Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Bruk av induserbare osteoblastiske avstamningsspesifikke Stat3 Knockout-mus for å studere alveolær beinremodellering under kjeveortopedisk tannbevegelse

Published: July 21, 2023 doi: 10.3791/65613
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, *6, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 2,3,4,5,7, 1,2,3,4,5
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University, 3National Center for Stomatology, 4National Clinical Research Center for Oral Diseases, 5Shanghai Key Laboratory of Stomatology, 6Shanghai Starriver Bilingual School, 7The 2nd Dental Center, Ninth People’s Hospital, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Denne studien gir en protokoll for bruk av induserbare osteoblast avstamningsspesifikke Stat3 knockoutmus for å studere beinremodellering under kjeveortopedisk kraft og beskriver metoder for å analysere alveolær beinremodellering under kjeveortopedisk tannbevegelse, og dermed kaste lys over skjelettmekanisk biologi.

Abstract

Det alveolære beinet, med høy omsetningshastighet, er det mest aktivt remodellerende beinet i kroppen. Ortodontisk tannbevegelse (OTM) er en vanlig kunstig prosess med alveolær beinremodellering som respons på mekanisk kraft, men den underliggende mekanismen forblir unnvikende. Tidligere studier har ikke vært i stand til å avsløre den nøyaktige mekanismen for beinremodellering i tid og rom på grunn av dyremodellrelaterte restriksjoner. Signaltransduseren og aktivatoren av transkripsjon 3 (STAT3) er viktig i benmetabolisme, men dens rolle i osteoblaster under OTM er uklar. For å gi in vivo bevis på at STAT3 deltar i OTM på bestemte tidspunkter og spesielt celler under OTM, genererte vi en tamoxifen-induserbar osteoblast avstamningsspesifikk Stat3 knockout musemodell, anvendt kjeveortopedisk kraft og analyserte alveolar beinfenotypen.

Mikrocomputertomografi (Micro-CT) og stereomikroskopi ble brukt for å få tilgang til OTM-avstand. Histologisk analyse valgte området som ligger innenfor tre røtter av den første molaren (M1) i tverrsnittet av det maksillære beinet som interesseområdet (ROI) for å evaluere den metabolske aktiviteten til osteoblaster og osteoklaster, noe som indikerer effekten av kjeveortopedisk kraft på alveolær bein. Kort sagt, vi gir en protokoll for bruk av inducible osteoblast lineage-spesifikke Stat3 knockout mus for å studere bein remodeling under ortodontisk kraft og beskrive metoder for å analysere alveolar bein remodeling under OTM, og dermed kaste nytt lys på skjelett mekanisk biologi.

Introduction

Det er allment kjent at bein er under konstant rekonstruksjon gjennom livet, som svar på mekaniske krefter i henhold til Wolffs lov 1,2. Passende mekanisk stimulering, som tyngdekraft og daglig mosjon, opprettholder benmasse og styrke og forhindrer bentap ved å stimulere både osteoblaster og osteoklaster. Osteoklaster, ansvarlig for benresorpsjon 3,4,5,6,7, og osteoblaster, ansvarlig for beindannelse 8,9,10, opprettholder benhomeostase og fungerer sammen i den biologiske prosessen med beinremodellering. I kontrast, i fravær av laststimuli, som hos astronauter under langvarig mikrogravitasjon, lider bein 10% tap av beinmineraltetthet, og øker dermed risikoen for osteoporose11,12. Videre har ikke-invasive og praktiske mekaniske terapier, inkludert kjeveortopedi og distraksjonsosteogenese, dukket opp som behandlinger for beinsykdommer13,14. Alle disse har vist at mekanisk kraft spiller en kritisk rolle for å opprettholde beinkvalitet og kvantitet. Nylige studier analyserte generelt beinremodellering som svar på mekanisk belastning ved hjelp av tidkrevende modeller som løpehjul og haleopphengstester, som vanligvis tok 4 uker eller mer for å simulere kraftbelastning eller lossing15,16. Derfor er det etterspørsel etter en praktisk og effektiv dyremodell for å studere beinremodellering drevet av kraftbelastning.

Det alveolære beinet er det mest aktive når det gjelder beinremodellering, med høy omsetningshastighet17. Ortodontisk tannbevegelse (OTM), en vanlig behandling for maloklusjon, er en kunstig prosess med alveolær beinremodellering som respons på mekanisk kraft. Imidlertid er OTM, som induserer rask beinremodellering18, også en tidsbesparende måte å studere effekten av mekanisk kraft på beinremodellering sammenlignet med andre modeller med en lang eksperimentell periode. Derfor er OTM en ideell modell for å studere beinremodellering under mekaniske stimuli. Det er bemerkelsesverdig at mekanismen for alveolær beinremodellering ofte er tidsfølsom, og det er nødvendig å observere endringene i alveolær beinremodellering på bestemte tidspunkter etter modellering. Med de to fordelene med tidsmessig og romlig kontroll av DNA-rekombinasjon og vevsspesifisitet, er en induserbar betinget gen-knockout-musemodell et passende valg for OTM-studier.

Konvensjonelt har OTM-mediert alveolær beinremodellering blitt delt inn i spenningssoner som involverer beindannelse og trykksoner som involverer benresorpsjon 19,20,21, som er mer detaljert, men vanskelig å regulere. Videre rapporterte Yuri et al. at tiden for beindannelse i OTM var forskjellig på spennings- og kompresjonssidene22. I tillegg hadde en tidligere studie vist at den første jekselen kunne initiere bred remodellering av det maksillære alveolære beinet under kjeveortopedisk kraft, som ikke var begrenset til spennings- og trykksonene23. Derfor valgte vi området som ligger innenfor tre røtter av M1 i tverrsnittet av det maksillære beinet som interesseområde (ROI) og beskrev metoder for å vurdere aktiviteten til osteoblaster og osteoklaster i samme område for å evaluere alveolær beinremodellering under OTM.

