من Gong et al.26. الاختصارات: STAT3 = محول إشارة ومنشط النسخ 3 ؛ Col1α = الكولاجين 1-ألفا ؛ WT = النوع البري ؛ OTM = حركة الأسنان التقويمية. OPN = أوستيوبونتين. DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول ؛ TRAP = الفوسفاتيز الحمضي المقاوم للطرطرات ؛ MAR = معدلات التخصيص المعدنية ؛ CTSK = كاثيبسين ك. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نظرا لأن سوء الإطباق هو من بين أكثر اضطرابات الفم شيوعا التي تضعف التنفس والمضغ والتحدث وحتى المظهر ، فإن الطلب على تقويم الأسنان يتزايد يوما بعد يوم مع ارتفاع معدل الإصابة من 70٪ إلى 93٪ وفقا لمسح وبائي سابق31,32. أصبحت كيفية تسريع إعادة تشكيل العظام السنخية لرفع كفاءة علاج تقويم الأسنان بأمان موضوعا ساخنا في هذا المجال. لذلك ، من الضروري توضيح آلية إعادة تشكيل العظام السنخية المدفوعة بواسطة OTM. في الدراسات السابقة ، استخدم الباحثون حقن الدواء في الجسم الحي لدراسة آلية OTM في النماذج الحيوانية21,33 ، والتي كانت بسيطة وسهلة ، ولكن كان من الصعب استبعاد تأثير الأدوية على خلايا الأنظمة الأخرى. لذلك ، من الضروري للغاية دراسة آلية إعادة تشكيل العظام تحت قوة تقويم الأسنان في الجسم الحي.

في السنوات الأخيرة ، تم استخدام الفئران بالضربة القاضية الجينية على نطاق واسع ، مما يوفر أساسا متينا لدراسة وظيفة الجينات واستكشاف الأهداف العلاجية34. من بين هذه التقنيات ، كانت تقنية الضربة القاضية للجينات الكاملة هي النهج الأول. تم استخدام نموذج الفأر بالضربة القاضية لمستقبلات الأدرينالية Adrb2 (Adrb2) لاستكشاف دور الجهاز العصبي الودي في إعادة تشكيل العظام السنخية خلال OTM35. ومع ذلك ، قد يؤدي إجمالي الفئران بالضربة القاضية الجينية إلى الفتك الجنيني في بعض الحالات ، مما يعيق دراسة وظيفة الجينات. لذلك ، تم تطوير الفئران بالضربة القاضية الشرطية ، والتي تستهدف جينا في أنواع معينة من الخلايا. ومع ذلك ، نظرا لأن الأبحاث المتعلقة بإعادة تشكيل العظام السنخية غالبا ما تكون حساسة للوقت ، فمن الضروري ملاحظة التغيرات في العظم السنخي في نقاط زمنية محددة بعد النمذجة.

تتمتع فئران الضربة القاضية الجينية الشرطية المستحثة بمزايا مزدوجة تتمثل في التحكم الزماني والمكاني في إعادة تركيب الحمض النووي وخصوصية الأنسجة ، ويمكن تحقيق خروج المغلوب الجيني في نقاط زمنية محددة وأنسجة محددة من خلال تطبيق الأدوية أو الهرمونات ، والتي يمكن أن تلبي احتياجات البحث بشكل أفضل. بالإضافة إلى ذلك ، STAT3 هو عامل نسخ يتم التعبير عنه على نطاق واسع في العظام والأنسجة الأخرى وله وظائف تنظيم تكاثر الخلايا ، والتمايز ، وموت الخلايا المبرمج ، والوظائف المناعية وغيرها من الوظائف المهمة25. لقد أبلغنا سابقا أن كثافة المعادن في العظام للفئران بالضربة القاضية Stat3 غير المستحثة الخاصة ببانيات العظم قد انخفضت28 ، مما يشير إلى أن فئران Stat3 بالضربة القاضية الشرطية غير المستحثة ليست مناسبة للدراسة الميكانيكية لإعادة تشكيل العظام السنخية التي تحتاج إلى استبعاد تأثير التطور.

