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Utilizzo di topi knockout Stat3 inducibili specifici per il lignaggio osteoblastico per studiare il rimodellamento dell'osso alveolare durante il movimento ortodontico dei denti

Published: July 21, 2023 doi: 10.3791/65613
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, *6, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 2,3,4,5,7, 1,2,3,4,5
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University, 3National Center for Stomatology, 4National Clinical Research Center for Oral Diseases, 5Shanghai Key Laboratory of Stomatology, 6Shanghai Starriver Bilingual School, 7The 2nd Dental Center, Ninth People’s Hospital, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Questo studio fornisce un protocollo per l'utilizzo di topi knockout Stat3 inducibili specifici per il lignaggio osteoblastico per studiare il rimodellamento osseo sotto la forza ortodontica e descrive i metodi per analizzare il rimodellamento dell'osso alveolare durante il movimento ortodontico dei denti, facendo così luce sulla biologia meccanica scheletrica.

Abstract

L'osso alveolare, con un alto tasso di turnover, è l'osso più attivamente rimodellante del corpo. Il movimento ortodontico dei denti (OTM) è un processo artificiale comune di rimodellamento dell'osso alveolare in risposta alla forza meccanica, ma il meccanismo sottostante rimane sfuggente. Studi precedenti non sono stati in grado di rivelare il meccanismo preciso del rimodellamento osseo in qualsiasi tempo e spazio a causa delle restrizioni relative al modello animale. Il trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3 (STAT3) è importante nel metabolismo osseo, ma il suo ruolo negli osteoblasti durante l'OTM non è chiaro. Per fornire prove in vivo che STAT3 partecipa all'OTM in punti temporali specifici e in particolari cellule durante l'OTM, abbiamo generato un modello murino knockout Stat3 specifico per il lignaggio osteoblastico inducibile dal tamoxifene, applicato la forza ortodontica e analizzato il fenotipo dell'osso alveolare.

La tomografia microcomputerizzata (Micro-CT) e la stereomicroscopia sono state utilizzate per accedere alla distanza OTM. L'analisi istologica ha selezionato l'area situata all'interno di tre radici del primo molare (M1) nella sezione trasversale dell'osso mascellare come regione di interesse (ROI) per valutare l'attività metabolica degli osteoblasti e degli osteoclasti, indicando l'effetto della forza ortodontica sull'osso alveolare. In breve, forniamo un protocollo per l'utilizzo di topi knockout Stat3 inducibili per il lignaggio osteoblastico specifico per studiare il rimodellamento osseo sotto forza ortodontica e descrivere metodi per analizzare il rimodellamento osseo alveolare durante l'OTM, gettando così nuova luce sulla biologia meccanica scheletrica.

Introduction

È generalmente noto che l'osso è sottoposto a costante ricostruzione per tutta la vita, in risposta a forze meccaniche secondo la legge di Wolff 1,2. Un'adeguata stimolazione meccanica, come la gravità e l'esercizio quotidiano, mantiene la massa ossea e la forza e previene la perdita ossea stimolando sia gli osteoblasti che gli osteoclasti. Gli osteoclasti, responsabili del riassorbimento osseo 3,4,5,6,7, e gli osteoblasti, responsabili della formazione ossea 8,9,10, mantengono l'omeostasi ossea e funzionano congiuntamente nel processo biologico di rimodellamento osseo. Al contrario, in assenza di stimoli di carico, come negli astronauti in condizioni di microgravità a lungo termine, le ossa subiscono una perdita di densità minerale ossea del 10%, aumentando così il rischio di osteoporosi11,12. Inoltre, le terapie meccaniche non invasive e convenienti, tra cui l'ortodonzia e l'osteogenesi da distrazione, sono emerse come trattamenti per le malattie ossee13,14. Tutto ciò ha dimostrato che la forza meccanica svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento della qualità e della quantità dell'osso. Studi recenti hanno generalmente analizzato il rimodellamento osseo in risposta al carico meccanico utilizzando modelli che richiedono molto tempo come i test di sospensione della ruota e della coda, che di solito richiedevano 4 settimane o più per simulare il carico o lo scarico della forza15,16. Pertanto, c'è richiesta di un modello animale conveniente ed efficiente per lo studio del rimodellamento osseo guidato dal carico di forza.

L'osso alveolare è il più attivo in termini di rimodellamento osseo, con un alto tasso di turnover17. Il movimento ortodontico dei denti (OTM), un trattamento comune per la malocclusione, è un processo artificiale di rimodellamento dell'osso alveolare in risposta alla forza meccanica. Tuttavia, l'OTM, che induce un rapido rimodellamento osseo18, è anche un modo per risparmiare tempo per studiare gli effetti della forza meccanica sul rimodellamento osseo rispetto ad altri modelli con un lungo periodo sperimentale. Pertanto, l'OTM è un modello ideale per studiare il rimodellamento osseo sotto stimoli meccanici. È interessante notare che il meccanismo del rimodellamento dell'osso alveolare è spesso sensibile al tempo ed è necessario osservare i cambiamenti nel rimodellamento dell'osso alveolare in determinati momenti dopo la modellazione. Con il duplice vantaggio del controllo temporale e spaziale della ricombinazione del DNA e della specificità tissutale, un modello murino knockout genico condizionale inducibile è una scelta adatta per gli studi OTM.