Som en kjernefysisk transkripsjonsfaktor har signaltransduser og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) vist seg å være kritisk i beinhomeostase24,25. Tidligere studier har rapportert lav beinmineraltetthet og tilbakevendende patologiske brudd i Stat3-muterte mus26,27. Vår tidligere studie viste at delesjon av Stat3 i Osx + osteoblaster forårsaket kraniofacial misdannelse og osteoporose, samt spontane beinbrudd28. Nylig ga vi in vivo-bevis med en induserbar osteoblastspesifikk Stat3-delesjonsmusemodell (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, heretter kalt Stat3Col1α2ERT2) at STAT3 er avgjørende for å formidle effekten av kjeveortopedisk kraft som driver remodellering av alveolær bein29. I denne studien gir vi metoder og protokoller for bruk av induserbare osteoblastavstamningsspesifikke Stat3 knockoutmus for å studere beinremodellering under kjeveortopedisk kraft og beskrive metoder for å analysere alveolær beinremodellering under OTM, og dermed kaste lys over skjelettmekanisk biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder som involverer dyr som er beskrevet her, ble godkjent av etikkomiteen ved Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (nr. 82101048).

1. Etablering av induserbare osteoblast avstamningsspesifikke Stat3 knockout mus

MERK: Stat3 fl/ fl mus ble oppnådd kommersielt; Col1α2CreERT2-stammenvar en gave (se materialfortegnelsen for alle detaljer). Standardisert laboratoriepelletsfôr og vann og standard laboratoriemiljøforhold (romtemperatur ved 22 °C til 26 °C og fuktighet ved 50 % -55 %) ble gitt for alle dyrene.

  1. Sett en kjønnsmoden hannmus med to hunnmus i samme bur. Etter 18 dager, sjekk for nyfødte hver dag. Fjern eventuelle gravide hunnmus til et tomt bur og hold dem alene om nødvendig. Sett hannmus i andre forskjellige avlsbur hvis hunnmusene ikke er drektige innen 30 dager.
  2. generere Stat3fl/+; Col1α2 CreERT2 mus ved hybridisering av Stat3 fl/ fl mus med Col1α2CreERT2 mus; oppretthold alle disse musene på C57BL/6-bakgrunnen. Samle 2-5 mm halespisser for genotyping og hold hannens Stat3fl/+; Col1α2CreERT2 mus til de er kjønnsmodne (F1).
  3. Hybridiser 6 uker gammel mannlig Stat3fl/ +; Col1α2CreERT2 mus med kvinnelige Stat3 fl/fl mus. Samle 2-5 mm halespisser når mus er 2 uker gamle for genotyping, og hold hannen Stat3 fl/ fl; Col1α2 CreERT2(Stat3Col1α2ERT2) mus til de er kjønnsmodne (F2).
  4. Hybridiser 6 uker gammel mannlig Stat3 fl/ fl; Col1α2CreERT2 mus med hunnmus Stat3 fl/fl mus (F3). Samle 2-5 mm halespisser når mus er 2 uker gamle for genotyping, og bruk de yngre musene av samme genotype for å erstatte eldre avlsmus når det er hensiktsmessig (F3 + N).
    MERK: Musens reproduksjonskapasitet reduseres etter 8 måneders alder, så musene i avlsburene må overvåkes nøye og erstattes etter behov. I tillegg, i henhold til de eksperimentelle kravene, bør antall avlsbur økes hensiktsmessig for å unngå utryddelse av målgenmusene.

2. Inducerbar delesjon av Stat3 i Col1a2-uttrykkende osteoblaster av tamoxifen

  1. Løs tamoxifen i maisolje til 20 mg / ml i et sentrifugerør, og beskytt mot lys ved å pakke inn i folie. Sett det foliebelagte sentrifugerøret på en roterende mikser og bland ved romtemperatur til det er helt oppløst.
    MERK: Tamoxifen ble oppnådd kommersielt og lagret i mørket ved 4 ° C.
  2. Velg ti 6 uker gamle hannmus og del dem inn i Stat3 fl/fl og Stat3Col1α2ERT2-grupper med fem mus i hver gruppe. Administrer tamoksifen (100 mg·kg-1·bw) hver 2. dag i 1 uke ved intraperitoneal injeksjon.

