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Uso de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível para estudar a remodelação óssea alveolar durante a movimentação ortodôntica

Published: July 21, 2023 doi: 10.3791/65613
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, *6, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 2,3,4,5,7, 1,2,3,4,5
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University, 3National Center for Stomatology, 4National Clinical Research Center for Oral Diseases, 5Shanghai Key Laboratory of Stomatology, 6Shanghai Starriver Bilingual School, 7The 2nd Dental Center, Ninth People’s Hospital, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Este estudo fornece um protocolo para o uso de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível para estudar a remodelação óssea sob força ortodôntica e descreve métodos para analisar a remodelação óssea alveolar durante a movimentação ortodôntica, esclarecendo a biologia mecânica esquelética.

Abstract

O osso alveolar, com alta taxa de rotatividade, é o osso que mais ativamente remodela o corpo. A movimentação dentária ortodôntica (MOT) é um processo artificial comum de remodelação óssea alveolar em resposta à força mecânica, mas o mecanismo subjacente permanece indefinido. Estudos anteriores não foram capazes de revelar o mecanismo preciso da remodelação óssea em qualquer tempo e espaço devido a restrições relacionadas ao modelo animal. O transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 (STAT3) é importante no metabolismo ósseo, mas seu papel nos osteoblastos durante a OTM não é claro. Para fornecer evidências in vivo de que o STAT3 participa da OTM em momentos específicos e, em particular, em células durante a OTM, geramos um modelo de camundongo knockout Stat3 específico para linhagem osteoblástica induzível por tamoxifeno, aplicamos força ortodôntica e analisamos o fenótipo do osso alveolar.

Microtomografia computadorizada (Micro-CT) e microscopia estéreo foram utilizadas para acessar a distância OTM. A análise histológica selecionou a área localizada dentro das três raízes do primeiro molar (M1) na secção transversal do osso maxilar como a região de interesse (ROI) para avaliar a atividade metabólica de osteoblastos e osteoclastos, indicando o efeito da força ortodôntica sobre o osso alveolar. Em suma, apresentamos um protocolo para o uso de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível para estudar a remodelação óssea sob força ortodôntica e descrever métodos para analisar a remodelação óssea alveolar durante a OTM, lançando assim uma nova luz sobre a biologia mecânica esquelética.

Introduction

Sabe-se que o osso está em constante reconstrução ao longo da vida, em resposta às forças mecânicas de acordo com a lei de Wolff 1,2. A estimulação mecânica adequada, como a gravidade e o exercício diário, mantém a massa e a força óssea e previne a perda óssea, estimulando tanto os osteoblastos quanto os osteoclastos. Os osteoclastos, responsáveis pela reabsorção óssea3,4,5,6,7, e os osteoblastos, responsáveis pela formação óssea8,9,10, mantêm a homeostase óssea e funcionam conjuntamente no processo biológico de remodelação óssea. Por outro lado, na ausência de estímulos de carga, como em astronautas sob microgravidade de longa duração, os ossos sofrem perda de densidade mineral óssea de 10%, aumentando o risco de osteoporose11,12. Além disso, terapias mecânicas não invasivas e convenientes, incluindo a ortodontia e a osteogênese por distração, têm surgido como tratamentos para doenças ósseas13,14. Tudo isso tem mostrado que a força mecânica desempenha um papel crítico na manutenção da qualidade e quantidade óssea. Estudos recentes geralmente analisaram a remodelação óssea em resposta à carga mecânica utilizando modelos demorados, como testes de suspensão de roda corrida e de cauda, que geralmente levavam 4 semanas ou mais para simular carga ou descarga de força15,16. Portanto, há demanda por um modelo animal conveniente e eficiente para o estudo da remodelação óssea impulsionada pela carga de força.

O osso alveolar é o mais ativo em termos de remodelação óssea, com alta taxa de turnover17. A movimentação dentária ortodôntica (MOT), um tratamento comum para más oclusões, é um processo artificial de remodelação óssea alveolar em resposta à força mecânica. No entanto, o OTM, que induz rápida remodelaçãoóssea18, também é uma maneira de economizar tempo para estudar os efeitos da força mecânica na remodelação óssea em comparação com outros modelos com um longo período experimental. Portanto, o OTM é um modelo ideal para estudar a remodelação óssea sob estímulos mecânicos. Vale ressaltar que o mecanismo de remodelação óssea alveolar muitas vezes é sensível ao tempo, sendo necessário observar as mudanças na remodelação óssea alveolar em determinados momentos após a modelagem. Com as vantagens duplas do controle temporal e espacial da recombinação de DNA e da especificidade tecidual, um modelo de camundongo knockout de gene condicional induzível é uma escolha adequada para estudos de OTM.

Convencionalmente, a remodelação óssea alveolar mediada por OTM tem sido dividida em zonas de tensão envolvendo a formação óssea e zonas de pressão envolvendo a reabsorção óssea 19,20,21, que é mais detalhada, mas de difícil regulação. Além disso, Yuri e col. relataram que o tempo de formação óssea no OTM diferiu nos lados de tensão e compressão22. Além disso, um estudo anterior havia demonstrado que o primeiro molar poderia iniciar uma ampla remodelação do osso alveolar superior sob força ortodôntica, que não estava restrita às zonas de tensão epressão23. Portanto, selecionamos a área localizada dentro de três raízes de M1 no corte transversal do osso maxilar como a região de interesse (ROI) e descrevemos métodos para avaliar a atividade de osteoblastos e osteoclastos na mesma área para avaliar a remodelação óssea alveolar sob OTM.

Como fator de transcrição nuclear, o transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 (STAT3) tem se mostrado crítico na homeostaseóssea24,25. Estudos prévios relataram baixa densidade mineral óssea e fraturas patológicas recorrentes em camundongos mutantes Stat3 26,27. Nosso estudo prévio demonstrou que a deleção do Stat3 em osteoblastos Osx+ causou malformação craniofacial e osteoporose, bem como fratura óssea espontânea28. Recentemente, fornecemos evidências in vivo com um modelo induzível de camundongo com deleção osteoblasto-específica Stat3 (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, doravante denominado Stat3Col1α2ERT2) que o STAT3 é fundamental na mediação dos efeitos da força ortodôntica que impulsiona a remodelação óssea alveolar29. Neste estudo, apresentamos métodos e protocolos para o uso de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível para estudar a remodelação óssea sob força ortodôntica e descrevemos métodos para analisar a remodelação óssea alveolar durante a OTM, esclarecendo assim a biologia mecânica esquelética.

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Protocol

Todos os métodos envolvendo animais aqui descritos foram aprovados pelo comitê de ética do Shanghai Nono People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (nº 82101048).

1. Estabelecimento de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível

OBS: Camundongos Stat3 fl/fl foram obtidos comercialmente; a cepa Col1α2CreERT2foi um presente (veja a Tabela de Materiais para todos os detalhes). Água e ração padronizada em laboratório e condições ambientais padrão de laboratório (temperatura ambiente de 22 °C a 26 °C e umidade de 50%-55%) foram fornecidas para todos os animais.

  1. Coloque um camundongo macho sexualmente maduro com dois camundongos fêmeas na mesma gaiola. Após 18 dias, verifique se há recém-nascidos todos os dias. Retire todas as ratas grávidas para uma gaiola vazia e mantenha-as sozinhas, se necessário. Coloque camundongos machos em outras gaiolas de reprodução diferentes se as fêmeas não estiverem grávidas dentro de 30 dias.
  2. Gerar Stat3fl/+; Camundongos Col1α2 CreERT2 hibridizando camundongos Stat3 fl/fl com camundongos Col1α2CreERT2; manter todos esses mouses no fundo C57BL/6. Coletar pontas de cauda de 2-5 mm para genotipagem e manter o macho Stat3fl/+; Col1α2CreERT2 camundongos até que estejam sexualmente maduros (F1).
  3. Hibridizar machos de 6 semanas de idade Stat3fl/ +; Col1α2CreERT2 camundongos com fêmeas Stat3 fl/fl. Coletar pontas da cauda de 2-5 mm quando os camundongos tiverem 2 semanas de idade para genotipagem, e manter o macho Stat3 fl/ fl; Col1α2 CreERT2(Stat3Col1α2ERT2) camundongos até que estejam sexualmente maduros (F2).
  4. Hibridizar machos de 6 semanas de idade Stat3 fl/ fl; Col1α2CreERT2 camundongos com fêmeas de Stat3 fl/fl (F3). Coletar pontas de cauda de 2-5 mm quando os camundongos tiverem 2 semanas de idade para genotipagem e usar os camundongos mais jovens do mesmo genótipo para substituir camundongos reprodutores mais velhos quando apropriado (F3+N).
    NOTA: A capacidade reprodutiva dos ratinhos diminui após os 8 meses de idade, pelo que os ratinhos nas gaiolas de reprodução devem ser cuidadosamente monitorizados e substituídos conforme necessário. Além disso, de acordo com os requisitos experimentais, o número de gaiolas de reprodução deve ser adequadamente aumentado para evitar a extinção dos camundongos do gene alvo.

2. Deleção induzível de Stat3 em osteoblastos que expressam Col1α2 pelo tamoxifeno

  1. Dissolva o tamoxifeno em óleo de milho a 20 mg/mL em um tubo de centrífuga e proteja da luz envolvendo papel alumínio. Coloque o tubo centrífugo coberto com folha num misturador rotativo e misture à temperatura ambiente até dissolver completamente.
    NOTA: O tamoxifeno foi obtido comercialmente e armazenado no escuro a 4 °C.
  2. Selecione dez camundongos machos de 6 semanas de idade e divida-os em grupos Stat3 fl/fl e Stat3 Col1α2ERT2 com cinco camundongos em cada grupo. Administrar tamoxifeno (100 mg·kg-1·pc) a cada 2 dias durante 1 semana por injeção intraperitoneal.

3. Modelo de movimentação dentária ortodôntica (MOTO)

  1. Prepare uma plataforma de dissecção plástica esterilizada de camundongos como mesa cirúrgica para imobilizar os camundongos.
    OBS: A mesa de dissecção de camundongos foi obtida comercialmente e consistia de quatro pinos de borracha ajustáveis e uma haste metálica para imobilização dos camundongos. Use instrumentos e ferramentas estéreis durante todo o procedimento.
  2. Fixe um elástico em cada poste de borracha para fixação do membro.
  3. Amarre um elástico entre os dois postes superiores de borracha; amarrar um fio no elástico para prender os incisivos inferiores; e amarre outro fio à haste metálica para segurar os incisivos superiores.
  4. Anestesiar camundongos machos com 7 semanas de idade com 0,1 mL de solução de cloridrato de dexmedetomidina (0,1 mg·kg-1·pc) e zoletil (cloridrato de tiletamina para 20 mg·kg-1·bw e cloridrato de zolazepam para 20 mg·kg-1·bw) dissolvidos em solução salina por injeção intraperitoneal antes da cirurgia. Certifique-se de que os ratos estão sob anestesia adequada durante toda a operação.
    OBS: Fique atento à data de uso efetivo dos medicamentos e não utilize medicamentos vencidos.
  5. Confirme se os ratos estão sob anestesia adequada, apertando os dedos dos pés dos membros posteriores com os dedos.
    NOTA: Se os ratos não responderem ao teste, significa que estão inconscientes e a anestesia atingiu a profundidade desejada. Nesse momento, os ratos estão em um estado de relaxamento muscular dos membros, com respiração suave e frequência cardíaca, e a operação pode ser iniciada.
  6. Use pomada veterinária nos olhos dos ratos para evitar o ressecamento e coloque o camundongo anestesiado na posição supina na mesa de cirurgia. Use quatro faixas elásticas nos postes de borracha para fixar os membros, um fio preso à haste de metal para segurar os incisivos superiores e outro preso a um elástico entre os dois pinos de borracha superiores para prender sobre os incisivos inferiores para manter a mandíbula inferior aberta.
  7. Prepare molas helicoidais fechadas (fio de 0,25 mm, diâmetro de 0,76 mm, comprimento de 1 mm) para aparelhos de força ortodôntica.
    NOTA: Corte oito fios de mola para cada mouse. Quatro roscas de 1 mm de comprimento no meio para o aparelho de força e duas roscas em cada extremidade para ligadura usando fio de ligadura de aço.
  8. Ligate uma extremidade da mola preparada para o primeiro molar superior esquerdo. Ligate a outra extremidade do incisivo central com um fio de ligadura de aço 0,1 mm reforçado por resina restauradora fotopolimerizável após a aplicação de adesivo nos incisivos com a ponta Q para gerar uma força estável de magnitude de 10 g medida com o uso de um dinamômetro.
  9. Depois de completar a operação, coloque os ratos em uma gaiola com outros da mesma cepa em recuperação, ou coloque cada camundongo em uma gaiola vazia sozinho. Certifique-se de que os ratos não sejam deixados sozinhos até que tenham recuperado a consciência suficiente 2-4 h após a operação para manter a decúbito esternal. Nos próximos dias, alimente os ratos com uma dieta suave e observe-os regularmente para garantir que nenhuma complicação ocorra e para verificar o grau de dor pós-cirúrgica; administrar fármacos analgésicos conforme necessário.
    NOTA: Os ratos que foram submetidos a cirurgia não devem ser devolvidos à companhia de outros ratos até estarem totalmente recuperados. Não coloque camundongos pós-cirúrgicos em recuperação com camundongos que não estão anestesiados. Os ratos devem ser mantidos aquecidos durante a recuperação.
  10. Verifique o aparelho ortodôntico todos os dias e exclua qualquer camundongo experimental com deslocamento.

4. Coleta de espécimes

  1. Eutanasiar os camundongos em três momentos diferentes via deslocamento cervical: 4 dias (d4), 7 dias (d7) e 10 dias (d10) após o início da OTM.
  2. Use tesoura oftálmica para cortar a pele verticalmente da região cervical e, em seguida, separar a cabeça do corpo com toda a pele da cabeça dissecada.
  3. Cortar a pele e os músculos bucinadores do ângulo oral bilateral até a região posterior da mandíbula. Desconectar completamente os músculos bucais e os tendões ligados aos coracoides para remover a mandíbula e aparar ossos extras para obter maxilas completas. Em seguida, remova o osso atrás dos terceiros molares bilaterais e retire a mucosa palatina. Por fim, desconecte o aparelho ortodôntico e corte o osso entre os incisivos ao longo da sutura palatina mediana para obter o osso alveolar dos lados direito e esquerdo.
    OBS: Certifique-se de que a região dos incisivos ao terceiro molar seja mantida intacta em ambos os lados.

5. Preparação para secção em parafina

  1. Fixação: Imergir o osso alveolar retirado em paraformaldeído a 4% por 48 h e aparar com tesoura oftálmica no exaustor para os cortes 6 e 7.
  2. Descalcificação: Lavar suavemente os espécimes com 1x PBS por 3 x 10 min. Descalcificar os espécimes em fixador tecidual universal (pH 8,0), substituído por solução fresca a cada 2 dias, por 5 semanas até que os ossos possam ser facilmente penetrados por uma ponta de agulha.
  3. Desidratação: Lavar os espécimes em 1x PBS por 3 x 10 min e, em seguida, mergulhá-los sequencialmente em etanol 95%, etanol 100% e xileno, por 2 x 1 h cada solução.
  4. Imergir os espécimes numa mistura 1:1 de xileno e parafina durante 30 minutos e, em seguida, em parafina a 65 °C durante a noite.
  5. Incorporação: Selecione tanques de incorporação adequados. Coloque o osso alveolar uniformemente com os dentes para cima no mesmo nível. Retire as amostras do tanque de incorporação e transfira-as para um congelador de -20 °C e, em seguida, numere-as quando a parafina estiver totalmente resfriada e sólida.
  6. Usando um micrótomo, corte seções de vinte a quarenta e 4 μm de espessura continuamente no plano transversal e flutue sobre água a 37 °C. Aderir as seções às lâminas do microscópio e assar a 42 °C durante a noite.

6. Medição de distância OTM

  1. Fotografar espécimes de três momentos verticalmente do plano oclusal por microscopia estéreo.
  2. Escanear o osso alveolar com um scanner de Micro-CT. Reconstruir imagens 3D do plano sagital máximo do osso alveolar maxilar, no qual três molares são completamente visíveis, usando o software de suporte do scanner seguindo as instruções do fabricante.
  3. Meça a distância OTM usando o software ImageJ:
    1. Abra o software ImageJ e use a ferramenta Linha reta para criar um segmento de linha de distância conhecida.
    2. Clique em Analisar e escolha Definir Escala para inserir o valor da distância da linha desenhada em Distância conhecida e insira unidades em Unidade de comprimento.
    3. Traçar uma linha entre os pontos médios da crista marginal mesial de M2 e a crista marginal distal de M1 e clicar em Medição. Os resultados mostrados na coluna Comprimento representam a distância OTM.

7. Análise histológica

  1. Seleção da Região de Interesse (ROI): Define o osso alveolar do primeiro molar (M1) como a ROI, localizada exatamente dentro das três raízes de M1 na secção transversal no osso maxilar. Essa região não atinge apenas a cortical do primeiro molar no sentido buco-lingual, mas também se estende até o meio do longo eixo da raiz mesiobucal, incluindo a meia área entre a raiz distobucal e a raiz palatina.
  2. Análise da osteogênese
    1. Dupla marcação e análise de calceína e alizarina vermelha
      1. Preparação de calceína e vermelho de alizarina: Dissolver a calceína em solução de NaHCO3 a 2% para 1 mg/mL e o vermelho de alizarina S em H 2 O a2mg/mL.
        NOTA: Neste estudo, calceína e vermelho de alizarina foram obtidos comercialmente.
      2. Administrar calceína (20 mg·kg-1·pc) no dia 1 e alizarina vermelha S (40 mg·kg-1·pc) no dia 8 por injeção intraperitoneal após o início da OTM. Eutanasiar os camundongos no dia 10 e colher o osso alveolar.
      3. Preparar amostras e incorporá-las seguindo os passos 5.1 e 5.3-5.5. Para mais detalhes, consultar Yang et al.30.
      4. Usando um micrótomo rotativo, corte cortes de 5 μm de espessura continuamente no plano transversal. Adera as seções às lâminas do microscópio e monte com lamínulas usando bálsamo neutro.
        NOTA: O restante das amostras deve ser armazenado com dessecante à temperatura ambiente.
      5. Examinar e fotografar os cortes em microscópio de fluorescência e calcular a taxa de aposição mineral (MAR) e a taxa de formação óssea (BFR/BS) de acordo com o método descrito anteriormente30.
    2. Imunofluorescência
      1. Selecione seções de parafina adequadas e leve ao forno a 65 °C por 30 min.
      2. Desparafinação: Mergulhe as seções em xileno por 5 min e repita duas vezes com xileno fresco de cada vez.
      3. Reidratação: Imergir as seções sequencialmente em etanol 95%, etanol 75%, etanol 50% e ddH2O, cada um por 5 min.
      4. Lave suavemente as seções com 1 x PBS por 2 x 5 min.
      5. Recuperação de antígenos: Imergir os cortes em uma mistura de Tris-HCl (0,05 M, pH 8,0), EDTA (0,01 M, pH 8,0) e protease K (10 μg/mL) em ddH2O e incubar a 37 °C por 15 min.
      6. Lave suavemente as seções com 1 x PBS por 3 x 5 min.
      7. Bloco: Retire o líquido extra das seções e desenhe um círculo ao redor da área alvo usando um marcador hidrofóbico. Para bloquear a ligação inespecífica, cobrir com um tampão de bloqueio contendo 10% de albumina de soro bovino e incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
        NOTA: Tenha cuidado para não secar as seções por muito tempo, para não afetar os resultados.
      8. Incubação primária de anticorpos: Diluir o anticorpo anti-osteopontina (OPN) com diluente de anticorpos na concentração recomendada e adicionar 30-50 μL a cada amostra; incubar a 4 °C durante a noite numa câmara humidificada.
        NOTA: Certifique-se de deixar um pouco de água na câmara e cobri-la para evitar que o fluido de anticorpos evapore.
      9. Lave suavemente as seções com 1 x PBS por 3 x 10 min.
        NOTA: As etapas 7.2.2.10-7.2.2.12 devem ser executadas no escuro.
      10. Incubação de anticorpos secundários fluorescentes: Selecione um anticorpo secundário fluorescente apropriado correspondente ao anticorpo primário e dilua-o na concentração recomendada. Adicionar 30-50 μL a cada amostra e incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
      11. Lave suavemente as seções com 1 x PBS por 2 x 10 min.
      12. Use um meio de montagem antifade com 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para montar os espécimes. Guarde as seções no escuro e fotografe-as o mais rápido possível.
      13. Realizar microscopia de fluorescência incorporando uma câmera digital para examinar e fotografar os cortes e contar células positivas nas regiões de interesse (ROIs).
  3. Análise da osteoclastogênese
    1. Coloração de fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP)
      1. Selecione seções de parafina adequadas. Descerpar e reidratar seguindo os passos 7.2.2.1-7.2.2.3.
      2. Prepare uma solução de coloração fresca utilizando o kit de coloração TRAP de acordo com as instruções do fabricante e pré-aqueça a 37°C.
      3. Adicionar 30-50 μL de solução corante a cada amostra e incubar a 37 °C numa câmara humidificada durante 20-30 min. Verifique a cada 5 min até que osteoclastos multinucleados vermelhos sejam vistos sob um microscópio de luz. Pare a reação com ddH2O.
      4. Contracoloração em solução de hematoxilina por 30 s e imersão em solução de amônia a 1% por 1 min para obter uma cor azul estável. Enxágue em água da torneira de corrente lenta.
      5. Monte as seções com lamínulas usando bálsamo neutro e seque durante a noite.
      6. Capturar fotografias ao microscópio e contar o número de células positivas para TRAP com mais de três núcleos, seguindo nosso protocolo prévio30.
    2. Imunofluorescência: Use o anticorpo catepsina K (CTSK) na concentração recomendada para imunofluorescência e siga o protocolo descrito na seção 7 acima.

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Representative Results

Usando esse protocolo, estabelecemos um modelo induzível de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica (Stat3Col1α2ERT2) para examinar os efeitos da deleção STAT3 na remodelação óssea alveolar dirigida por força ortodôntica (Figura 1A,B). A deleção STAT3 em osteoblastos foi confirmada pela coloração por imunofluorescência do osso alveolar (Figura 1C).

A microscopia estéreo indicou que a distância OTM de camundongos WT aumentou em d4, d7 e d10. Entretanto, em camundongos Stat3 Col1α2ERT2, a distância OTM foi reduzida (Figura 2B). Esse fenômeno também foi confirmado pela análise de Micro-CT em d10, indicando que a deleção osteoblástica Stat3 desacelerou a OTM (Figura 2C).

Para análise histológica, a área localizada dentro das três raízes de M1 no corte transversal no osso maxilar foi definida como ROI, o que mostra a situação geral da remodelação óssea alveolar (Figura 3A). A coloração pela hematoxilina-eosina e pela imunofluorescência do OPN mostrou todo o osso alveolar da ROI (Figura 3B,C).

Para a análise osteogênica, a marcação com vermelho de alizarina e calceína indicou que a força ortodôntica aumentou a taxa de aposição mineral (MAR) do osso alveolar em camundongos WT, mas a MAR no grupo OTM de camundongos Stat3Col1α2ERT2 foi reduzida em comparação com os camundongos WT (Figura 4A). Além disso, a coloração por imunofluorescência demonstrou que o número de osteoblastos OPN+ aumentou sob força ortodôntica, mas houve menos osteoblastos OPN+ no grupo OTM de camundongos Stat3Col1α2ERT2 do que nos camundongos WT (Figura 4B). Para a análise osteoclastogênica, a coloração TRAP indicou que, sob força ortodôntica, o número de osteoclastos aumentou nos camundongos WT, mas houve menos osteoclastos no grupo OTM dos camundongos Stat3Col1α2ERT2 do que nos WT (Figura 4C). Esse fenômeno também foi confirmado pela coloração de imunofluorescência do CTSK (Figura 4D). Esses resultados revelaram que a deficiência osteoblástica de Stat3 reduziu a atividade tanto dos osteoblastos quanto dos osteoclastos em resposta à força ortodôntica e prejudicou a remodelação óssea durante a movimentação dentária.

Figure 1
Figura 1: Ilustração da geração do modelo de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível. (A) Diagrama esquemático do knockout de Stat3 em osteoblastos que expressam Col1α2 induzidos por tamoxifeno (esquerda). O esquema do experimento: camundongos selvagens machos de 6 semanas de idade e Stat3Col1ERT2 receberam TA (100 mg·kg-1·bw) a cada 2 dias a partir de uma semana antes da construção do modelo OTM e sacrificados para análise em d4, d7 e d10 após OTM (direita). (B) Progresso da hibridização de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível. (C) Dupla imunofluorescência de STAT3 e OPN no osso alveolar de camundongos WT e Stat3Col1ERT2 em d10 após OTM e quantificação de células duplo-positivas em lados não-OTM e lados OTM. n = 5; barras de escala = 50 μm. Este número é de Gong et al.26. Abreviações: STAT3 = transdutor de sinal e ativador da transcrição 3; Col1α = colágeno 1-alfa; AT = tamoxifeno; WT = tipo selvagem; OTM = movimentação dentária ortodôntica; OPN = osteopontina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Deficiência osteoblástica do Stat3 desacelerou a movimentação ortodôntica (A) O diagrama esquemático do modelo OTM in vivo. A mola ligava-se entre os incisivos e o primeiro molar (M1) e induzia a força ortodôntica a deslocar M1 em direção ao rebordo mesial. (B) A distância OTM de d0, d4, d7 e d10 após OTM em camundongos WT e Stat3Col1α2ERT2 . (C) Imagens representativas dos lados não-OTM e lados OTM em camundongos WT e Stat3Col1α2ERT2 em d10 após OTM por micro-CT. n = 5. Barras de escala = 1 mm (B), 500 μm (C). Esse dado é de Gong et al.26. Abreviações: STAT3 = transdutor de sinal e ativador da transcrição 3; Col1α = colágeno 1-alfa; WT = tipo selvagem; OTM = movimentação dentária ortodôntica; SAG = plano sagital. Curvas tracejadas indicam a distância OTM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Ilustração das regiões de interesse. (A) Diagrama esquemático das regiões de ROIs. A área pontilhada localizada dentro de três raízes de M1 na secção transversal das maxilas foi selecionada como ROI. As três raízes de M1 incluem a raiz mesiobucal, a raiz distobucal e a raiz palatina. (B) Coloração HE de todo o osso alveolar de M1 em camundongos. (C) Coloração por imunofluorescência do OPN em todo o osso alveolar de M1 em camundongos. Barras de escala = 200 μm (B), 100 μm (C). Esse dado é de Gong et al.26. Abreviações: ROIs = regiões de interesse; MB = raiz mesiobucal; DB = raiz distobucal; P = raiz palatina; HE = hematoxilina-eosina; OPN = osteopontina; PDL = ligamento periodontal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: A deficiência osteoblástica do Stat3 prejudicou a formação e reabsorção óssea induzida pela força ortodôntica. (A) Marcação sequencial de fluorocromo por calceína e vermelho de alizarina S em camundongos WT e Stat3Col1α2ERT2 durante OTM e quantificação das taxas de aposição mineral. n = 5. (B) Coloração por imunofluorescência e quantificação de células OPN+ no osso alveolar em d10 após OTM em camundongos WT e Stat3Col1α2ERT2. n = 5. (C) Coloração com TRAP e quantificação de células positivas para TRAP em osso alveolar em d4 após OTM em camundongos WT e Stat3Col1α2ERT2. n = 5. (D) Coloração por imunofluorescência e quantificação de células CTSK+ no osso alveolar em d4 após OTM em camundongos WT e Stat3Col1α2ERT2. n = 5. Barras de escala = 10 μm (A), 50 μm (B-D). Esse dado é de Gong et al.26. Abreviações: STAT3 = transdutor de sinal e ativador da transcrição 3; Col1α = colágeno 1-alfa; WT = tipo selvagem; OTM = movimentação dentária ortodôntica; OPN = osteopontina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TRAP = fosfatase ácida resistente ao tartarato; MAR = taxas de aposição mineral; CTSK = catepsina K. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Como a má oclusão está entre os distúrbios bucais mais comuns, prejudicando a respiração, a mastigação, a fala e até mesmo a aparência, a demanda por ortodontia vem aumentando a cada dia, com a incidência subindo de 70% para 93%, segundo levantamento epidemiológicoprévio31,32. Como acelerar a remodelação óssea alveolar para aumentar a eficiência do tratamento ortodôntico com segurança tornou-se um tópico quente nessa área; portanto, é necessário esclarecer o mecanismo de remodelação óssea alveolar impulsionada pela OTM. Em estudos anteriores, pesquisadores utilizaram a injeção in vivo de fármacos para estudar o mecanismo da OTM em modelos animais21,33, o que foi simples e fácil, mas foi difícil descartar a influência dos fármacos nas células de outros sistemas. Portanto, é altamente necessário estudar o mecanismo de remodelação óssea sob força ortodôntica in vivo.

Nos últimos anos, camundongos knockout gênicos têm sido amplamente utilizados, fornecendo uma base sólida para o estudo da função gênica e a exploração de alvos terapêuticos34. Dentre essas técnicas, a tecnologia de nocaute genético foi a abordagem mais precoce. O modelo knockout do receptor adrb2-/- adrenérgico (Adrb2) foi utilizado para explorar o papel do sistema nervoso simpático na remodelação óssea alveolar durante a OTM35. No entanto, camundongos nocautes genéticos totais podem resultar em letalidade embrionária em alguns casos, dificultando o estudo da função gênica. Portanto, camundongos knockout condicionais foram desenvolvidos, visando um gene em tipos celulares específicos. No entanto, como as pesquisas relacionadas à remodelação óssea alveolar são muitas vezes sensíveis ao tempo, é necessário, portanto, observar as alterações no osso alveolar em momentos específicos após a modelagem.

Camundongos knockout gênicos condicionais induzíveis têm as vantagens duplas de controle temporal e espacial da recombinação de DNA e especificidade tecidual, e o knockout gênico pode ser alcançado em momentos específicos e tecidos específicos por meio da aplicação de drogas ou hormônios, que podem melhor atender às necessidades de pesquisa. Além disso, o STAT3 é um fator de transcrição amplamente expresso no osso e em outros tecidos e tem a função de regular a proliferação celular, diferenciação, apoptose, funções imunológicas e outras importantes25. Relatamos anteriormente que a densidade mineral óssea de camundongos knockout Stat3 osteoblasto-específicos não induzidos foi reduzida28, sugerindo que camundongos knockout condicionais Stat3 não induzidos não são adequados para o estudo mecanístico da remodelação óssea alveolar, o que precisa excluir a influência do desenvolvimento.

Portanto, neste estudo, geramos camundongos knockout para o gene Stat3 osteoblasto-específico induzível por tamoxifeno, Stat3Col1α2ERT2, empregando tecnologia induzível de knockout de gene condicional baseada no sistema Cre/loxP, que é controlável no tempo e no espaço e mais adequada para o estudo do mecanismo de remodelação óssea alveolar, além de permitir um estudo mais aprofundado da função de células e genes específicos combinados com o traçado de linhagem. Antes da indução do tamoxifeno, não havia diferença óbvia entre Stat3Col1α2ERT2 e camundongos selvagens e nada de especial na reprodução. Observamos anteriormente que a deleção induzível de Stat3 em osteoblastos de Col1α2+ prejudicou a formação óssea e reduziu a massa óssea em camundongos adultos28. Neste estudo, o nível de metabolismo ósseo de camundongos Stat3Col1α2ERT2 em grupos não-OTM diminuiu, o que foi consistente com os resultados anteriores. Além disso, como o nível de metabolismo ósseo do grupo OTM diminuiu mais significativamente em resposta à força ortodôntica, pode-se considerar que o Stat3 desempenhou um papel importante na regulação do metabolismo ósseo sob força mecânica. Exploramos ainda mais o mecanismo de remodelação óssea regulado pelo Stat3. Os resultados indicaram que o Stat3 poderia promover diretamente a diferenciação osteoblástica28,29 e afetou a diferenciação osteoclástica por regular o crosstalk entre osteoblastos e osteoclastos através da modulação da transcrição de Mmp329.

Neste protocolo, selecionamos a área localizada dentro de três raízes de M1 no corte transversal no osso maxilar de camundongos como a ROI para avaliar a remodelação óssea alveolar. Com essa área, a análise do osso alveolar está mais próxima da dos ossos longos, em que a atividade da osteogênese e osteoclastogênese são analisadas na mesma região, ao invés do método tradicional de analisar as características dos diferentes lados. Além disso, de acordo com a hipótese clássica, duas drogas com efeitos opostos devem ser aplicadas nos lados de pressão e tensão, respectivamente, para acelerar a taxa de movimentação dentária. Esse método forneceu uma base teórica para a superação desses gargalos. Nesse modelo OTM, a magnitude da força ortodôntica foi mensurada por meio de um dinamômetro. No entanto, a força seria levemente atenuada com a redução da distância entre o primeiro molar e os incisivos. Portanto, é necessário estabelecer um sistema mecânico padronizado para gerar uma força ortodôntica mais constante e estável.

Dentro do protocolo, há algumas etapas críticas que devem ser levadas em consideração. Primeiro, no processo de construção do modelo OTM, o primeiro molar e incisivo devem ser firmemente ligados para evitar a falha na aplicação de força por deslocamento. Em segundo lugar, deve-se prestar atenção à direção da força, e a força horizontal deve ser aplicada ao primeiro molar para evitar a extração dentária causada pela aplicação de força vertical. Finalmente, ao incorporar, a orientação do corpo de prova deve ser determinada de acordo com a seção transversal alvo, e os cortes devem ser observados a tempo de ajustar a orientação para obter cortes ideais.

Em conclusão, nós fornecemos protocolos para um modelo induzível, específico, de camundongos knockout gênicos de OTM, que revela remodelação óssea alveolar em diferentes momentos. Usaremos isso ainda para estudar a função de células e genes específicos combinados com o rastreamento de linhagem. Em seguida, estabelecemos um padrão dinâmico e específico de células in vivo no campo da pesquisa de mecanismos OTM, oferecendo evidências para a ortodontia na clínica. Além disso, este estudo fornece protocolos detalhados para a construção de um modelo OTM, que permite uma rápida remodelação óssea estimulando osteoblastos e osteoclastos e fornece um modelo ideal para o estudo da remodelação óssea em resposta à força mecânica. Mais do que isso, descrevemos métodos de análise da remodelação óssea alveolar durante a OTM para fornecer uma nova estratégia para o estudo da biologia mecânica esquelética.

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado em parte por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); a Fundação de Ciências Naturais de Xangai (21ZR1436900, 22ZR1436700); o Programa de Líder de Pesquisa Acadêmica/Tecnológica de Xangai (20XD1422300); Plano de Pesquisa Clínica da SHDC (SHDC2020CR4084); o Fundo de Pesquisa Interdisciplinar do Hospital do Nono Povo de Xangai, Faculdade de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai (JYJC201902, JYJC202116); a Equipe de Pesquisa em Inovação de Universidades Locais de Alto Nível em Xangai (SSMUZLCX20180501); o Fundo Disciplinar de Pesquisa nº. KQYJXK2020 do Nono Hospital do Povo, da Faculdade de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai e da Faculdade de Estomatologia da Universidade Jiao Tong de Xangai; Projeto de Exploração Original do Hospital do Nono Povo de Xangai, Faculdade de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai (JYYC003); Projeto Duzentos Talentos da Faculdade de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai; o Projeto de Pesquisa Cooperativa do Instituto de Biomateriais e Medicina Regenerativa Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (2022LHB02); o Projeto do Biobanco do Hospital do Nono Povo de Xangai, Faculdade de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai (YBKB201909, YBKB202216).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  P1020
4% paraformaldehyde Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1101
Alizarin red Sigma-Aldrich A5533
Anti-CTSK antibody Santa Cruz sc-48353
Anti-OPN antibody R&D Systems, Minneapolis, MN, USA AF808
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Closed-coil springs Innovative Material and Devices, Shanghai, China CS1006B
Col1α2CreERT2 mice A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences.
Dexmedetomidine hydrochloride Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTA Beyotime Biotechanology ST069
Embedding tanks Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd 80106-1100-16
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 100092183
ImageJ software NIH, Bethesda, MD, USA
Mounting medium with DAPI Beyotime Biotechanology P0131
Mouse dissection platform Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. HK105
Paraffin Sangon biotech Co., Ltd. A601889
Primers for genotyping Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease K Sigma-Aldrich 539480
Self-curing restorative resin 3M ESPE, St. Paul, MN, USA 712-035
Stat3fl/fl mice GemPharmatech Co., Ltd D000527
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648
TRAP staining kit Sigma-Aldrich 387A
Tris-HCl Beyotime Biotechanology ST780
Universal tissue fixative Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1105
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10023418
Zoletil VIRBAC 

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References

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Uso de camundongos <em>knockout Stat3</em> específicos para linhagem osteoblástica induzível para estudar a remodelação óssea alveolar durante a movimentação ortodôntica
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Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong,… More

Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong, X., Yang, Y., Zhu, Y., Xu, H., Jin, A., Huang, X., Gao, X., Lu, T., Liu, J., Wang, X., Dai, Q., Jiang, L. Using Inducible Osteoblastic Lineage-Specific Stat3 Knockout Mice to Study Alveolar Bone Remodeling During Orthodontic Tooth Movement. J. Vis. Exp. (197), e65613, doi:10.3791/65613 (2023).

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