Convenzionalmente, il rimodellamento dell'osso alveolare mediato da OTM è stato suddiviso in zone di tensione che coinvolgono la formazione ossea e zone di pressione che coinvolgono il riassorbimento osseo 19,20,21, che è più dettagliato ma difficile da regolare. Inoltre, Yuri et al. hanno riportato che il tempo di formazione dell'osso in OTM differiva sui lati di tensione e compressione22. Inoltre, uno studio precedente aveva dimostrato che il primo molare poteva avviare un ampio rimodellamento dell'osso alveolare mascellare sotto la forza ortodontica, che non era vincolata alle zone di tensione e pressione23. Pertanto, abbiamo selezionato l'area situata all'interno di tre radici di M1 nella sezione trasversale dell'osso mascellare come regione di interesse (ROI) e abbiamo descritto metodi per valutare l'attività di osteoblasti e osteoclasti nella stessa area per valutare il rimodellamento dell'osso alveolare sotto OTM.

Come fattore di trascrizione nucleare, il trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3 (STAT3) si è dimostrato critico nell'omeostasi ossea24,25. Studi precedenti hanno riportato bassa densità minerale ossea e fratture patologiche ricorrenti nei topi con mutazione Stat3 26,27. Il nostro studio precedente ha dimostrato che la delezione di Stat3 negli osteoblasti Osx+ ha causato malformazione craniofacciale e osteoporosi, nonché fratture ossee spontanee28. Recentemente, abbiamo fornito evidenze in vivo con un modello murino inducibile di delezione di Stat3 osteoblasto-specifico (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, di seguito denominato Stat3Col1α2ERT2) che STAT3 è fondamentale nel mediare gli effetti della forza ortodontica che guida il rimodellamento dell'osso alveolare29. In questo studio, forniamo metodi e protocolli per l'utilizzo di topi knockout Stat3 inducibili per la linea osteoblastica specifica per studiare il rimodellamento osseo sotto forza ortodontica e descrivere metodi per analizzare il rimodellamento osseo alveolare durante l'OTM, facendo così luce sulla biologia meccanica scheletrica.

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Protocol

Tutti i metodi che coinvolgono gli animali qui descritti sono stati approvati dal comitato etico del Nono Ospedale del Popolo di Shanghai, Scuola di Medicina dell'Università Jiao Tong di Shanghai (n. 82101048).

1. Stabilire topi knockout Stat3 inducibili per il lignaggio osteoblastico

NOTA: I topi Stat3 fl/fl sono stati ottenuti commercialmente; il ceppo Col1α2CreERT2è stato un regalo (vedi la Tabella dei Materiali per tutti i dettagli). Per tutti gli animali sono stati forniti mangime e acqua in pellet standardizzati e condizioni ambientali standard di laboratorio (temperatura ambiente da 22 °C a 26 °C e umidità al 50%-55%).

  1. Metti un topo maschio sessualmente maturo con due topi femmina nella stessa gabbia. Dopo 18 giorni, controlla i neonati ogni giorno. Rimuovere eventuali topi femmina gravidi in una gabbia vuota e tenerli da soli se necessario. Metti i topi maschi in altre gabbie di riproduzione diverse se i topi femmina non sono gravidi entro 30 giorni.
  2. Genera Stat3fl/+; topi Col1α2 CreERT2 ibridando topi Stat3 fl/fl con topi Col1α2 CreERT2; mantenere tutti questi mouse sullo sfondo C57BL/6. Raccogliere le punte della coda di 2-5 mm per la genotipizzazione e mantenere il maschio Stat3fl/+; TopiCol1α2 CreERT2 fino a quando non sono sessualmente maturi (F1).
  3. Ibridare un maschio di 6 settimane Stat3fl/ +; TopiCol1α2 CreERT2 con topi femminaStat3 fl/fl. Raccogliere le punte della coda di 2-5 mm quando i topi hanno 2 settimane di età per la genotipizzazione e mantenere il maschio Stat3 fl/fl; Col1α2 CreERT2 (Stat3Col1α2ERT2) topi fino a quando non sono sessualmente maturi (F2).
  4. Ibrido maschio di 6 settimane Stat3 fl/fl; TopiCol1α2 CreERT2 con topi femminaStat3 fl/fl (F3). Raccogliere le punte della coda di 2-5 mm quando i topi hanno 2 settimane di età per la genotipizzazione e utilizzare i topi più giovani dello stesso genotipo per sostituire i topi riproduttori più anziani quando appropriato (F3+N).
    NOTA: La capacità riproduttiva dei topi diminuisce dopo gli 8 mesi di età, quindi i topi nelle gabbie di allevamento devono essere attentamente monitorati e sostituiti secondo necessità. Inoltre, in base ai requisiti sperimentali, il numero di gabbie da riproduzione dovrebbe essere opportunamente aumentato per evitare l'estinzione dei topi con il gene bersaglio.

2. Delezione inducibile di Stat3 negli osteoblasti esprimenti Col1α2 da parte del tamoxifene

  1. Sciogliere il tamoxifene in olio di mais a 20 mg/mL in una provetta da centrifuga e proteggere dalla luce avvolgendolo in un foglio. Mettere la provetta da centrifuga ricoperta di pellicola su un miscelatore rotante e mescolare a temperatura ambiente fino a completa dissoluzione.
    NOTA: Il tamoxifene è stato ottenuto commercialmente e conservato al buio a 4 °C.
  2. Selezionare dieci topi maschi di 6 settimane e dividerli in gruppi Stat3 fl/fl e Stat3 Col1α2ERT2 con cinque topi in ciascun gruppo. Somministrare tamoxifene (100 mg·kg-1·bw) ogni 2 giorni per 1 settimana mediante iniezione intraperitoneale.

3. Modello di movimento ortodontico dei denti (OTM)

  1. Preparare una piattaforma di dissezione per topi in plastica sterilizzata come tavolo operatorio per immobilizzare i topi.
    NOTA: Il tavolo di dissezione del topo è stato ottenuto commercialmente e consisteva in quattro montanti in gomma regolabili e un'asta metallica per immobilizzare i topi. Utilizzare strumenti e strumenti sterili durante tutta la procedura.
  2. Attacca un elastico a ciascun palo in gomma per il fissaggio degli arti.
  3. Legare un elastico tra i due pali superiori in gomma; legare un filo all'elastico per trattenere gli incisivi inferiori; e legare un altro filo all'asta di metallo per tenere gli incisivi superiori.
  4. Anestetizzare topi maschi di 7 settimane con una soluzione 0,1 mL di dexmedetomidina cloridrato (0,1 mg·kg-1·bw) e zoletil (tiletamina cloridrato per 20 mg·kg-1·bw e zolazepam cloridrato per 20 mg·kg-1·bw) disciolti in soluzione fisiologica mediante iniezione intraperitoneale prima dell'intervento chirurgico. Assicurarsi che i topi siano sottoposti a un'anestesia adeguata durante l'operazione.
    NOTA: Prestare attenzione alla data di uso effettivo dei farmaci e non utilizzare farmaci scaduti.
  5. Verificare che i topi siano sottoposti a corretta anestesia stringendo le dita degli arti posteriori con le dita.
    NOTA: Se i topi non rispondono al test, significa che sono incoscienti e l'anestesia ha raggiunto la profondità desiderata. A quel punto, i topi sono in uno stato di rilassamento muscolare degli arti, con respirazione e frequenza cardiaca fluide, e l'operazione può essere avviata.
  6. Utilizzare un unguento veterinario sugli occhi dei topi per prevenire la secchezza e posizionare il topo anestetizzato in posizione supina sul tavolo operatorio. Usa quattro elastici sui pali di gomma per fissare gli arti, un filo attaccato all'asta di metallo per tenere gli incisivi superiori e un altro attaccato a un elastico tra i due perni di gomma superiori per agganciare gli incisivi inferiori per tenere aperta la mascella inferiore.
  7. Preparare molle elicoidali chiuse (dimensione del filo 0,25 mm, diametro 0,76 mm, lunghezza 1 mm) per l'apparecchio di forza ortodontica.
    NOTA: Tagliare otto fili di molla per ogni mouse. Quattro fili di 1 mm di lunghezza al centro per l'apparecchio di forza e due fili su ciascuna estremità per la legatura con filo di legatura in acciaio.
  8. Legare un'estremità della molla preparata al primo molare mascellare sinistro. Legare l'altra estremità all'incisivo centrale con un filo di legatura in acciaio da 0,1 mm rinforzato con resina fotopolimerizzabile da restauro dopo aver applicato l'adesivo agli incisivi con il cotton fioc per generare una forza stabile di una grandezza di 10 g misurata utilizzando un dinamometro.
  9. Dopo aver completato l'operazione, metti i topi in una gabbia con altri dello stesso ceppo in fase di recupero, oppure metti ogni topo in una gabbia vuota da solo. Assicurarsi che i topi non vengano lasciati incustoditi fino a quando non hanno ripreso coscienza a sufficienza 2−4 ore dopo l'operazione per mantenere il decubito sternale. Per i giorni successivi, nutrire i topi con una dieta morbida e osservarli regolarmente per assicurarsi che non si verifichino complicazioni e per accertare il grado di dolore post-chirurgico; somministrare farmaci analgesici secondo necessità.
    NOTA: I topi che hanno subito un intervento chirurgico non devono essere restituiti alla compagnia di altri topi fino a quando non si sono completamente ripresi. Non mettere topi post-chirurgici in convalescenza con topi non anestetizzati . I topi devono essere tenuti al caldo durante il recupero.
  10. Controllare l'apparecchio ortodontico ogni giorno ed escludere eventuali topi sperimentali con spostamento.

4. Raccolta dei campioni

  1. Eutanasiare i topi in tre diversi momenti attraverso la lussazione cervicale: 4 giorni (d4), 7 giorni (d7) e 10 giorni (d10) dopo l'inizio dell'OTM.
  2. Usa le forbici oftalmiche per tagliare la pelle verticalmente dalla regione cervicale e poi separa la testa dal corpo con l'intera pelle della testa sezionata.
  3. Tagliare la pelle e i muscoli buccinatori dall'angolo dell'oris bilaterale alla regione posteriore della mandibola. Scollegare completamente i muscoli vestibolari e i tendini attaccati ai coracoidi per rimuovere la mandibola e tagliare le ossa in eccesso per ottenere mascelle complete. Quindi, rimuovere l'osso dietro i terzi molari bilaterali e strappare la mucosa palatale. Infine, scollegare l'apparecchio ortodontico e tagliare l'osso tra gli incisivi lungo la sutura palatina mediana per ottenere l'osso alveolare dei lati destro e sinistro.
    NOTA: Assicurarsi che la regione dagli incisivi al terzo molare sia mantenuta intatta su entrambi i lati.

5. Preparazione per la sezione di paraffina

  1. Fissaggio: Immergere l'osso alveolare raccolto in paraformaldeide al 4% per 48 ore e tagliare con forbici oftalmiche nella cappa per le sezioni 6 e 7.
  2. Decalcificazione: Lavare delicatamente i campioni con 1x PBS per 3 x 10 min. Decalcificare i campioni in fissativo tissutale universale (pH 8,0), sostituito con soluzione fresca ogni 2 giorni, per 5 settimane fino a quando le ossa possono essere facilmente penetrate dalla punta di un ago.
  3. Disidratazione: lavare i campioni in 1x PBS per 3 x 10 minuti, quindi immergerli in sequenza in etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene, per 2 x 1 h ciascuna soluzione.
  4. Immergere i campioni in una miscela 1:1 di xilene e paraffina per 30 minuti e poi in paraffina a 65 °C per una notte.
  5. Incorporamento: Selezionare i serbatoi di inclusione adatti. Posizionare l'osso alveolare in modo uniforme con i denti rivolti verso l'alto allo stesso livello. Rimuovere i campioni dal serbatoio di inclusione e trasferirli in un congelatore a -20 °C, quindi numerarli quando la paraffina è completamente raffreddata e solida.
  6. Con l'aiuto di un microtomo, tagliare continuamente sezioni spesse da venti a quaranta 4 μm sul piano trasversale e galleggiare su acqua a 37 °C. Incollare le sezioni sui vetrini da microscopio e cuocere a 42 °C per una notte.

6. Misurazione della distanza OTM

  1. Fotografare campioni da tre punti temporali verticalmente dal piano occlusale mediante microscopia stereoscopica.
  2. Scansiona l'osso alveolare con uno scanner Micro-CT. Ricostruisci immagini 3D del piano sagittale massimo dell'osso alveolare mascellare, in cui sono completamente visibili tre molari, utilizzando il software di supporto dello scanner seguendo le istruzioni del produttore.
  3. Misurare la distanza OTM utilizzando il software ImageJ:
    1. Aprire il software ImageJ e utilizzare lo strumento Linea retta per creare un segmento di linea di distanza nota.
    2. Fare clic su Analizza e scegliere Imposta scala per immettere il valore della distanza della linea disegnata in Distanza nota e immettere le unità in Unità di lunghezza.
    3. Tracciare una linea tra i punti medi della cresta marginale mesiale di M2 e la cresta marginale distale di M1 e fare clic su Misurazione. I risultati visualizzati nella colonna Lunghezza rappresentano la distanza OTM.

7. Analisi istologica

  1. Selezione della regione di interesse (ROI): definire l'osso alveolare del primo molare (M1) come ROI, situato esattamente all'interno di tre radici di M1 nella sezione trasversa dell'osso mascellare. Questa regione non solo raggiunge l'osso corticale del primo molare in direzione buccale-linguale, ma si estende anche al centro dell'asse lungo della radice mesiobuccale, compresa la mezza area tra la radice distobuccale e la radice palatale.
  2. Analisi dell'osteogenesi
    1. Doppia etichettatura e analisi del rosso calceina e alizarina
      1. Preparazione di calceina e rosso alizarina: sciogliere la calceina in una soluzione di NaHCO3 al 2% a 1 mg/mL e il rosso di alizarina S in H 2 O a2mg/mL.
        NOTA: In questo studio, la calceina e il rosso alizarina sono stati ottenuti commercialmente.
      2. Somministrare calceina (20 mg·kg-1·p.c.) il giorno 1 e alizarina rossa S (40 mg·kg-1·p.c.) il giorno 8 mediante iniezione intraperitoneale dopo l'inizio dell'OTM. Sopprimere i topi il giorno 10 e prelevare l'osso alveolare.
      3. Preparare i campioni e incorporarli seguendo i passaggi 5.1 e 5.3-5.5. Per maggiori dettagli, fare riferimento a Yang et al.30.
      4. Utilizzando un microtomo rotante, tagliare sezioni di 5 μm di spessore continuo sul piano trasversale. Far aderire le sezioni ai vetrini da microscopio e montarle con vetrini coprioggetti utilizzando balsamo neutro.
        NOTA: Il resto dei campioni deve essere conservato con essiccante a temperatura ambiente.
      5. Esaminare e fotografare le sezioni al microscopio a fluorescenza e calcolare il tasso di apposizione minerale (MAR) e il tasso di formazione ossea (BFR/BS) secondo il metodo precedentemente descritto30.
    2. Immunofluorescenza
      1. Selezionare le sezioni di paraffina adatte e infornare a 65 °C per 30 min.
      2. Deceratura: immergere le sezioni nello xilene per 5 minuti e ripetere due volte con xilene fresco ogni volta.
      3. Reidratazione: immergere le sezioni in sequenza in etanolo al 95%, etanolo al 75%, etanolo al 50% e ddH2O, ciascuna per 5 minuti.
      4. Lavare delicatamente le sezioni con 1 x PBS per 2 x 5 min.
      5. Recupero dell'antigene: immergere le sezioni in una miscela di Tris-HCl (0,05 M, pH 8,0), EDTA (0,01 M, pH 8,0) e proteasi K (10 μg/mL) in ddH2O e incubare a 37 °C per 15 min.
      6. Lavare delicatamente le sezioni con 1 x PBS per 3 x 5 min.
      7. Blocco: rimuovere il liquido in eccesso dalle sezioni e disegnare un cerchio attorno all'area target utilizzando un pennarello idrofobico. Per bloccare il legame aspecifico, coprire con un tampone bloccante contenente il 10% di albumina sierica bovina e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
        NOTA: Fare attenzione a non asciugare le sezioni troppo a lungo, per non influire sui risultati.
      8. Incubazione degli anticorpi primari: diluire l'anticorpo anti-osteopontina (OPN) con diluente anticorpale alla concentrazione raccomandata e aggiungere 30-50 μL a ciascun campione; incubare a 4 °C per una notte in camera umidificata.
        NOTA: Assicurarsi di lasciare un po' d'acqua nella camera e coprirla per evitare che il fluido anticorpale evapori.
      9. Lavare delicatamente le sezioni con 1 x PBS per 3 x 10 min.
        NOTA: I passaggi 7.2.2.10-7.2.2.12 devono essere eseguiti al buio.
      10. Incubazione di anticorpi secondari fluorescenti: selezionare un anticorpo secondario fluorescente appropriato corrispondente all'anticorpo primario e diluirlo alla concentrazione raccomandata. Aggiungere 30-50 μL a ciascun campione e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
      11. Lavare delicatamente le sezioni con 1 x PBS per 2 x 10 min.
      12. Utilizzare un mezzo di montaggio antisbiadimento con 4'6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per montare i campioni. Conserva le sezioni al buio e fotografale il prima possibile.
      13. Eseguire la microscopia a fluorescenza incorporando una fotocamera digitale per esaminare e fotografare le sezioni e contare le cellule positive nelle regioni di interesse (ROI).
  3. Analisi dell'osteoclastogenesi
    1. Colorazione con fosfatasi acida resistente ai tartrati (TRAP)
      1. Selezionare sezioni di paraffina adatte. Decerare e reidratare seguendo i passaggi 7.2.2.1-7.2.2.3.
      2. Preparare una nuova soluzione colorante utilizzando il kit di colorazione TRAP secondo le istruzioni del produttore e preriscaldare a 37°C.
      3. Aggiungere 30-50 μL di soluzione colorante a ciascun campione e incubare a 37 °C in una camera umidificata per 20-30 minuti. Controllare ogni 5 minuti fino a quando gli osteoclasti multinucleati rossi non vengono visti al microscopio ottico. Arrestare la reazione con ddH2O.
      4. Countercolorare in soluzione di ematossilina per 30 s e immergere in una soluzione di ammoniaca all'1% per 1 min per un colore blu stabile. Risciacquare sotto l'acqua del rubinetto a lento scorrimento.
      5. Montare le sezioni con vetrini coprioggetti utilizzando balsamo neutro e asciugare per una notte.
      6. Scatta fotografie al microscopio e conta il numero di cellule TRAP-positive con più di tre nuclei, seguendo il nostro precedente protocollo30.
    2. Immunofluorescenza: utilizzare l'anticorpo catepsina K (CTSK) alla concentrazione raccomandata per l'immunofluorescenza e seguire il protocollo descritto nel paragrafo 7 di cui sopra.

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Representative Results

Utilizzando questo protocollo, abbiamo stabilito un modello murino knockout Stat3 inducibile specifico per il lignaggio degli osteoblasti (Stat3Col1α2ERT2) per esaminare gli effetti della delezione di STAT3 sul rimodellamento dell'osso alveolare ortodontico guidato dalla forza (Figura 1A,B). La delezione di STAT3 negli osteoblasti è stata confermata dalla colorazione in immunofluorescenza dell'osso alveolare (Figura 1C).

La microscopia stereoscopica ha indicato che la distanza OTM dei topi WT è aumentata su d4, d7 e d10. Tuttavia, nei topi Stat3Col1α2ERT2 , la distanza OTM è stata ridotta (Figura 2B). Questo fenomeno è stato confermato anche dall'analisi Micro-CT su d10, indicando che la delezione osteoblastica di Stat3 ha rallentato l'OTM (Figura 2C).

Per l'analisi istologica, l'area situata all'interno di tre radici di M1 nella sezione trasversa all'osso mascellare è stata definita come ROI, che mostra la situazione complessiva del rimodellamento dell'osso alveolare (Figura 3A). La colorazione con ematossilina-eosina e la colorazione con immunofluorescenza OPN hanno mostrato l'intero osso alveolare di ROI (Figura 3B,C).

Per l'analisi osteogenica, la marcatura del rosso di alizarina e della calceina ha indicato che la forza ortodontica ha aumentato il tasso di apposizione minerale (MAR) dell'osso alveolare nei topi WT, ma il MAR nel gruppo OTM di topi Stat3Col1α2ERT2 è stato ridotto rispetto ai topi WT (Figura 4A). Inoltre, la colorazione in immunofluorescenza ha dimostrato che il numero di osteoblasti OPN+ aumentava sotto la forza ortodontica, ma c'erano meno osteoblasti OPN+ nel gruppo OTM di topi Stat3Col1α2ERT2 rispetto ai topi WT (Figura 4B). Per l'analisi osteoclastogenica, la colorazione TRAP ha indicato che, sotto la forza ortodontica, il numero di osteoclasti è aumentato nei topi WT, ma c'erano meno osteoclasti nel gruppo OTM di topi Stat3Col1α2ERT2 rispetto ai topi WT (Figura 4C). Questo fenomeno è stato confermato anche dalla colorazione in immunofluorescenza di CTSK (Figura 4D). Questi risultati hanno rivelato che il deficit osteoblastico di Stat3 ha ridotto l'attività sia degli osteoblasti che degli osteoclasti in risposta alla forza ortodontica e ha compromesso il rimodellamento osseo durante il movimento dei denti.

Figure 1
Figura 1: Illustrazione della generazione di modelli murini knockout Stat3 specifici per il lignaggio degli osteoblasti inducibili. (A) Diagramma schematico del knockout di Stat3 negli osteoblasti esprimenti Col1α2 indotto dal tamoxifene (a sinistra). Lo schema dell'esperimento: a topi maschi wild-type e Stat3Col1ERT2 di 6 settimane è stato somministrato TA (100 mg·kg-1·bw) ogni 2 giorni da una settimana prima della costruzione del modello OTM e sacrificati per l'analisi su d4, d7 e d10 dopo OTM (a destra). (B) Progresso dell'ibridazione di topi knockout Stat3 inducibili per osteoblasti specifici del lignaggio. (C) Doppia colorazione in immunofluorescenza di STAT3 e OPN nell'osso alveolare di topi WT e Stat3Col1ERT2 su d10 dopo OTM e quantificazione di cellule doppie positive su lati non-OTM e lati OTM. n = 5; Barre di scala = 50 μm. Questa figura è tratta da Gong et al. 26. Abbreviazioni: STAT3 = trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3; Col1α = collagene 1-alfa; TA = tamoxifene; WT = tipo selvatico; OTM = movimento ortodontico del dente; OPN = osteopontina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Deficit osteoblastico del movimento decelerato del dente ortodontico Stat3 (A) Il diagramma schematico del modello OTM in vivo. La molla si legava tra gli incisivi e il primo molare (M1) e induceva la forza ortodontica a spostare M1 verso la cresta mesiale. (B) La distanza OTM di d0, d4, d7 e d10 dopo OTM nei topi WT e nei topi Stat3Col1α2ERT2 . (C) Immagini rappresentative dei lati non-OTM e dei lati OTM in topi WT e Stat3Col1α2ERT2 su d10 dopo OTM mediante micro-CT. n = 5. Barre graduate = 1 mm (B), 500 μm (C). Questa figura è tratta da Gong et al.26. Abbreviazioni: STAT3 = trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3; Col1α = collagene 1-alfa; WT = tipo selvatico; OTM = movimento ortodontico del dente; SAG = piano sagittale. Le curve tratteggiate indicano la distanza OTM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Illustrazione delle regioni di interesse. (A) Diagramma schematico delle regioni di ROI. L'area tratteggiata situata all'interno di tre radici di M1 nella sezione trasversale delle mascelle è stata selezionata come ROI. Le tre radici di M1 includono la radice mesiobuccale, la radice distobuccale e la radice palatale. (B) Colorazione HE dell'intero osso alveolare di M1 nei topi. (C) Colorazione immunofluorescente di OPN nell'intero osso alveolare di M1 nei topi. Barre di scala = 200 μm (B), 100 μm (C). Questa figura è tratta da Gong et al.26. Abbreviazioni: ROI = regioni di interesse; MB = radice mesiobucca; DB = radice distobuccale; P = radice palatale; HE = ematossilina-eosina; OPN = osteopontina; PDL = legamento parodontale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Deficit osteoblastico di Stat3 alterato nella formazione e riassorbimento osseo indotto dalla forza ortodontica . (A) Marcatura sequenziale del fluorocromo mediante calceina e alizarina rossa S in topi WT e Stat3Col1α2ERT2 durante OTM e quantificazione dei tassi di apposizione minerale. n = 5. (B) Colorazione in immunofluorescenza e quantificazione di cellule OPN+ in osso alveolare su d10 dopo OTM in topi WT e Stat3Col1α2ERT2. n = 5. (C) Colorazione TRAP e quantificazione di cellule TRAP-positive nell'osso alveolare su d4 dopo OTM in topi WT e Stat3Col1α2ERT2. n = 5. (D) Colorazione in immunofluorescenza e quantificazione di cellule CTSK+ nell'osso alveolare su d4 dopo OTM in topi WT e Stat3Col1α2ERT2. n = 5. Barre di scala = 10 μm (A), 50 μm (B-D). Questa figura è tratta da Gong et al.26. Abbreviazioni: STAT3 = trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3; Col1α = collagene 1-alfa; WT = tipo selvatico; OTM = movimento ortodontico del dente; OPN = osteopontina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; TRAP = fosfatasi acida resistente ai tartrati; MAR = tassi di apposizione minerale; CTSK = catepsina K. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Poiché la malocclusione è tra i disturbi orali più comuni che compromettono la respirazione, la masticazione, il parlare e persino l'aspetto, la domanda di ortodonzia aumenta di giorno in giorno con l'incidenza che sale dal 70% al 93% secondo una precedente indagine epidemiologica31,32. Come accelerare il rimodellamento dell'osso alveolare per aumentare l'efficienza del trattamento ortodontico in modo sicuro è diventato un argomento caldo in questo campo; pertanto, è necessario chiarire il meccanismo del rimodellamento dell'osso alveolare guidato dall'OTM. In studi precedenti, i ricercatori hanno utilizzato l'iniezione di farmaci in vivo per studiare il meccanismo dell'OTM nei modelli animali21,33, il che era semplice e facile, ma era difficile escludere l'influenza dei farmaci sulle cellule di altri sistemi. Pertanto, è altamente necessario studiare il meccanismo del rimodellamento osseo sotto la forza ortodontica in vivo.

Negli ultimi anni, i topi knockout genici sono stati ampiamente utilizzati, fornendo una solida base per lo studio della funzione genica e l'esplorazione di bersagli terapeutici34. Tra queste tecniche, la tecnologia di knockout dell'intero gene è stato il primo approccio. Il modello murino knockout del recettore adrenergico Adrb2-/- (Adrb2) è stato utilizzato per esplorare il ruolo del sistema nervoso simpatico nel rimodellamento dell'osso alveolare durante l'OTM35. Tuttavia, in alcuni casi, i topi knockout per geni totali possono causare letalità embrionale, ostacolando lo studio della funzione genica. Pertanto, sono stati sviluppati topi knockout condizionali, mirati a un gene in specifici tipi di cellule. Tuttavia, poiché la ricerca relativa al rimodellamento dell'osso alveolare è spesso sensibile al tempo, è quindi necessario osservare i cambiamenti nell'osso alveolare in momenti specifici dopo la modellazione.

I topi knockout genici condizionali inducibili presentano il duplice vantaggio del controllo temporale e spaziale della ricombinazione del DNA e della specificità tissutale, e il knockout genico può essere ottenuto in punti temporali specifici e tessuti specifici attraverso l'applicazione di farmaci o ormoni, che possono soddisfare meglio le esigenze di ricerca. Inoltre, STAT3 è un fattore di trascrizione ampiamente espresso nell'osso e in altri tessuti e ha le funzioni di regolazione della proliferazione cellulare, della differenziazione, dell'apoptosi e delle funzioni immunitarie e di altre importanti funzioni25. In precedenza abbiamo riportato che la densità minerale ossea dei topi knockout Stat3 specifici per osteoblasti non indotti è stata ridotta28, suggerendo che i topi knockout Stat3 condizionali non indotti non sono adatti per lo studio meccanicistico del rimodellamento osseo alveolare che deve escludere l'influenza dello sviluppo.

Pertanto, in questo studio, abbiamo generato topi knockout del gene Stat3 specifici per osteoblasti inducibili dal tamoxifene, Stat3Col1α2ERT2, impiegando una tecnologia di knockout genico condizionale inducibile basata sul sistema Cre/loxP, che è controllabile nel tempo e nello spazio e più adatta per lo studio del meccanismo di rimodellamento dell'osso alveolare, oltre a consentire ulteriori studi sulla funzione di cellule e geni specifici combinati con il tracciamento del lignaggio. Prima dell'induzione del tamoxifene, non c'era alcuna differenza evidente tra Stat3Col1α2ERT2 e topi wild-type e niente di speciale nell'allevamento. In precedenza abbiamo scoperto che la delezione inducibile di Stat3 negli osteoblasti Col1α2+ ha compromesso la formazione ossea e ridotto la massa ossea nei topi adulti28. In questo studio, il livello del metabolismo osseo dei topi Stat3Col1α2ERT2 nei gruppi non OTM è diminuito, il che era coerente con i risultati precedenti. Inoltre, poiché il livello del metabolismo osseo del gruppo OTM è diminuito in modo più significativo in risposta alla forza ortodontica, si potrebbe ritenere che Stat3 abbia svolto un ruolo importante nella regolazione del metabolismo osseo sotto forza meccanica. Abbiamo ulteriormente esplorato il meccanismo di rimodellamento osseo regolato da Stat3. I risultati hanno indicato che Stat3 potrebbe promuovere direttamente la differenziazione degli osteoblasti 28,29 e influenzare la differenziazione degli osteoclasti regolando il crosstalk tra osteoblasti e osteoclasti attraverso la modulazione della trascrizione di Mmp3 29.

In questo protocollo, abbiamo selezionato l'area situata all'interno di tre radici di M1 nella sezione trasversale dell'osso mascellare dei topi come ROI per valutare il rimodellamento dell'osso alveolare. Con quest'area, l'analisi dell'osso alveolare è più vicina a quella delle ossa lunghe, in cui l'attività dell'osteogenesi e dell'osteoclastogenesi vengono analizzate nella stessa regione, piuttosto che il metodo tradizionale di analisi delle caratteristiche dei diversi lati. Inoltre, secondo l'ipotesi classica, bisognerebbe applicare due farmaci con effetti opposti rispettivamente sul lato della pressione e della tensione, per accelerare la velocità di movimento del dente. Questo metodo ha fornito una base teorica per superare questi colli di bottiglia. In questo modello OTM, l'entità della forza ortodontica è stata misurata utilizzando un dinamometro. Tuttavia, la forza sarebbe leggermente attenuata con la riduzione della distanza tra il primo molare e gli incisivi. Pertanto, è necessario stabilire un sistema meccanico standardizzato per generare una forza ortodontica più costante e stabile.

All'interno del protocollo, ci sono alcuni passaggi critici che dovrebbero essere tenuti a mente. Innanzitutto, nel processo di costruzione del modello OTM, il primo molare e l'incisivo devono essere saldamente legati per evitare il fallimento dell'applicazione della forza per spostamento. In secondo luogo, è necessario prestare attenzione alla direzione della forza e applicare la forza orizzontale al primo molare per evitare l'estrazione del dente causata dall'applicazione della forza verticale. Infine, durante l'inclusione, l'orientamento del provino deve essere determinato in base alla sezione trasversale target e le sezioni devono essere osservate in tempo per regolare l'orientamento per ottenere sezioni ideali.

In conclusione, forniamo protocolli per un modello murino inducibile, specifico, knockout genico di OTM, che rivela il rimodellamento dell'osso alveolare in diversi punti temporali. Utilizzeremo ulteriormente questo per studiare la funzione di cellule e geni specifici combinati con il tracciamento del lignaggio. Abbiamo quindi impostato un modello dinamico e cellula-specifico in vivo nel campo della ricerca sui meccanismi OTM, offrendo prove per l'ortodonzia in clinica. Inoltre, questo studio fornisce protocolli dettagliati per la costruzione di un modello OTM, che consente un rapido rimodellamento osseo stimolando osteoblasti e osteoclasti e fornisce un modello ideale per lo studio del rimodellamento osseo in risposta alla forza meccanica. Inoltre, descriviamo metodi per analizzare il rimodellamento dell'osso alveolare durante l'OTM per fornire una nuova strategia per lo studio della biologia meccanica scheletrica.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); la Fondazione di Scienze Naturali di Shanghai (21ZR1436900, 22ZR1436700); il programma di Shanghai Academic/Technology Research Leader (20XD1422300); Piano di Ricerca Clinica di SHDC (SHDC2020CR4084); il Fondo di ricerca interdisciplinare del Nono Ospedale del Popolo di Shanghai, Scuola di Medicina dell'Università Jiao Tong di Shanghai (JYJC201902, JYJC202116); il team di ricerca sull'innovazione delle università locali di alto livello di Shanghai (SSMUZLCX20180501); il Fondo per la Disciplina della Ricerca n. KQYJXK2020 del Ninth People's Hospital, della Shanghai Jiao Tong University School of Medicine e del College of Stomatology della Shanghai Jiao Tong University; Progetto di esplorazione originale del Nono Ospedale del Popolo di Shanghai, Scuola di Medicina dell'Università Jiao Tong di Shanghai (JYYC003); Progetto Duecento Talenti della Scuola di Medicina dell'Università Jiao Tong di Shanghai; il progetto di ricerca cooperativa dell'Istituto di biomateriali e medicina rigenerativa Scuola di medicina dell'Università Jiao Tong di Shanghai (2022LHB02); il Progetto della Biobanca del Nono Ospedale del Popolo di Shanghai, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (YBKB201909, YBKB202216).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  P1020
4% paraformaldehyde Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1101
Alizarin red Sigma-Aldrich A5533
Anti-CTSK antibody Santa Cruz sc-48353
Anti-OPN antibody R&D Systems, Minneapolis, MN, USA AF808
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Closed-coil springs Innovative Material and Devices, Shanghai, China CS1006B
Col1α2CreERT2 mice A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences.
Dexmedetomidine hydrochloride Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTA Beyotime Biotechanology ST069
Embedding tanks Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd 80106-1100-16
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 100092183
ImageJ software NIH, Bethesda, MD, USA
Mounting medium with DAPI Beyotime Biotechanology P0131
Mouse dissection platform Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. HK105
Paraffin Sangon biotech Co., Ltd. A601889
Primers for genotyping Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease K Sigma-Aldrich 539480
Self-curing restorative resin 3M ESPE, St. Paul, MN, USA 712-035
Stat3fl/fl mice GemPharmatech Co., Ltd D000527
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648
TRAP staining kit Sigma-Aldrich 387A
Tris-HCl Beyotime Biotechanology ST780
Universal tissue fixative Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1105
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10023418
Zoletil VIRBAC 

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References

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Medicina Numero 197 Movimento ortodontico dei denti Metabolismo osseo Forza meccanica Modello animale Ruolo di STAT3 negli osteoblasti Modello murino inducibile dal tamoxifene Forza ortodontica Fenotipo osseo alveolare Micro-CT Stereomicroscopia Analisi istologica Osteoblasti Osteoclasti
Utilizzo di topi knockout <em>Stat3</em> inducibili specifici per il lignaggio osteoblastico per studiare il rimodellamento dell'osso alveolare durante il movimento ortodontico dei denti
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Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong,… More

Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong, X., Yang, Y., Zhu, Y., Xu, H., Jin, A., Huang, X., Gao, X., Lu, T., Liu, J., Wang, X., Dai, Q., Jiang, L. Using Inducible Osteoblastic Lineage-Specific Stat3 Knockout Mice to Study Alveolar Bone Remodeling During Orthodontic Tooth Movement. J. Vis. Exp. (197), e65613, doi:10.3791/65613 (2023).

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