3. Ortodontisk tannbevegelse (OTM) modell

  1. Forbered en sterilisert plastmusdisseksjonsplattform som et operasjonsbord for å immobilisere musene.
    MERK: Musedisseksjonsbordet ble oppnådd kommersielt og besto av fire justerbare gummistolper og en metallstang for immobilisering av musene. Bruk sterile instrumenter og verktøy gjennom hele prosedyren.
  2. Fest et elastisk bånd til hver gummistolpe for fiksering av lemmer.
  3. Bind ett elastisk bånd mellom de to øvre gummistolpene; bind en tråd til det elastiske båndet for å holde de nedre snittene; og bind en annen tråd til metallstangen for å holde de øvre fortennene.
  4. Bedøv 7 uker gamle hannmus med 0,1 ml oppløsning av deksmedetomidinhydroklorid (0,1 mg·kg-1·bw) og zoletil (tiletaminhydroklorid for 20 mg·kg-1·bw og zolazepamhydroklorid for 20 mg·kg-1·bw) oppløst i saltvann ved intraperitoneal injeksjon før kirurgi. Pass på at musene er under riktig anestesi gjennom hele operasjonen.
    MERK: Vær oppmerksom på den effektive bruksdatoen for narkotika, og ikke bruk utgåtte stoffer.
  5. Bekreft at musene er under riktig anestesi ved å klemme tærne på bakre lemmer med fingrene.
    MERK: Hvis musene ikke reagerer på testen, betyr det at de er bevisstløse og anestesien har nådd ønsket dybde. På den tiden er musene i en tilstand av lemmer muskelavslapping, med jevn pust og hjertefrekvens, og operasjonen kan startes.
  6. Bruk veterinærsalve på øynene til musene for å forhindre tørrhet og plasser den bedøvede musen i liggende stilling på operasjonstabellen. Bruk fire elastiske bånd på gummistolpene for å feste lemmer, en tråd festet til metallstangen for å holde de øvre fortennene og en annen festet til et elastisk bånd mellom de to øvre gummistolpene for å hekte over de nedre fortennene for å holde underkjeven åpen.
  7. Forbered lukkede spiralfjærer (0,25 mm trådstørrelse, 0,76 mm diameter, 1 mm lengde) for kjeveortopedisk kraftapparat.
    MERK: Klipp åtte tråder med fjær for hver mus. Fire gjenger på 1 mm i midten for kraftapparat og to gjenger i hver ende for ligaturering ved bruk av stålligaturtråd.
  8. Ligate den ene enden av fjæren forberedt på den maksillære venstre første molar. Liger den andre enden til det sentrale snittet med en 0,1 mm stålligaturtråd forsterket med lysherdende restaurerende harpiks etter påføring av lim på fortennene med Q-spissen for å generere en stabil kraft på en størrelse på 10 g målt ved hjelp av et dynamometer.
  9. Etter å ha fullført operasjonen, legg musene i et bur med andre av samme stamme i utvinning, eller sett hver mus i et tomt bur alene. Pass på at musene ikke blir etterlatt uten tilsyn før de har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet 2-4 timer etter operasjonen for å opprettholde sternal recumbency. For de neste dagene, gi musene et mykt kosthold og observer dem regelmessig for å sikre at det ikke oppstår komplikasjoner og for å fastslå graden av postkirurgisk smerte; Administrer smertestillende medisiner etter behov.
    MERK: Mus som har gjennomgått kirurgi, bør ikke returneres til selskap med andre mus før de er fullstendig gjenopprettet. Ikke sett postkirurgiske mus i utvinning med mus som ikke er bedøvet. Mus må holdes varme under gjenoppretting.
  10. Kontroller kjeveortopedisk apparat hver dag og ekskluder eksperimentelle mus med dislodgement.

4. Innsamling av prøver

  1. Avlive musene på tre forskjellige tidspunkter via cervikal dislokasjon: 4 dager (d4), 7 dager (d7) og 10 dager (d10) etter starten av OTM.
  2. Bruk oftalmisk saks til å kutte av huden vertikalt fra livmorhalsområdet og deretter skille hodet fra kroppen med hele huden på hodet dissekert.
  3. Klipp av huden og buccinator muskler fra bilateral angulus oris til bakre del av mandibelen. Koble helt fra bukkalmusklene og senene festet til coracoids for å fjerne mandibelen og trimme ekstra bein for å oppnå komplette maxillae. Fjern deretter beinet bak de bilaterale tredje jekslene og rive av palatalslimhinnen. Til slutt, koble fra kjeveortopedisk apparat og kutt av beinet mellom fortennene langs median palatinsutur for å oppnå alveolar bein på høyre og venstre side.
    MERK: Sørg for at regionen fra fortennene til den tredje jekselen holdes intakt på begge sider.

5. Forberedelse for parafinseksjon

  1. Fiksering: Senk det høstede alveolarbeinet i 4 % paraformaldehyd i 48 timer og trim med oftalmisk saks i avtrekkshetten for avsnitt 6 og 7.
  2. Avkalkning: Vask prøvene forsiktig med 1x PBS i 3 x 10 min. Avkalk prøvene i universelt vevfikseringsmiddel (pH 8,0), erstattet med frisk løsning hver 2. dag, i 5 uker til beinene lett kan penetreres av en nålespiss.
  3. Dehydrering: Vask prøver i 1x PBS i 3 x 10 minutter, og senk dem deretter sekvensielt i 95% etanol, 100% etanol og xylen, i 2 x 1 time hver løsning.
  4. Dypp prøvene i en 1:1 blanding av xylen og parafin i 30 minutter og deretter i parafin ved 65 °C over natten.
  5. Innebygging: Velg egnede innebyggingstanker. Plasser alveolarbenet jevnt med tennene opp på samme nivå. Fjern prøvene fra innebyggingstanken og overfør dem til en fryser på -20 °C, og nummerer dem deretter når parafinen er helt avkjølt og fast.
  6. Bruk en mikrotom, kutt tjue til førti 4 μm tykke seksjoner kontinuerlig i tverrplanet og flyt på 37 ° C vann. Fest seksjonene til lysbildene i mikroskop og stek ved 42 °C over natten.