لذلك ، في هذه الدراسة ، أنشأنا فئران Stat3 بالضربة القاضية للجينات الخاصة بعقار تاموكسيفين ، Stat3Col1α2ERT2 ، من خلال استخدام تقنية خروج المغلوب الجيني الشرطي المستحث على أساس نظام Cre / loxP ، والذي يمكن التحكم فيه في الزمان والمكان وأكثر ملاءمة لدراسة آلية إعادة تشكيل العظام السنخية ، بالإضافة إلى السماح بمزيد من الدراسة لوظيفة خلايا وجينات معينة جنبا إلى جنب مع تتبع النسب. قبل تحريض عقار تاموكسيفين ، لم يكن هناك فرق واضح بين Stat3Col1α2ERT2 والفئران من النوع البري ولا شيء خاص في التكاثر. لقد وجدنا سابقا أن الحذف المستحث ل Stat3 في بانيات العظم Col1α2 + يضعف تكوين العظام ويقلل من كتلة العظام في الفئران البالغة28. في هذه الدراسة ، انخفض مستوى التمثيل الغذائي للعظام للفئران Stat3Col1α2ERT2 في مجموعات غير OTM ، وهو ما كان متسقا مع النتائج السابقة. علاوة على ذلك ، مع انخفاض مستوى التمثيل الغذائي للعظام لمجموعة OTM بشكل ملحوظ استجابة لقوة تقويم الأسنان ، يمكن اعتبار أن Stat3 لعب دورا مهما في تنظيم استقلاب العظام تحت القوة الميكانيكية. استكشفنا كذلك آلية إعادة تشكيل العظام التي ينظمها Stat3. أشارت النتائج إلى أن Stat3 يمكن أن يعزز بشكل مباشر تمايز بانيات العظم 28,29 ويؤثر على تمايز ناقضة العظم من خلال تنظيم الحديث المتبادل بين بانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم من خلال تعديل نسخ Mmp3 29.

في هذا البروتوكول ، اخترنا المنطقة الواقعة داخل ثلاثة جذور من M1 في المقطع العرضي عند عظم الفك العلوي للفئران كعائد استثمار لتقييم إعادة تشكيل العظام السنخية. في هذه المنطقة ، يكون تحليل العظم السنخي أقرب إلى تحليل العظام الطويلة ، حيث يتم تحليل نشاط تكوين العظم وتكوين العظم في نفس المنطقة ، بدلا من الطريقة التقليدية لتحليل خصائص الجوانب المختلفة. علاوة على ذلك ، وفقا للفرضية الكلاسيكية ، يجب تطبيق دواءين لهما تأثيرات معاكسة على جانبي الضغط والتوتر ، على التوالي ، لتسريع معدل حركة الأسنان. قدمت هذه الطريقة أساسا نظريا للتغلب على هذه الاختناقات. في نموذج OTM هذا ، تم قياس حجم قوة تقويم الأسنان باستخدام مقياس دينامومتر. ومع ذلك، ستخف القوة قليلا مع تقليل المسافة بين الضرس الأول والقواطع. لذلك ، من الضروري إنشاء نظام ميكانيكي موحد لتوليد قوة تقويم أسنان أكثر ثباتا واستقرارا.

ضمن البروتوكول ، هناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب وضعها في الاعتبار. أولا ، في عملية بناء نموذج OTM ، يجب ربط الضرس الأول والقاطعة بإحكام لتجنب فشل تطبيق القوة عن طريق الإزاحة. ثانيا ، يجب الانتباه إلى اتجاه القوة ، ويجب تطبيق القوة الأفقية على الضرس الأول لتجنب قلع الأسنان الناجم عن تطبيق القوة الرأسية. أخيرا ، عند التضمين ، يجب تحديد اتجاه العينة وفقا للمقطع العرضي المستهدف ، ويجب ملاحظة الأقسام في الوقت المناسب لضبط الاتجاه للحصول على أقسام مثالية.

في الختام ، نحن نقدم بروتوكولات لنموذج فأر خروج المغلوب الجيني القابل للتحريض والمحدد ل OTM ، والذي يكشف عن إعادة تشكيل العظام السنخية في نقاط زمنية مختلفة. سنستخدم هذا أيضا لدراسة وظيفة خلايا وجينات معينة مقترنة بتتبع السلالة. ثم أنشأنا نمطا ديناميكيا وخاصا بالخلايا في الجسم الحي في مجال أبحاث آلية OTM ، ونقدم أدلة على تقويم الأسنان في العيادة. بالإضافة إلى ذلك ، توفر هذه الدراسة بروتوكولات مفصلة لبناء نموذج OTM ، والذي يتيح إعادة تشكيل العظام بسرعة عن طريق تحفيز بانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم ويوفر نموذجا مثاليا لدراسة إعادة تشكيل العظام استجابة للقوة الميكانيكية. أكثر من ذلك ، نصف طرق تحليل إعادة تشكيل العظام السنخية خلال OTM لتوفير استراتيجية جديدة لدراسة البيولوجيا الميكانيكية للهيكل العظمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81870740 ، 82071083 ، 82271006 ، 82101048 ، 81800949) ؛ مؤسسة العلوم الطبيعية في شنغهاي (21ZR1436900 ، 22ZR1436700) ؛ برنامج شنغهاي الأكاديمي / قائد أبحاث التكنولوجيا (20XD1422300) ؛ خطة البحوث السريرية ل SHDC (SHDC2020CR4084) ؛ صندوق البحوث متعدد التخصصات لمستشفى الشعب التاسع في شنغهاي ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (JYJC201902 ، JYJC202116) ؛ فريق أبحاث الابتكار للجامعات المحلية رفيعة المستوى في شنغهاي (SSMUZLCX20180501) ؛ صندوق الانضباط البحثي رقم. KQYJXK2020 من مستشفى الشعب التاسع ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ ، وكلية طب الأسنان ، جامعة شنغهاي جياو تونغ. مشروع الاستكشاف الأصلي لمستشفى شنغهاي الشعبي التاسع ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (JYYC003) ؛ مشروع موهبة مائتي من كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ ؛ مشروع البحث التعاوني لمعهد المواد الحيوية والطب التجديدي كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (2022LHB02) ؛ مشروع البنك الحيوي لمستشفى الشعب التاسع في شنغهاي ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (YBKB201909 ، YBKB202216).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  P1020
4% paraformaldehyde Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1101
Alizarin red Sigma-Aldrich A5533
Anti-CTSK antibody Santa Cruz sc-48353
Anti-OPN antibody R&D Systems, Minneapolis, MN, USA AF808
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Closed-coil springs Innovative Material and Devices, Shanghai, China CS1006B
Col1α2CreERT2 mice A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences.
Dexmedetomidine hydrochloride Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTA Beyotime Biotechanology ST069
Embedding tanks Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd 80106-1100-16
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 100092183
ImageJ software NIH, Bethesda, MD, USA
Mounting medium with DAPI Beyotime Biotechanology P0131
Mouse dissection platform Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. HK105
Paraffin Sangon biotech Co., Ltd. A601889
Primers for genotyping Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease K Sigma-Aldrich 539480
Self-curing restorative resin 3M ESPE, St. Paul, MN, USA 712-035
Stat3fl/fl mice GemPharmatech Co., Ltd D000527
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648
TRAP staining kit Sigma-Aldrich 387A
Tris-HCl Beyotime Biotechanology ST780
Universal tissue fixative Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1105
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10023418
Zoletil VIRBAC 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frost, H. M. The Utah paradigm of skeletal physiology: an overview of its insights for bone, cartilage and collagenous tissue organs. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 18 (6), 305-316 (2000).
  2. Frost, H. M. Wolff's Law and bone's structural adaptations to mechanical usage: an overview for clinicians. The Angle Orthodontist. 64 (3), 175-188 (1994).
  3. Gothlin, G., Ericsson, J. L. The osteoclast: review of ultrastructure, origin, and structure-function relationship. Clinical Orthopaedics and Related Research. (120), 201-231 (1976).
  4. Feng, X., Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: New Insights. Bone Research. 1 (1), 11-26 (2013).
  5. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  6. Zhu, L. X., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), eaaw6143 (2020).
  7. Dai, Q., et al. A RANKL-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mTORC1 in osteoclast formation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), 56468 (2018).
  8. Karsenty, G., Kronenberg, H. M., Settembre, C. Genetic control of bone formation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 629-648 (2009).
  9. Long, F. Building strong bones: molecular regulation of the osteoblast lineage. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (1), 27-38 (2011).
  10. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).
  11. Lang, T., et al. Cortical and trabecular bone mineral loss from the spine and hip in long-duration spaceflight. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (6), 1006-1012 (2004).
  12. Sibonga, J. D. Spaceflight-induced bone loss: is there an osteoporosis risk. Current Osteoporosis Reports. 11 (2), 92-98 (2013).
  13. Yang, Y., et al. Administration of allogeneic mesenchymal stem cells in lengthening phase accelerates early bone consolidation in rat distraction osteogenesis model. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 129 (2020).
  14. Huang, C., Holfeld, J., Schaden, W., Orgill, D., Ogawa, R. Mechanotherapy: revisiting physical therapy and recruiting mechanobiology for a new era in medicine. Trends in Molecular Medicine. 19 (9), 555-564 (2013).
  15. Shu, H. S., et al. Tracing the skeletal progenitor transition during postnatal bone formation. Cell Stem Cell. 28 (12), 2122-2136 (2021).
  16. Wang, X., et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation. Nature Medicine. 19 (1), 93-100 (2013).
  17. Huja, S. S., Fernandez, S. A., Hill, K. J., Li, Y. Remodeling dynamics in the alveolar process in skeletally mature dogs. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (12), 1243-1249 (2006).
  18. Jin, A., et al. FOXO3 mediates tooth movement by regulating force-induced osteogenesis. Journal of Dental Research. 101 (2), 196-205 (2022).
  19. Bumann, A., Carvalho, R. S., Schwarzer, C. L., Yen, E. H. Collagen synthesis from human PDL cells following orthodontic tooth movement. European Journal of Orthodontics. 19 (1), 29-37 (1997).
  20. Kitaura, H., et al. Effect of cytokines on osteoclast formation and bone resorption during mechanical force loading of the periodontal membrane. The Scientific World Journal. 2014, 617032 (2014).
  21. Lu, W., et al. Sclerostin injection enhances orthodontic tooth movement in rats. Archives of Oral Biology. 99, 43-50 (2019).
  22. Seki, Y., et al. Differentiation ability of Gli1(+) cells during orthodontic tooth movement. Bone. 166, 116609 (2023).
  23. Gong, X. Y., et al. Local orthodontic force initiates widespread remodelling of the maxillary alveolar bone. Australasian Orthodontic Journal. 36 (2), 175-183 (2020).
  24. Liu, Y., et al. STAT3 and its targeting inhibitors in osteosarcoma. Cell Proliferation. 54 (2), e12974 (2021).
  25. Guadagnin, E., Mazala, D., Chen, Y. W. STAT3 in skeletal muscle function and disorders. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2265 (2018).
  26. Saikia, B., et al. Clinical profile of hyper-IgE syndrome in India. Frontiers in Immunology. 12, 626593 (2021).
  27. van de Veen, W., et al. Impaired memory B-cell development and antibody maturation with a skewing toward IgE in patients with STAT3 hyper-IgE syndrome. Allergy. 74 (12), 2394-2405 (2019).
  28. Zhou, S. R., et al. STAT3 is critical for skeletal development and bone homeostasis by regulating osteogenesis. Nature Communications. 12 (1), 6891 (2021).
  29. Gong, X. Y., et al. Osteoblastic STAT3 is crucial for orthodontic force driving alveolar bone remodeling and tooth movement. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (1), 214-227 (2023).
  30. Yang, Y., et al. Skeletal phenotype analysis of a conditional Stat3 deletion mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), 61390 (2020).
  31. Egic, B. Prevalence of orthodontic malocclusion in schoolchildren in Slovenia. A prospective aepidemiological study. European Journal of Paediatric Dentistry. 23 (1), 39-43 (2022).
  32. Gois, E. G., et al. Incidence of malocclusion between primary and mixed dentitions among Brazilian children A 5-year longitudinal study. The Angle Orthodontist. 82 (3), 495-500 (2012).
  33. Yang, F., et al. Effects Of triptolide on tooth movement and root resorption in rats. Drug Design, Development and Therapy. 13, 3963-3975 (2019).
  34. Wang, C., Sun, H. Progress in gene knockout mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 35 (5), 784-794 (2019).
  35. Cao, H., et al. Force-induced Adrb2 in periodontal ligament cells promotes tooth movement. Journal of Dental Research. 93 (11), 1163-1169 (2014).

Tags

الطب ، العدد 197 ، حركة الأسنان التقويمية ، استقلاب العظام ، القوة الميكانيكية ، النموذج الحيواني ، دور STAT3 في بانيات العظم ، نموذج الماوس المحرض على عقار تاموكسيفين ، قوة تقويم الأسنان ، النمط الظاهري للعظام السنخية ، التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، الفحص المجهري الاستريو ، التحليل النسيجي ، بانيات العظم ، ناقضات العظم
استخدام الفئران بالضربة القاضية <em>Stat3</em> الخاصة بالنسب العظمية لدراسة إعادة تشكيل العظام السنخية أثناء حركة الأسنان التقويمية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong,… More

Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong, X., Yang, Y., Zhu, Y., Xu, H., Jin, A., Huang, X., Gao, X., Lu, T., Liu, J., Wang, X., Dai, Q., Jiang, L. Using Inducible Osteoblastic Lineage-Specific Stat3 Knockout Mice to Study Alveolar Bone Remodeling During Orthodontic Tooth Movement. J. Vis. Exp. (197), e65613, doi:10.3791/65613 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter