Summary
본 연구는 유도성 조골세포 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스를 사용하여 교정력 하에서 뼈 리모델링을 연구하기 위한 프로토콜을 제공하고, 치아 교정 운동 중 치조골 리모델링을 분석하는 방법을 설명하여 골격 기계 생물학에 대한 실마리를 제공합니다.
Abstract
회전율이 높은 치조골은 신체에서 가장 활발하게 리모델링되는 뼈입니다. 치아 교정 운동(OTM)은 기계적 힘에 반응하여 치조골 뼈를 리모델링하는 일반적인 인위적인 과정이지만 근본적인 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵습니다. 기존 연구들은 동물모델 관련 제약으로 인해 시간과 공간에 구애받지 않는 뼈 리모델링의 정확한 메커니즘을 밝힐 수 없었다. 전사 3의 신호 변환기 및 활성제(STAT3)는 뼈 대사에 중요하지만 OTM 중 조골세포에서 그 역할은 불분명합니다. STAT3가 특정 시점과 OTM 중 특정 세포에서 OTM에 참여한다는 생체 내 증거를 제공하기 위해 타목시펜 유도 조골세포 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스 모델을 생성하고 교정력을 가하고 치조골 표현형을 분석했습니다.
마이크로 컴퓨터 단층 촬영(Micro-CT)과 입체 현미경을 사용하여 OTM 거리에 접근했습니다. 조직학적 분석은 조골세포와 파골세포의 대사 활성을 평가하기 위해 상악골의 단면에서 첫 번째 대구치(M1)의 3개 뿌리 내에 위치한 영역을 관심 영역(ROI)으로 선택하여 치조골에 대한 교정력의 효과를 나타냅니다. 요컨대, 우리는 유도성 조골세포 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스를 사용하여 교정력 하에서 뼈 리모델링을 연구하고 OTM 중 치조골 리모델링을 분석하는 방법을 설명하여 골격 기계 생물학에 대한 새로운 빛을 비추는 프로토콜을 제공합니다.
Introduction
일반적으로 뼈는 울프의 법칙 1,2에 따라 기계적 힘에 반응하여 일생 동안 지속적으로 재건되는 것으로 알려져 있습니다. 중력 및 일상적인 운동과 같은 적절한 기계적 자극은 골량과 강도를 유지하고 조골세포와 파골세포를 모두 자극하여 뼈 손실을 방지합니다. 골 흡수를 담당하는 파골세포(osteoclast)3,4,5,6,7와 골 형성을 담당하는 조골세포(osteoblast) 8,9,10은 뼈의 항상성을 유지하고 뼈 리모델링의 생물학적 과정에서 공동으로 기능합니다. 대조적으로, 장기간의 미세중력 하에서 우주비행사와 같이 하중 자극이 없는 경우, 뼈는 10%의 골밀도 손실을 겪고, 따라서 골다공증의 위험이 증가한다11,12. 또한, 교정 및 산만 골형성을 포함한 비침습적이고 편리한 기계 요법이 뼈 질환의 치료법으로 등장했습니다13,14. 이 모든 것은 기계적 힘이 뼈의 질과 양을 유지하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었습니다. 최근 연구에서는 일반적으로 하중 하중 또는 하역을 시뮬레이션하는 데 일반적으로 4주 이상이 걸리는 러닝 휠 및 테일 서스펜션 테스트와 같은 시간 소모적인 모델을 사용하여 기계적 하중에 대한 반응으로 뼈 리모델링을 분석했습니다15,16. 따라서 힘 하중에 의한 뼈 리모델링을 연구하기 위한 편리하고 효율적인 동물 모델에 대한 수요가 있습니다.
치조골은 뼈 리모델링이 가장 활발하며, 회전율이 높다17. 부정교합에 대한 일반적인 치료법인 치아 교정 운동(OTM)은 기계적 힘에 반응하여 치조골 뼈를 인위적으로 리모델링하는 과정입니다. 그러나, 신속한 골 리모델링을 유도하는 OTM18은 실험 기간이 긴 다른 모델에 비해 뼈 리모델링에 대한 기계적 힘의 효과를 연구하는 시간을 절약할 수 있는 방법이기도 하다. 따라서 OTM은 기계적 자극 하에서 뼈 리모델링을 연구하는 데 이상적인 모델입니다. 치조골 리모델링의 메커니즘은 종종 시간에 민감하며, 모델링 후 특정 시점에서 치조골 리모델링의 변화를 관찰할 필요가 있다는 점은 주목할 만하다. DNA 재조합 및 조직 특이성의 시간적 및 공간적 제어라는 두 가지 장점이 있는 유도 가능한 조건부 유전자 녹아웃 마우스 모델은 OTM 연구에 적합한 선택입니다.
종래, OTM에 의한 치조골 리모델링은 뼈 형성을 수반하는 긴장 영역과 골 흡수를 수반하는 압력 영역으로 나뉘어 왔는데, 이는 더 상세하지만 조절하기 어렵다. 또한, Yuri et al.은 OTM에서 뼈 형성 시간이 장력 및 압박 측면에 따라 다르다고 보고했습니다22. 또한, 종전의 한 연구는 제1대구치가 장력 및 압력 영역(23)에 제약을 받지 않는 교정력 하에서 상악 치조골의 광범위한 리모델링을 시작할 수 있음을 입증하였다. 따라서 상악골의 단면에서 M1의 3개 뿌리 내에 위치한 영역을 관심 영역(ROI)으로 선택하고, OTM에서 치조골 리모델링을 평가하기 위해 동일한 영역에서 조골세포와 파골세포의 활성을 평가하는 방법을 설명했습니다.
핵 전사 인자로서, 전사 3의 신호 변환기 및 활성제(STAT3)는 뼈 항상성에서 중요한 것으로 입증되었습니다24,25. 이전 연구에서는 Stat3 돌연변이 마우스에서 낮은 골밀도와 재발성 병리학적 골절이 보고되었습니다26,27. 이전 연구에서는 Osx+ 조골세포에서 Stat3의 결실이 두개안면 기형과 골다공증, 자발적 골절을 유발한다는 것을 입증했다28. 최근에는 유도성 조골 세포 특이적 Stat3 결실 마우스 모델(Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, 이하 Stat3 Col1α2ERT2)는 STAT3가 치조골 리모델링을 유도하는 교정력의 효과를 매개하는 데 중요하다는 것을 의미한다29. 본 연구에서는 유도성 조골세포 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스를 사용하여 교정력 하에서 뼈 리모델링을 연구하는 방법과 프로토콜을 제공하고 OTM 중 치조골 리모델링을 분석하는 방법을 설명하여 골격 기계 생물학에 대한 실마리를 제공합니다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 동물 관련 방법은 상하이 자오퉁 대학 의과대학 상하이 제9인민병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(82101048번).
1. 유도성 조골세포 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스 확립
참고: Stat3 fl/fl 마우스는 상업적으로 획득되었습니다. Col1α2CreERT2균주는 선물이었습니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 표준화된 실험실 펠릿 먹이와 물 및 표준 실험실 환경 조건(22°C 내지 26°C의 실온 및 50%-55%의 습도)이 모든 동물에게 제공되었다.
- 성적으로 성숙한 수컷 쥐 한 마리와 암컷 쥐 두 마리를 같은 케이지에 넣습니다. 18일 후에는 매일 신생아를 확인하십시오. 임신한 암컷 쥐를 빈 케이지로 옮기고 필요한 경우 혼자 두십시오. 암컷 쥐가 30일 이내에 임신하지 않으면 수컷 쥐를 다른 번식 케이지에 넣습니다.
- Stat3fl/+ 생성; Stat3 fl/fl 마우스를 Col1α2 CreERT2 마우스와 교잡하여 Col1α2CreERT2 마우스; 이 모든 마우스를 C57BL/6 배경에 유지합니다. 유전형 분석을 위해 2-5mm 꼬리 팁을 수집하고 수 Stat3fl/+를 유지합니다. Col1α2CreERT2 마우스가 성적으로 성숙할 때까지(F1).
- 6주 된 수컷 Stat3fl/+를 교배합니다. Col1α2CreERT2 마우스와 암컷 Stat3 fl/fl 마우스. 유전형 분석을 위해 생쥐가 생후 2주가 되었을 때 2-5mm의 꼬리 끝을 수집하고 수컷 Stat3 fl/fl을 유지합니다. Col1α2 CreERT2(Stat3Col1α2ERT2) 생쥐가 성적으로 성숙할 때까지(F2).
- 6주 된 수컷 Stat3 fl/fl을 교잡합니다. Col1α2CreERT2 마우스와 암컷 Stat3 fl/fl 마우스(F3). 생쥐가 생후 2주가 되었을 때 2-5mm의 꼬리 끝을 수집하여 유전형 분석을 하고, 적절한 경우 동일한 유전자형의 어린 생쥐를 사용하여 나이 든 번식 생쥐를 대체합니다(F3+N).
알림: 생쥐의 생식 능력은 생후 8개월 이후에 감소하므로 번식 케이지에 있는 생쥐를 주의 깊게 모니터링하고 필요에 따라 교체해야 합니다. 또한, 실험 요건에 따라 사육 케이지의 수를 적절하게 늘려 표적 유전자 마우스의 멸종을 방지해야 한다.
2. tamoxifen에 의하여 Col1α2 표현하는 osteoblasts에 있는 Stat3의 유도가능한 결실
- 타목시펜을 옥수수 기름에 녹여 원심분리기 튜브에 20mg/mL로 넣고 호일로 싸서 빛으로부터 보호하십시오. 호일로 덮인 원심분리기 튜브를 회전식 믹서에 놓고 완전히 녹을 때까지 실온에서 혼합합니다.
주: Tamoxifen는 상업적으로 얻어지고 4 °C에 어두운 곳에서 저장되었습니다. - 생후 6주 된 수컷 마우스 10마리를 선택하고 각 그룹에 5마리의 마우스를 배치하여 Stat3 fl/fl 및 Stat3 Col1α2ERT2 그룹으로 나눕니다. 타목시펜(100mg·kg-1·bw)을 복강내 주사로 1주일간 2일마다 투여한다.
3. 치아 교정 운동(OTM) 모델
- 멸균된 플라스틱 쥐 해부 플랫폼을 수술대로 준비하여 쥐를 고정시킵니다.
참고: 마우스 해부 테이블은 상업적으로 입수되었으며 마우스를 고정하기 위한 4개의 조정 가능한 고무 기둥과 1개의 금속 막대로 구성되었습니다. 절차 전반에 걸쳐 멸균 기구와 도구를 사용하십시오. - 사지 고정을 위해 각 고무 기둥에 탄성 밴드를 부착합니다.
- 두 개의 상부 고무 기둥 사이에 하나의 탄성 밴드를 묶습니다. 아래 앞니를 고정하기 위해 탄성 밴드에 실을 묶습니다. 그리고 금속 막대에 다른 실을 묶어 위쪽 앞니를 고정합니다.
- 수술 전 복강내 주사로 식염수에 녹인 덱스메데토미딘염산염(0.1mg·kg-1·bw)과 졸레틸(20mg·kg-1·bw용 틸레타민염산염 및 20mg·kg-1·bw용 졸라제팜염산염 20mg·kg-1·bw) 0.1mL 용액으로 7주령 수컷 마우스를 마취한다. 수술 내내 쥐가 적절한 마취를 받고 있는지 확인하십시오.
알림: 의약품의 유효 사용 날짜에 주의하고 유통기한이 지난 의약품을 사용하지 마십시오. - 손가락으로 뒷다리의 발가락을 눌러 쥐가 적절한 마취를 받고 있는지 확인합니다.
알림: 쥐가 테스트에 반응하지 않으면 의식이 없고 마취가 원하는 깊이에 도달했음을 의미합니다. 이때 마우스는 부드러운 호흡과 심박수로 사지 근육 이완 상태에 있으며 수술을 시작할 수 있습니다. - 생쥐의 눈에 수의사 연고를 발라 건조를 방지하고 마취된 생쥐를 수술대의 앙와위 자세로 눕힙니다. 고무 기둥에 4개의 탄성 밴드를 사용하여 팔다리를 고정하고, 금속 막대에 부착된 실 하나를 사용하여 위쪽 앞니를 고정하고, 다른 하나는 두 개의 위쪽 고무 기둥 사이의 탄성 밴드에 부착하여 아래쪽 앞니에 걸어 아래턱을 벌린 상태로 유지합니다.
- 교정력 기구를 위한 폐쇄형 코일 스프링(와이어 크기 0.25mm, 직경 0.76mm, 길이 1mm)을 준비합니다.
알림: 각 마우스에 대해 8개의 스프링 나사산을 자릅니다. 힘 기구를 위한 중간에 1개 mm 길이의 4개의 실, 강철 합자 철사를 사용한 합자를 위한 각 끝에 2개의 실. - 스프링의 한쪽 끝을 상악 왼쪽 첫 번째 어금니에 결찰합니다. Q-tip으로 앞니에 접착제를 도포한 후 광경화 수복 레진으로 보강된 0.1mm 강철 합자 와이어로 다른 쪽 끝을 중앙 앞니에 연결하여 동력계를 사용하여 측정한 10g 크기의 안정적인 힘을 생성합니다.
- 수술을 마친 후 회복 중인 동일한 균주의 다른 쥐와 함께 쥐를 케이지에 넣거나 각 쥐를 빈 케이지에 단독으로 넣습니다. 흉골 누움을 유지하기 위해 수술 후 2-4시간 후에 충분한 의식을 회복할 때까지 쥐를 방치하지 않도록 하십시오. 다음 며칠 동안 쥐에게 부드러운 식단을 먹이고 정기적으로 관찰하여 합병증이 발생하지 않고 수술 후 통증의 정도를 확인합니다. 필요에 따라 진통제를 투여합니다.
알림: 수술을 받은 마우스는 완전히 회복될 때까지 다른 마우스의 회사로 돌려보내서는 안 됩니다. 수술 후 마우스를 마취되지 않은 마우스와 함께 회복시키지 마십시오. 생쥐는 회복 기간 동안 따뜻하게 유지되어야 합니다. - 매일 교정 장치를 점검하고 탈락이 있는 실험용 쥐는 제외하십시오.
4. 검체 채취
- 자궁경부 탈구를 통해 OTM 시작 후 4일(d4), 7일(d7) 및 10일(d10)의 세 가지 다른 시점에서 마우스를 안락사시킵니다.
- 안과 가위를 사용하여 자궁 경부에서 피부를 수직으로 잘라낸 다음 머리의 전체 피부를 절개하여 머리와 몸을 분리합니다.
- 양측 앙굴루스 오리스(bilateral angulus oris)에서 하악 후방(posterior region)까지 피부와 부치네이터 근육을 잘라냅니다. 협측근과 코라코이드에 부착된 힘줄을 완전히 분리하여 하악골을 제거하고 여분의 뼈를 다듬어 완전한 상악골을 얻습니다. 그런 다음 양측 제3대구치 뒤의 뼈를 제거하고 구개 점막을 떼어낸다. 마지막으로 교정 장치를 분리하고 정중 구개 봉합사를 따라 앞니 사이의 뼈를 잘라 오른쪽과 왼쪽의 치조골을 얻습니다.
알림: 앞니에서 세 번째 어금니까지의 영역이 양쪽에서 손상되지 않았는지 확인하십시오.
5. 파라핀 절편 준비
- 고정: 수확한 폐포골을 4% 파라포름알데히드에 48시간 동안 담그고 섹션 6 및 7의 흄 후드에서 안과 가위로 다듬습니다.
- 석회질 제거: 1x PBS로 3 x 10분 동안 표본을 부드럽게 세척합니다. 뼈가 바늘 끝으로 쉽게 침투할 수 있을 때까지 8.0일마다 새 용액으로 교체하고 2일마다 새 용액으로 교체하여 표본을 석회질로 제거합니다.
- 탈수: 표본을 1x PBS에서 3 x 10분 동안 세척한 다음 95% 에탄올, 100% 에탄올 및 크실렌에 순차적으로 담그고 각 용액을 2 x 1시간 동안 담그십시오.
- 자일렌과 파라핀을 1:1로 혼합하여 30분 동안 담근 다음 65°C의 파라핀에 밤새 담그십시오.
- 임베딩: 적절한 임베딩 탱크를 선택합니다. 치아가 같은 높이에 있도록 치조골을 균일하게 배치합니다. 매립 탱크에서 표본을 꺼내 -20°C 냉동고로 옮긴 다음 파라핀이 완전히 냉각되고 고체가 되면 번호를 매깁니다.
- 마이크로톰을 사용하여 20-40 4 μm 두께의 단면을 가로 평면에서 연속적으로 절단하고 37 °C 물에 띄웁니다. 단면을 현미경 슬라이드에 부착하고 42°C에서 밤새 굽습니다.
6. OTM 거리 측정
- 입체 현미경으로 교합면에서 수직으로 세 개의 시점에서 표본을 촬영합니다.
- Micro-CT 스캐너로 치조골을 스캔합니다. 제조업체의 지침에 따라 스캐너의 지원 소프트웨어를 사용하여 3개의 어금니가 완전히 보이는 상악 치조골의 최대 시상면의 3D 이미지를 재구성합니다.
- ImageJ 소프트웨어를 사용하여 OTM 거리를 측정합니다.
- ImageJ 소프트웨어를 열고 직선 도구를 사용하여 알려진 거리의 선분을 만듭니다.
- 분석(Analyze)을 클릭하고 축척 설정(Set Scale)을 선택하여 알려진 거리(Known distance)에 그려진 선 거리 값을 입력하고 길이 단위(Unit of length)에 단위를 입력합니다.
- M2의 근심 가장자리 능선의 중간점과 M1의 원위 가장자리 능선 사이에 선을 그리고 측정(Measurement)을 클릭합니다. 길이 열에 표시된 결과는 OTM 거리를 나타냅니다.
7. 조직학적 분석
- 관심 영역(ROI) 선택: 첫 번째 어금니(M1)의 치조골을 상악골의 횡단면에 있는 M1의 3개 뿌리 내에 정확히 위치한 ROI로 정의합니다. 이 영역은 협측 설측 방향으로 첫 번째 어금니의 피질 뼈에 도달 할뿐만 아니라 원위 뿌리와 구개 뿌리 사이의 절반 영역을 포함하여 mesiobuccal 뿌리의 긴 축의 중간까지 확장됩니다.
- 골형성 분석
- 칼세인(Calcein)과 알리자린(alizarin) 레드 이중 라벨링 및 분석
- 칼세인 및 알리자린 레드 제제: 칼세인을 2% NaHCO3 용액에 1mg/mL로 용해시키고 알리자린 레드 S를H2O에서 2mg/mL로 용해시킵니다.
참고: 이 연구에서는 칼세인과 알리자린 레드를 상업적으로 획득했습니다. - OTM 시작 후 복강내 주사로 1일차에 칼세인(20mg·kg-1·bw)을, 8일차에 알리자린 레드 S(40mg·kg-1·bw)를 투여한다. 10일째에 쥐를 안락사시키고 폐포골을 채취합니다.
- 표본을 준비하고 5.1 및 5.3-5.5단계에 따라 삽입합니다. 자세한 내용은 Yang et al.30을 참조하십시오.
- 회전식 마이크로톰을 사용하여 횡평면에서 5μm 두께의 단면을 연속적으로 절단합니다. 섹션을 현미경 슬라이드에 부착하고 중성 발삼을 사용하여 커버슬립으로 장착합니다.
알림: 나머지 샘플은 실온에서 건조제와 함께 보관해야 합니다. - 형광 현미경으로 절편을 검사하고 사진을 찍고 앞서 설명한 방법에 따라 미네랄 전치율(MAR) 및 골형성률(BFR/BS)을 계산합니다30.
- 칼세인 및 알리자린 레드 제제: 칼세인을 2% NaHCO3 용액에 1mg/mL로 용해시키고 알리자린 레드 S를H2O에서 2mg/mL로 용해시킵니다.
- 면역형광(Immunofluorescence)
- 적절한 파라핀 섹션을 선택하고 65°C에서 30분 동안 굽습니다.
- 왁스 제거: 섹션을 크실렌에 5분 동안 담그고 매번 새 크실렌으로 두 번 반복합니다.
- 수분 보충: 섹션을 95% 에탄올, 75% 에탄올, 50% 에탄올 및 ddH2O에 각각 5분 동안 순차적으로 담그십시오.
- 1 x PBS로 2 x 5분 동안 섹션을 부드럽게 세척합니다.
- 항원 회수: ddH2O에 Tris-HCl(0.05M, pH 8.0), EDTA(0.01M, pH 8.0) 및 프로테아제 K(10μg/mL)의 혼합물에 절편을 담그고 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 1 x PBS로 3 x 5분 동안 섹션을 부드럽게 세척합니다.
- 블록: 섹션에서 여분의 유체를 제거하고 소수성 마커를 사용하여 대상 영역 주위에 원을 그립니다. 비특이적 결합을 차단하려면 10% 소 혈청 알부민이 함유된 차단 완충액으로 덮고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
알림: 결과에 영향을 미치지 않도록 섹션을 너무 오래 건조시키지 않도록 주의하십시오. - 1차 항체 배양: 항-오스테오폰틴(OPN) 항체를 항체 희석액으로 권장 농도로 희석하고 각 샘플에 30-50μL를 첨가합니다. 가습 챔버에서 4 °C에서 밤새 배양합니다.
알림: 챔버에 약간의 물을 남겨두고 항체액이 증발하는 것을 방지하기 위해 뚜껑을 덮으십시오. - 1 x PBS로 3 x 10분 동안 섹션을 부드럽게 세척합니다.
알림: 7.2.2.10-7.2.2.12단계는 어두운 곳에서 수행해야 합니다. - 형광 2차 항체 배양: 1차 항체에 해당하는 적절한 형광 2차 항체를 선택하여 권장 농도로 희석합니다. 각 샘플에 30-50 μL를 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양합니다.
- 1 x PBS로 2 x 10분 동안 섹션을 부드럽게 세척합니다.
- 4'6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)이 있는 변색 방지 장착 매체를 사용하여 시편을 장착합니다. 섹션을 어두운 곳에 보관하고 가능한 한 빨리 사진을 찍으십시오.
- 디지털 카메라를 통합한 형광 현미경 검사를 수행하여 절편을 검사 및 촬영하고 관심 영역(ROI)에서 양성 세포를 계산합니다.
- 칼세인(Calcein)과 알리자린(alizarin) 레드 이중 라벨링 및 분석
- 골쇄골 형성 분석
- 주석산염 저항성 산성 인산가수분해효소(TRAP) 염색
- 적절한 파라핀 섹션을 선택하십시오. 7.2.2.1-7.2.2.3 단계에 따라 왁스를 제거하고 수분을 보충하십시오.
- 제조업체의 지침에 따라 TRAP 염색 키트를 사용하여 신선한 염색 용액을 준비하고 37°C로 예열합니다.
- 각 샘플에 30-50 μL의 염색 용액을 추가하고 37 °C에서 가습 챔버에서 20-30 분 동안 배양합니다. 광학 현미경으로 빨간색 다핵 파골세포가 보일 때까지 5분마다 확인합니다. ddH2O로 반응을 중단하십시오.
- 헤마톡실린 용액에 30초 동안 카운터 스테인하고 안정적인 파란색을 위해 1% 암모니아 용액에 1분 동안 담그십시오. 천천히 흐르는 수돗물로 헹굽니다.
- 중성 발삼을 사용하여 커버 슬립으로 섹션을 장착하고 밤새 말리십시오.
- 현미경으로 사진을 캡처하고 이전 프로토콜30에 따라 3개 이상의 핵을 가진 TRAP 양성 세포의 수를 계산합니다.
- 면역형광: 면역형광을 위한 권장 농도의 카텝신 K(CTSK) 항체를 사용하고 위의 섹션 7에 설명된 프로토콜을 따릅니다.
- 주석산염 저항성 산성 인산가수분해효소(TRAP) 염색
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Representative Results
이 프로토콜을 사용하여 유도 가능한 조골세포 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스(Stat3Col1α2ERT2) 모델을 구축하여 교정 힘에 의한 폐포골 리모델링에 대한 STAT3 결실의 효과를 조사했습니다(그림 1A,B). 조골세포에서의 STAT3 결실은 폐포골의 면역형광 염색에 의해 확인되었습니다(그림 1C).
입체 현미경은 WT 마우스의 OTM 거리가 d4, d7 및 d10에서 증가했음을 나타냈습니다. 그러나 Stat3Col1α2ERT2 마우스에서는 OTM 거리가 감소했습니다(그림 2B). 이 현상은 d10에 대한 Micro-CT 분석에서도 확인되었으며, 이는 조골세포 Stat3 결실이 OTM을 감속시킨다는 것을 나타냅니다(그림 2C).
조직학적 분석을 위해 상악골의 횡단면에서 M1의 3개 뿌리 내에 위치한 영역을 ROI로 정의하여 치조골 리모델링의 전반적인 상황을 보여줍니다(그림 3A). 헤마톡실린-에오신 염색 및 OPN 면역형광 염색은 ROI의 전체 치조골을 보여주었습니다(그림 3B,C).
골형성 분석의 경우, alizarin red 및 calcein 표지는 교정력이 WT 마우스에서 치조골의 미네랄 배치율(MAR)을 증가시켰지만 Stat3Col1α2ERT2 마우스의 OTM 그룹에서 MAR은 WT 마우스에 비해 감소했음을 나타냈습니다(그림 4A). 또한, 면역형광 염색을 통해 교정력 하에서 OPN+ 조골세포의 수가 증가했지만, Stat3Col1α2ERT2 마우스의 OTM 그룹에서 OPN+ 조골세포가 WT 마우스보다 적었다는 것을 보여주었습니다(그림 4B). 골쇄골 분석의 경우, TRAP 염색은 교정력 하에서 WT 마우스에서 파골세포의 수가 증가했지만, Stat3Col1α2ERT2 마우스의 OTM 그룹에서 WT 마우스보다 파골세포가 더 적었다는 것을 나타냈습니다(그림 4C). 이 현상은 CTSK의 면역형광 염색에 의해서도 확인되었습니다(그림 4D). 그 결과, 조골세포성 Stat3 결핍은 치아 운동 중 교정력과 손상된 뼈 리모델링에 대한 반응으로 조골세포와 파골세포의 활성을 감소시킨다는 것을 보여주었습니다.
그림 1: 유도성 조골세포 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스 모델 생성의 그림. (A) 타목시펜에 의해 유도된 Col1α2 발현 조골세포의 Stat3 knockout의 개략도(왼쪽). 실험 계획: 6주령 수컷 야생형 및 Stat3Col1ERT2 마우스에 OTM 모델 구축 일주일부터 2일마다 TA(100mg·kg-1·bw)를 투여하고 OTM 후 d4, d7, d10 분석을 위해 희생시켰다(오른쪽). (B) 유도성 조골세포 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스의 교잡 진행. (C) OTM 후 d10에서 WT 및 Stat3Col1ERT2 마우스의 폐포골에서 STAT3 및 OPN의 이중 면역형광 염색 및 비 OTM 측면 및 OTM 측면에서 이중 양성 세포의 정량화. n = 5; 스케일 바 = 50 μm. 이 그림은 Gong et al. 26에서 발췌한 것입니다. 약어: STAT3 = 전사 3의 신호 변환기 및 활성제; Col1α = 콜라겐 1-알파; TA = 타목시펜; WT = 와일드 타입; OTM = 치아 교정 운동; OPN = 오스테오폰틴; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Stat3의 조골세포 결핍으로 인한 치아 교정 움직임 감속 (A) 생체 내 OTM 모델의 개략도. 스프링은 앞니와 제1대구치(M1) 사이에 결찰되어 교정력을 유도하여 M1을 근심 융기 쪽으로 이동시켰습니다. (B) WT 마우스 및 Stat3Col1α2ERT2 마우스에서 OTM 후 d0, d4, d7 및 d10의 OTM 거리. (C) micro-CT에 의한 OTM 후 d10의 WT 및 Stat3Col1α2ERT2 마우스에서 비 OTM 측면 및 OTM 측면의 대표 이미지. n = 5입니다. 스케일 바 = 1mm(B), 500μm(C). 이 그림은 Gong et al.26에서 발췌한 것입니다. 약어: STAT3 = 전사 3의 신호 변환기 및 활성제; Col1α = 콜라겐 1-알파; WT = 와일드 타입; OTM = 치아 교정 운동; SAG = 시상면. 점선 곡선은 OTM 거리를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 관심 영역 그림. (A) ROI 영역의 개략도. 상악골 단면에서 M1의 3개 근 내에 위치한 점선 영역을 ROI로 선택했습니다. M1의 세 가지 뿌리에는 mesiobuccal 뿌리, distobuccal 뿌리 및 구개 뿌리가 포함됩니다. (B) 마우스에서 M1의 전체 치조골의 HE 염색. (C) 마우스에서 M1의 전체 폐포골에서 OPN의 면역형광 염색. 스케일 바 = 200 μm(B), 100 μm(C). 이 그림은 Gong et al.26에서 발췌한 것입니다. 약어: ROI = 관심 영역; MB = mesiobuccal root; DB = 원위근; P = 구개근; HE = 헤마톡실린-에오신; OPN = 오스테오폰틴; PDL = 치주 인대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: Stat3의 조골세포 결핍은 교정력에 의한 뼈 형성 및 흡수를 손상시켰습니다 . (A) OTM 중 WT 및 Stat3Col1α2ERT2 마우스에서 칼세인 및 알리자린 레드 S에 의한 순차적 형광 색소 표지 및 미네랄 전립율 정량화. n = 5입니다. (B) WT 및 Stat3Col1α2ERT2 마우스에서 OTM 후 d10의 폐포골에서 OPN+ 세포의 면역형광 염색 및 정량화. n = 5입니다. (C) WT 및 Stat3Col1α2ERT2 마우스에서 OTM 후 d4의 폐포골에서 TRAP 양성 세포의 TRAP 염색 및 정량화. n = 5입니다. (D) WT 및 Stat3Col1α2ERT2 마우스에서 OTM 후 d4의 폐포골에서 CTSK+ 세포의 면역형광 염색 및 정량화. n = 5입니다. 스케일 바 = 10 μm (A), 50 μm (B-D). 이 그림은 Gong et al.26에서 발췌한 것입니다. 약어: STAT3 = 전사 3의 신호 변환기 및 활성제; Col1α = 콜라겐 1-알파; WT = 와일드 타입; OTM = 치아 교정 운동; OPN = 오스테오폰틴; DAPI = 4', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌; TRAP = 주석산염 내성 산성 인산가수분해효소; MAR = 광물 투입율; CTSK = 카텝신 K. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
부정교합은 호흡, 저작, 말하기, 심지어 외모를 손상시키는 가장 흔한 구강 장애 중 하나이기 때문에 이전 역학 조사에 따르면 발생률이 70%에서 93%로 증가하는 등 교정에 대한 수요가 나날이 증가하고 있습니다31,32. 치열 교정 치료의 효율성을 안전하게 높이기 위해 치조골 리모델링을 가속화하는 방법은 이 분야에서 뜨거운 주제가 되었습니다. 따라서 OTM에 의한 치조골 리모델링의 기전을 명확히 할 필요가 있다. 이전 연구에서 연구자들은 생체 내 약물 주입을 사용하여 동물 모델21,33에서 OTM의 메커니즘을 연구했는데, 이는 간단하고 쉬웠지만 다른 시스템의 세포에 대한 약물의 영향을 배제하기는 어려웠습니다. 따라서 생체 내 교정력에 의한 뼈 재형성의 기전을 연구하는 것이 매우 필요합니다.
최근 몇 년 동안, 유전자 녹아웃 마우스가 널리 사용되어, 유전자 기능의 연구 및 치료 표적의 탐색을 위한 견고한 기초를 제공하였다34. 이러한 기술 중 전체 유전자 녹아웃 기술이 가장 초기의 접근 방식이었습니다. Adrb2-/- 아드레날린 수용체(Adrb2) 녹아웃 마우스 모델은 OTM35 동안 폐포 뼈 리모델링에서 교감신경계의 역할을 탐구하는 데 사용되었습니다. 그러나 전체 유전자 녹아웃 마우스는 경우에 따라 배아 치사율을 초래하여 유전자 기능 연구를 방해할 수 있습니다. 따라서 특정 세포 유형의 유전자를 표적으로 하는 조건부 녹아웃 마우스가 개발되었습니다. 그러나 치조골 리모델링과 관련된 연구는 시간에 민감한 경우가 많기 때문에 모델링 후 특정 시점에서 치조골의 변화를 관찰할 필요가 있습니다.
유도 가능한 조건부 유전자 knockout 마우스는 DNA 재조합 및 조직 특이성의 시간적 및 공간적 제어라는 두 가지 이점을 가지고 있으며, 유전자 knockout은 약물 또는 호르몬의 적용을 통해 특정 시점과 특정 조직에서 달성될 수 있어 연구 요구를 더 잘 충족할 수 있습니다. 또한 STAT3는 뼈 및 기타 조직에서 널리 발현되는 전사 인자이며 세포 증식, 분화, 세포 사멸, 면역 및 기타 중요한 기능을 조절하는 기능을 가지고 있습니다25. 이전에 비유도 조골세포 특이적 Stat3 knockout 마우스의 골밀도가 감소했다고 보고한 바 있는데28 이는 non-induced conditional Stat3 knockout 마우스가 발달의 영향을 배제해야 하는 폐포골 리모델링의 기계론적 연구에 적합하지 않다는 것을 시사한다.
따라서 본 연구에서는 시간과 공간에 따라 제어가 가능하고 치조골 리모델링 기전 연구에 더 적합할 뿐만 아니라 혈통 추적과 결합된 특정 세포 및 유전자의 기능에 대한 추가 연구가 가능한 Cre/loxP 시스템을 기반으로 유도 조건부 유전자 knockout 기술을 사용하여 타목시펜 유도 조골세포 특이적 Stat3 유전자 knockout 마우스인 Stat3Col1α2ERT2를 생성했습니다. 타목시펜 유도 이전에는 Stat3Col1α2ERT2와 야생형 마우스 사이에 뚜렷한 차이가 없었고 번식에 특별한 것이 없었습니다. 우리는 이전에 Col1α2+ 조골세포에서 Stat3의 유도성 결실이 성체 마우스에서 뼈 형성을 손상시키고 골량을 감소시킨다는 것을 발견했다28. 본 연구에서 비OTM 그룹에서 Stat3Col1α2ERT2 마우스의 골대사 수준이 감소하여 이전 결과와 일치했다. 또한, OTM 그룹의 뼈 대사 수준이 교정력에 반응하여 더 현저하게 감소함에 따라, Stat3는 기계적 힘에 의한 뼈 대사 조절에 중요한 역할을 했다고 볼 수 있습니다. 우리는 Stat3에 의해 조절되는 뼈 리모델링의 메커니즘을 더 탐구했습니다. 그 결과, Stat3는 조골세포 분화를 직접 촉진할 수 있으며,28,29 Mmp3 전사의 조절을 통해 조골세포와 파골세포 사이의 누화를 조절함으로써 파골세포 분화에 영향을 미친다는 것을 나타냈다 29.
이 프로토콜에서는 쥐의 상악골 단면에서 M1의 3개 뿌리 내에 위치한 영역을 치조골 리모델링을 평가하기 위한 ROI로 선택했습니다. 이 영역에서 치조골의 분석은 다른 측면의 특성을 분석하는 전통적인 방법보다 골형성과 골쇄골형성의 활성을 동일한 영역에서 분석하는 긴 뼈의 분석에 더 가깝습니다. 또한 고전적인 가설에 따르면 반대 효과를 가진 두 가지 약물을 각각 압력과 장력 측면에 적용하여 치아 이동 속도를 가속화해야 합니다. 이 방법은 이러한 병목 현상을 극복하기 위한 이론적 기반을 제공했습니다. 이 OTM 모델에서는 동력계를 사용하여 교정력의 크기를 측정했습니다. 그러나 힘은 첫 번째 어금니와 앞니 사이의 거리가 감소함에 따라 약간 감쇠됩니다. 따라서 보다 일정하고 안정적인 교정력을 생성하기 위해 표준화된 기계 시스템을 구축할 필요가 있습니다.
프로토콜 내에는 염두에 두어야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, OTM 모델 구성 과정에서 제1대구치와 앞니는 탈착에 의한 힘 적용의 실패를 방지하기 위해 단단히 결찰되어야 합니다. 둘째, 힘의 방향에 주의를 기울여야 하며, 수직력의 적용으로 인한 발치를 방지하기 위해 첫 번째 어금니에 수평력을 가해야 합니다. 마지막으로, 임베딩할 때 목표 단면에 따라 시편의 방향을 결정해야 하며, 이상적인 단면을 얻기 위해 방향을 조정하기 위해 단면을 적시에 관찰해야 합니다.
결론적으로, 우리는 서로 다른 시점에서 폐포골 리모델링을 보여주는 OTM의 유도 가능하고 특이적인 유전자 녹아웃 마우스 모델에 대한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 이것을 혈통 추적과 결합된 특정 세포 및 유전자의 기능을 연구하는 데 추가로 사용할 것입니다. 그런 다음 OTM 메커니즘 연구 분야에서 생체 내 동적 및 세포 특이적 패턴을 설정하여 클리닉에서 교정에 대한 증거를 제공합니다. 또한, 본 연구는 조골세포와 파골세포를 자극하여 신속한 골 리모델링을 가능하게 하는 OTM 모델 구축을 위한 상세한 프로토콜을 제공하고, 기계적 힘에 반응하는 골 리모델링 연구에 이상적인 모델을 제공한다. 그 외에도 골격 기계 생물학 연구를 위한 새로운 전략을 제공하기 위해 OTM 중 치조골 리모델링을 분석하는 방법을 설명합니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 상하이 자연과학재단(21ZR1436900, 22ZR1436700); 상하이 학술/기술 연구 리더 프로그램(20XD1422300); SHDC의 임상 연구 계획(SHDC2020CR4084); 상하이 자오퉁 대학교 의과대학 상하이 제9인민병원의 학제간 연구 기금(JYJC201902, JYJC202116); 상하이 고급 지역 대학의 혁신 연구팀(SSMUZLCX20180501); 연구 규율 기금 no. KQYJXK2020 상하이 자오퉁 대학교 의과대학 제9인민병원, 상하이 자오퉁 대학교 구강학 대학 출신; 상하이 제9인민병원, 상하이 자오퉁 대학교 의과대학(JYYC003)의 독창적인 탐사 프로젝트; Shanghai Jiao Tong University School of Medicine의 200명의 인재 프로젝트; 생체 재료 및 재생 의학 연구소 협력 연구 프로젝트, 상하이 자오퉁 대학교 의과대학(2022LHB02); 상하이 자오퉁 대학교 의과대학 상하이 제9인민병원 바이오뱅크 프로젝트(YBKB201909, YBKB202216).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P1020 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1101 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Anti-CTSK antibody | Santa Cruz | sc-48353 | |
| Anti-OPN antibody | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | AF808 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Closed-coil springs | Innovative Material and Devices, Shanghai, China | CS1006B | |
| Col1α2CreERT2 mice | A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. | ||
| Dexmedetomidine hydrochloride | Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site | ||
| EDTA | Beyotime Biotechanology | ST069 | |
| Embedding tanks | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 80106-1100-16 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092183 | |
| ImageJ software | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| Mounting medium with DAPI | Beyotime Biotechanology | P0131 | |
| Mouse dissection platform | Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. | HK105 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| Primers for genotyping | Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC | ||
| Protease K | Sigma-Aldrich | 539480 | |
| Self-curing restorative resin | 3M ESPE, St. Paul, MN, USA | 712-035 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Tris-HCl | Beyotime Biotechanology | ST780 | |
| Universal tissue fixative | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1105 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 | |
| Zoletil | VIRBAC |
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