6. OTM avstandsmåling

  1. Fotografer prøver fra tre tidspunkter vertikalt fra okklusjonsplanet ved stereomikroskopi.
  2. Skann alveolarbenet med en Micro-CT-skanner. Rekonstruer 3D-bilder av det maksimale sagittalplanet til det maksillære alveolarbenet, hvor tre jeksler er helt synlige, ved hjelp av skannerens støtteprogramvare i henhold til produsentens instruksjoner.
  3. Mål OTM-avstanden ved hjelp av ImageJ-programvare:
    1. Åpne ImageJ-programvaren og bruk verktøyet for rett linje til å opprette et linjesegment med kjent avstand.
    2. Klikk Analyser , og velg Angi skala for å angi verdien for den tegnede linjeavstanden i Kjent avstand og angi enheter i Lengdeenhet.
    3. Tegn en linje mellom midtpunktene på den mesiale marginalryggen til M2 og den distale marginalryggen til M1, og klikk Mål. Resultatene som vises i kolonnen Lengde representerer OTM-avstanden.

7. Histologisk analyse

  1. Valg av interesseregion (ROI): Definer det alveolære beinet til den første molar (M1) som avkastningen, plassert nøyaktig innenfor tre røtter av M1 i tverrsnittet ved det maksillære beinet. Denne regionen når ikke bare det kortikale beinet til den første molaren i bukkal-lingual retning, men strekker seg også til midten av den lange aksen til mesiobuccalroten, inkludert halvområdet mellom distobukkalroten og palatalroten.
  2. Analyse av osteogenese
    1. Calcein og alizarin rød dobbel merking og analyse
      1. Kalkein og alizarinrødt preparat: Løs opp kalcein i 2 % NaHCO3 oppløsning til 1 mg/ml og alizarinrød S iH2Otil 2 mg/ml.
        MERK: I denne studien ble calcein og alizarinrød oppnådd kommersielt.
      2. Administrer calcein (20 mg·kg-1·bw) på dag 1 og alizarinrød S (40 mg·kg-1·bw) på dag 8 ved intraperitoneal injeksjon etter oppstart av OTM. Avlive musene på dag 10 og høst alveolarbeinet.
      3. Forbered prøver og legg dem inn ved å følge trinn 5.1 og 5.3-5.5. For ytterligere detaljer, se Yang et al.30.
      4. Bruk en roterende mikrotom, kutt 5 μm tykke seksjoner kontinuerlig i tverrplanet. Fest seksjonene til mikroskopglass og monter med deksler med nøytral balsam.
        MERK: Resten av prøvene må oppbevares med tørkemiddel ved romtemperatur.
      5. Undersøke og fotografere snittene under et fluorescensmikroskop og beregne mineralapposisjonsrate (MAR) og beindannelseshastighet (BFR/BS) i henhold til metoden tidligere beskrevet30.
    2. Immunfluorescens
      1. Velg egnede parafinseksjoner og stek ved 65 °C i 30 minutter.
      2. Avvoksing: Fordyp seksjonene i xylen i 5 minutter og gjenta to ganger med fersk xylen hver gang.
      3. Rehydrering: Fordyp seksjonene sekvensielt i 95% etanol, 75% etanol, 50% etanol og ddH2O, hver i 5 minutter.
      4. Vask seksjonene forsiktig med 1 x PBS i 2 x 5 min.
      5. Antigenuthenting: Senk seksjonene i en blanding av Tris-HCl (0,05 M, pH 8,0), EDTA (0,01 M, pH 8,0) og protease K (10 μg/ml) i ddH2O og inkuber ved 37 °C i 15 minutter.
      6. Vask seksjonene forsiktig med 1 x PBS i 3 x 5 min.
      7. Blokk: Fjern ekstra væske fra seksjonene og tegn en sirkel rundt målområdet ved hjelp av en hydrofob markør. For å blokkere uspesifikk binding, dekk til med en blokkeringsbuffer inneholdende 10 % bovint serumalbumin og inkuber ved romtemperatur i 1 time.
        MERK: Vær forsiktig så du ikke tørker seksjonene for lenge, for ikke å påvirke resultatene.
      8. Primær antistoffinkubasjon: Fortynn anti-osteopontin (OPN) antistoffet med antistofffortynningsmiddel til anbefalt konsentrasjon, og tilsett 30-50 μL til hver prøve; ruges ved 4 °C over natten i et fuktet kammer.
        MERK: Sørg for å la litt vann være i kammeret og dekke det for å forhindre at antistoffvæsken fordamper.
      9. Vask seksjonene forsiktig med 1 x PBS i 3 x 10 min.
        MERK: Trinn 7.2.2.10-7.2.2.12 skal utføres i mørket.
      10. Fluorescerende sekundært antistoffinkubasjon: Velg et passende fluorescerende sekundært antistoff som tilsvarer det primære antistoffet og fortynn det til anbefalt konsentrasjon. Tilsett 30-50 μL til hver prøve og inkuber ved romtemperatur i 1 time.
      11. Vask seksjonene forsiktig med 1 x PBS i 2 x 10 min.
      12. Bruk et antifademonteringsmedium med 4'6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) for å montere prøvene. Oppbevar seksjonene i mørket og fotografer dem så snart som mulig.
      13. Utfør fluorescensmikroskopi med et digitalkamera for å undersøke og fotografere seksjonene og telle positive celler i interesseområdene (ROI).
  3. Analyse av osteoklastogenese
    1. Tartratresistent syrefosfatase (TRAP) farging
      1. Velg egnede parafinseksjoner. Avvoks og rehydrer etter trinn 7.2.2.1-7.2.2.3.
      2. Forbered fersk fargeløsning ved hjelp av TRAP-fargesettet i henhold til produsentens instruksjoner og forvarm til 37 °C.
      3. Tilsett 30-50 μL fargeoppløsning i hver prøve og inkuber ved 37 °C i et fuktet kammer i 20-30 minutter. Sjekk hvert 5. minutt til røde multinukleerte osteoklaster ses under et lysmikroskop. Stopp reaksjonen med ddH2O.
      4. Motflekk i hematoksylinoppløsning i 30 s og senk ned i 1% ammoniakkløsning i 1 min for stabil blå farge. Skyll under saktegående vann fra springen.
      5. Monter seksjonene med deksler med nøytral balsam og tørk over natten.
      6. Ta bilder under et mikroskop og tell antall TRAP-positive celler med mer enn tre kjerner, etter vår forrige protokoll30.
    2. Immunfluorescens: Bruk cathepsin K (CTSK) antistoff i anbefalt konsentrasjon for immunfluorescens og følg protokollen beskrevet i avsnitt 7 ovenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av denne protokollen etablerte vi en induserbar osteoblast avstamningsspesifikk Stat3 knockout mus (Stat3Col1α2ERT2) modell for å undersøke effekten av STAT3-delesjon på ortodontisk kraftdrevet alveolær beinremodellering (figur 1A, B). STAT3-delesjon i osteoblaster ble bekreftet ved immunfluorescensfarging av alveolær ben (figur 1C).

Stereomikroskopi indikerte at OTM-avstanden til WT-mus økte på d4, d7 og d10. I Stat3Col1α2ERT2-mus ble imidlertid OTM-avstanden redusert (figur 2B). Dette fenomenet ble også bekreftet ved mikro-CT-analyse på d10, noe som indikerer at osteoblastisk Stat3-delesjon reduserte OTM (figur 2C).

For histologisk analyse ble arealet som ligger innenfor tre røtter av M1 i tverrsnittet ved maxillarbeinet definert som ROI, som viser den generelle situasjonen for alveolær beinremodellering (figur 3A). Hematoksylin-eosinfarging og OPN-immunfluorescerende farging viste hele alveolarbeinet av ROI (figur 3B,C).

For osteogen analyse indikerte merking av alizarinrødt og kalcein at kjeveortopedisk kraft økte mineralapposisjonshastigheten (MAR) av alveolær bein i WT-mus, men MAR i OTM-gruppen av Stat3Col1α2ERT2-mus ble redusert sammenlignet med WT-musene (figur 4A). Videre viste immunfluorescensfarging at antall OPN + osteoblaster økte under kjeveortopedisk kraft, men det var færre OPN + osteoblaster i OTM-gruppen av Stat3Col1α2ERT2-mus enn i WT-musene (figur 4B). For osteoklastogen analyse indikerte TRAP-farging at under kjeveortopedisk kraft økte antall osteoklaster hos WT-mus, men det var færre osteoklaster i OTM-gruppen av Stat3Col1α2ERT2-mus enn i WT-musene (figur 4C). Dette fenomenet ble også bekreftet ved immunfluorescensfarging av CTSK (figur 4D). Disse resultatene viste at osteoblastisk Stat3-mangel reduserte aktiviteten til både osteoblaster og osteoklaster som respons på kjeveortopedisk kraft og nedsatt beinremodellering under tannbevegelse.

Figure 1
Figur 1: Illustrasjon av induserbar osteoblast avstamningsspesifikk Stat3 knockout mus modell generasjon. (A) Skjematisk diagram over Stat3 knockout i Col1a2-uttrykkende osteoblaster indusert av tamoxifen (venstre). Skjemaet for forsøket: 6 uker gamle mannlige villtype og Stat3Col1ERT2-mus ble administrert TA (100 mg · kg-1 · bw) hver 2. dag fra en uke før OTM-modellkonstruksjon og ofret for analyse på d4, d7 og d10 etter OTM (høyre). (B) Hybridiseringsfremgang av induserbare osteoblastavstamningsspesifikke Stat3 knockoutmus. (C) Dobbel immunfluorescensfarging av STAT3 og OPN i alveolarbenet av WT- og Stat3Col1ERT2-mus på d10 etter OTM og kvantifisering av dobbeltpositive celler på ikke-OTM-sider og OTM-sider. n = 5; skala barer = 50 μm. Dette tallet er fra Gong et al. 26. Forkortelser: STAT3 = signaltransduser og aktivator av transkripsjon 3; Col1α = kollagen 1-alfa; TA = tamoxifen; WT = vill type; OTM = kjeveortopedisk tannbevegelse; OPN = osteopontin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Osteoblastisk mangel på Stat3 forsinket kjeveortopedisk tannbevegelse (A) Det skjematiske diagrammet til OTM-modellen in vivo. Fjæren ligerte mellom fortennene og den første jekselen (M1) og induserte kjeveortopedisk kraft til å bevege M1 mot mesialryggen. (B) OTM-avstanden til d0, d4, d7 og d10 etter OTM i WT-mus og Stat3Col1α2ERT2-mus . (C) Representative bilder av ikke-OTM-sider og OTM-sider i WT og Stat3Col1α2ERT2-mus på d10 etter OTM ved mikro-CT. n = 5. Skalastenger = 1 mm (B), 500 μm (C). Dette tallet er fra Gong et al.26. Forkortelser: STAT3 = signaltransduser og aktivator av transkripsjon 3; Col1α = kollagen 1-alfa; WT = vill type; OTM = kjeveortopedisk tannbevegelse; SAG = sagittalplanet. Stiplede kurver indikerer OTM-avstanden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Illustrasjon av interesseområder . (A) Skjematisk diagram over regionene med avkastning. Det stiplede området som ligger innenfor tre røtter av M1 i tverrsnittet av maxillae ble valgt som ROI. De tre røttene til M1 inkluderer mesiobuccal rot, distobuccal rot og palatal rot. (B) HE farging av hele alveolar bein av M1 i mus. (C) Immunfluorescerende farging av OPN i hele alveolarbenet av M1 hos mus. Skalastenger = 200 μm (B), 100 μm (C). Dette tallet er fra Gong et al.26. Forkortelser: ROI = regioner av interesse; MB = mesiobuccal rot; DB = distobukkal rot; P = palatal rot; HE = hematoksylin-eosin; OPN = osteopontin; PDL = periodontalt ligament. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Osteoblastisk mangel på Stat3, nedsatt kjeveortopedisk kraftindusert bendannelse og resorpsjon . (A) Sekvensiell fluorokrommerking av kalcein og alizarinrød S i WT og Stat3Col1α2ERT2 mus under OTM og kvantifisering av mineralapposisjonsrater. n = 5. (B) Immunfluorescensfarging og kvantifisering av OPN + celler i alveolær bein på d10 etter OTM i WT og Stat3Col1α2ERT2 mus. n = 5. (C) TRAP-farging og kvantifisering av TRAP-positive celler i alveolær ben på d4 etter OTM i WT og Stat3Col1α2ERT2 mus. n = 5. (D) Immunfluorescensfarging og kvantifisering av CTSK+-celler i alveolær ben på d4 etter OTM i WT- og Stat3Col1α2ERT2-mus. n = 5. Skalastenger = 10 μm (A), 50 μm (B-D). Dette tallet er fra Gong et al.26. Forkortelser: STAT3 = signaltransduser og aktivator av transkripsjon 3; Col1α = kollagen 1-alfa; WT = vill type; OTM = kjeveortopedisk tannbevegelse; OPN = osteopontin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; TRAP = tartratresistent syrefosfatase; MAR = mineralapposisjonsrater; CTSK = cathepsin K. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Siden maloklusjon er blant de vanligste orale lidelsene som svekker pust, mastication, snakk og til og med utseende, øker etterspørselen etter kjeveortopedi dag for dag med forekomsten som stiger fra 70% til 93% ifølge en tidligere epidemiologisk undersøkelse31,32. Hvordan akselerere alveolær beinremodellering for å øke effektiviteten av kjeveortopedisk behandling trygt, har blitt et hett tema på dette feltet; Derfor er det nødvendig å avklare mekanismen for alveolær beinremodellering drevet av OTM. I tidligere studier brukte forskere in vivo legemiddelinjeksjon for å studere mekanismen for OTM i dyremodeller21,33, noe som var enkelt og enkelt, men det var vanskelig å utelukke påvirkning av narkotika på cellene i andre systemer. Derfor er det svært nødvendig å studere mekanismen for beinremodellering under kjeveortopedisk kraft in vivo.

I de senere år har genknockoutmus blitt mye brukt, noe som gir et solid grunnlag for studiet av genfunksjon og utforskning av terapeutiske mål34. Blant disse teknikkene var hele gen-knockout-teknologien den tidligste tilnærmingen. Adrb2-/ - adrenerg reseptor (Adrb2) knockout-musemodellen ble brukt til å utforske rollen til det sympatiske nervesystemet i alveolær beinremodellering under OTM35. Imidlertid kan totale gen-knockoutmus resultere i embryonal dødelighet i noen tilfeller, noe som hindrer studiet av genfunksjon. Derfor ble betingede knockoutmus utviklet, rettet mot et gen i bestemte celletyper. Men fordi forskning relatert til alveolær beinremodellering ofte er tidsfølsom, er det derfor nødvendig å observere endringene i alveolar bein på bestemte tidspunkter etter modellering.

Inducible betingede gen knockout mus har de to fordelene med tidsmessig og romlig kontroll av DNA-rekombinasjon og vevsspesifisitet, og genknockout kan oppnås på bestemte tidspunkter og spesifikke vev gjennom bruk av medisiner eller hormoner, som bedre kan møte forskningsbehovene. I tillegg er STAT3 en transkripsjonsfaktor som er mye uttrykt i bein og annet vev og har funksjonene til å regulere celleproliferasjon, differensiering, apoptose og immun- og andre viktige funksjoner25. Vi har tidligere rapportert at beinmineraltettheten til ikke-induserte osteoblastspesifikke Stat3 knockoutmus ble redusert28, noe som tyder på at ikke-induserte betingede Stat3 knockoutmus ikke er egnet for den mekanistiske studien av alveolær beinremodellering som må utelukke påvirkning av utvikling.

Derfor genererte vi i denne studien tamoxifen-induserbare osteoblastspesifikke Stat3-genknockoutmus, Stat3Col1α2ERT2, ved å bruke induserbar betinget genknockout-teknologi basert på Cre / loxP-systemet, som er kontrollerbart i tid og rom og mer egnet for studiet av mekanismen for alveolar beinremodellering, samt tillate videre studier av funksjonen til spesifikke celler og gener kombinert med avstamningssporing. Før induksjon av tamoxifen var det ingen åpenbar forskjell mellom Stat3Col1α2ERT2 og villtype mus og ikke noe spesielt i avl. Vi har tidligere funnet at induserbar delesjon av Stat3 i Col1α2+ osteoblaster svekket beindannelse og redusert benmasse hos voksne mus28. I denne studien ble benmetabolismenivået til Stat3Col1α2ERT2-mus redusert i ikke-OTM-grupper, noe som var i samsvar med de tidligere resultatene. Videre, da benmetabolismenivået i OTM-gruppen ble redusert mer signifikant som respons på kjeveortopedisk kraft, kan det vurderes at Stat3 spilte en viktig rolle i reguleringen av beinmetabolisme under mekanisk kraft. Vi undersøkte videre mekanismen for beinremodellering regulert av Stat3. Resultatene indikerte at Stat3 direkte kunne fremme osteoblastdifferensiering 28,29 og påvirket osteoklastdifferensiering ved å regulere crosstalk mellom osteoblaster og osteoklaster gjennom modulering av Mmp3-transkripsjon 29.

I denne protokollen valgte vi området som ligger innenfor tre røtter av M1 i tverrsnittet ved det maksillære beinet av mus som avkastning for å evaluere alveolær beinremodellering. Med dette området er analysen av alveolar bein nærmere den for lange bein, hvor aktiviteten til osteogenese og osteoklastogenese analyseres i samme region, i stedet for den tradisjonelle metoden for å analysere egenskapene til forskjellige sider. Videre, i henhold til den klassiske hypotesen, bør to legemidler med motsatte effekter påføres henholdsvis trykk- og spenningssidene for å akselerere tannbevegelseshastigheten. Denne metoden ga et teoretisk grunnlag for å overvinne disse flaskehalsene. I denne OTM-modellen ble størrelsen på kjeveortopedisk kraft målt ved hjelp av et dynamometer. Imidlertid vil kraften bli litt dempet med reduksjonen i avstanden mellom den første molaren og fortennene. Derfor er det nødvendig å etablere et standardisert mekanisk system for å generere en mer konstant og stabil kjeveortopedisk kraft.

Innenfor protokollen er det noen kritiske trinn som bør holdes i bakhodet. For det første, i prosessen med OTM-modellkonstruksjon, bør den første molaren og snittet være fast ligert for å unngå svikt i kraftpåføring ved dislodgement. For det andre må det tas hensyn til kraftretningen, og horisontal kraft bør påføres den første molar for å unngå tannutvinning forårsaket av påføring av vertikal kraft. Til slutt, når du legger inn, bør orienteringen av prøven bestemmes i henhold til måltverrsnittet, og seksjonene skal observeres i tide for å justere orienteringen for å oppnå ideelle seksjoner.

Avslutningsvis gir vi protokoller for en induserbar, spesifikk, gen knockout musemodell av OTM, som avslører alveolar bein remodellering på forskjellige tidspunkter. Vi vil videre bruke dette til å studere funksjonen til spesifikke celler og gener kombinert med avstamningssporing. Vi satte deretter opp et dynamisk og cellespesifikt mønster in vivo innen OTM-mekanismeforskning, og ga bevis for kjeveortopedi i klinikken. I tillegg gir denne studien detaljerte protokoller for konstruksjon av en OTM-modell, som muliggjør rask beinremodellering ved å stimulere osteoblaster og osteoklaster og gir en ideell modell for studiet av beinremodellering som respons på mekanisk kraft. Mer enn det, beskriver vi metoder for å analysere alveolar bein remodeling under OTM for å gi en ny strategi for studiet av skjelettmekanisk biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); Natural Science Foundation of Shanghai (21ZR1436900, 22ZR1436700); Programmet for Shanghai akademisk / teknologisk forskningsleder (20XD1422300); Klinisk forskningsplan for SHDC (SHDC2020CR4084); det tverrfaglige forskningsfondet ved Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYJC201902, JYJC202116); innovasjonsforskningsteamet på høyt nivå lokale universiteter i Shanghai (SSMUZLCX20180501); Forskningsdisiplinfondet nr. KQYJXK2020 fra Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, og College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University; Opprinnelig leteprosjekt av Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYYC003); To-hundre talentprosjekt av Shanghai Jiao Tong University School of Medicine; Biomaterials and Regenerative Medicine Institute Cooperative Research Project Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (2022LHB02); prosjektet Biobank av Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (YBKB201909, YBKB202216).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  P1020
4% paraformaldehyde Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1101
Alizarin red Sigma-Aldrich A5533
Anti-CTSK antibody Santa Cruz sc-48353
Anti-OPN antibody R&D Systems, Minneapolis, MN, USA AF808
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Closed-coil springs Innovative Material and Devices, Shanghai, China CS1006B
Col1α2CreERT2 mice A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences.
Dexmedetomidine hydrochloride Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTA Beyotime Biotechanology ST069
Embedding tanks Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd 80106-1100-16
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 100092183
ImageJ software NIH, Bethesda, MD, USA
Mounting medium with DAPI Beyotime Biotechanology P0131
Mouse dissection platform Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. HK105
Paraffin Sangon biotech Co., Ltd. A601889
Primers for genotyping Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease K Sigma-Aldrich 539480
Self-curing restorative resin 3M ESPE, St. Paul, MN, USA 712-035
Stat3fl/fl mice GemPharmatech Co., Ltd D000527
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648
TRAP staining kit Sigma-Aldrich 387A
Tris-HCl Beyotime Biotechanology ST780
Universal tissue fixative Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1105
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10023418
Zoletil VIRBAC 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frost, H. M. The Utah paradigm of skeletal physiology: an overview of its insights for bone, cartilage and collagenous tissue organs. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 18 (6), 305-316 (2000).
  2. Frost, H. M. Wolff's Law and bone's structural adaptations to mechanical usage: an overview for clinicians. The Angle Orthodontist. 64 (3), 175-188 (1994).
  3. Gothlin, G., Ericsson, J. L. The osteoclast: review of ultrastructure, origin, and structure-function relationship. Clinical Orthopaedics and Related Research. (120), 201-231 (1976).
  4. Feng, X., Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: New Insights. Bone Research. 1 (1), 11-26 (2013).
  5. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  6. Zhu, L. X., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), eaaw6143 (2020).
  7. Dai, Q., et al. A RANKL-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mTORC1 in osteoclast formation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), 56468 (2018).
  8. Karsenty, G., Kronenberg, H. M., Settembre, C. Genetic control of bone formation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 629-648 (2009).
  9. Long, F. Building strong bones: molecular regulation of the osteoblast lineage. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (1), 27-38 (2011).
  10. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).
  11. Lang, T., et al. Cortical and trabecular bone mineral loss from the spine and hip in long-duration spaceflight. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (6), 1006-1012 (2004).
  12. Sibonga, J. D. Spaceflight-induced bone loss: is there an osteoporosis risk. Current Osteoporosis Reports. 11 (2), 92-98 (2013).
  13. Yang, Y., et al. Administration of allogeneic mesenchymal stem cells in lengthening phase accelerates early bone consolidation in rat distraction osteogenesis model. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 129 (2020).
  14. Huang, C., Holfeld, J., Schaden, W., Orgill, D., Ogawa, R. Mechanotherapy: revisiting physical therapy and recruiting mechanobiology for a new era in medicine. Trends in Molecular Medicine. 19 (9), 555-564 (2013).
  15. Shu, H. S., et al. Tracing the skeletal progenitor transition during postnatal bone formation. Cell Stem Cell. 28 (12), 2122-2136 (2021).
  16. Wang, X., et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation. Nature Medicine. 19 (1), 93-100 (2013).
  17. Huja, S. S., Fernandez, S. A., Hill, K. J., Li, Y. Remodeling dynamics in the alveolar process in skeletally mature dogs. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (12), 1243-1249 (2006).
  18. Jin, A., et al. FOXO3 mediates tooth movement by regulating force-induced osteogenesis. Journal of Dental Research. 101 (2), 196-205 (2022).
  19. Bumann, A., Carvalho, R. S., Schwarzer, C. L., Yen, E. H. Collagen synthesis from human PDL cells following orthodontic tooth movement. European Journal of Orthodontics. 19 (1), 29-37 (1997).
  20. Kitaura, H., et al. Effect of cytokines on osteoclast formation and bone resorption during mechanical force loading of the periodontal membrane. The Scientific World Journal. 2014, 617032 (2014).
  21. Lu, W., et al. Sclerostin injection enhances orthodontic tooth movement in rats. Archives of Oral Biology. 99, 43-50 (2019).
  22. Seki, Y., et al. Differentiation ability of Gli1(+) cells during orthodontic tooth movement. Bone. 166, 116609 (2023).
  23. Gong, X. Y., et al. Local orthodontic force initiates widespread remodelling of the maxillary alveolar bone. Australasian Orthodontic Journal. 36 (2), 175-183 (2020).
  24. Liu, Y., et al. STAT3 and its targeting inhibitors in osteosarcoma. Cell Proliferation. 54 (2), e12974 (2021).
  25. Guadagnin, E., Mazala, D., Chen, Y. W. STAT3 in skeletal muscle function and disorders. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2265 (2018).
  26. Saikia, B., et al. Clinical profile of hyper-IgE syndrome in India. Frontiers in Immunology. 12, 626593 (2021).
  27. van de Veen, W., et al. Impaired memory B-cell development and antibody maturation with a skewing toward IgE in patients with STAT3 hyper-IgE syndrome. Allergy. 74 (12), 2394-2405 (2019).
  28. Zhou, S. R., et al. STAT3 is critical for skeletal development and bone homeostasis by regulating osteogenesis. Nature Communications. 12 (1), 6891 (2021).
  29. Gong, X. Y., et al. Osteoblastic STAT3 is crucial for orthodontic force driving alveolar bone remodeling and tooth movement. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (1), 214-227 (2023).
  30. Yang, Y., et al. Skeletal phenotype analysis of a conditional Stat3 deletion mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), 61390 (2020).
  31. Egic, B. Prevalence of orthodontic malocclusion in schoolchildren in Slovenia. A prospective aepidemiological study. European Journal of Paediatric Dentistry. 23 (1), 39-43 (2022).
  32. Gois, E. G., et al. Incidence of malocclusion between primary and mixed dentitions among Brazilian children A 5-year longitudinal study. The Angle Orthodontist. 82 (3), 495-500 (2012).
  33. Yang, F., et al. Effects Of triptolide on tooth movement and root resorption in rats. Drug Design, Development and Therapy. 13, 3963-3975 (2019).
  34. Wang, C., Sun, H. Progress in gene knockout mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 35 (5), 784-794 (2019).
  35. Cao, H., et al. Force-induced Adrb2 in periodontal ligament cells promotes tooth movement. Journal of Dental Research. 93 (11), 1163-1169 (2014).

Tags

Medisin utgave 197 Kjeveortopedisk tannbevegelse Benmetabolisme mekanisk kraft dyremodell STAT3 Rolle i osteoblaster Tamoxifen-induserbar musemodell kjeveortopedisk kraft alveolær benfenotype mikro-CT stereomikroskopi histologisk analyse osteoblaster osteoklaster
Bruk av induserbare osteoblastiske avstamningsspesifikke <em>Stat3</em> Knockout-mus for å studere alveolær beinremodellering under kjeveortopedisk tannbevegelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong,… More

Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong, X., Yang, Y., Zhu, Y., Xu, H., Jin, A., Huang, X., Gao, X., Lu, T., Liu, J., Wang, X., Dai, Q., Jiang, L. Using Inducible Osteoblastic Lineage-Specific Stat3 Knockout Mice to Study Alveolar Bone Remodeling During Orthodontic Tooth Movement. J. Vis. Exp. (197), e65613, doi:10.3791/65613 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter