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Uso de ratones knockout Stat3 específicos del linaje osteoblástico inducible para estudiar la remodelación del hueso alveolar durante el movimiento de los dientes de ortodoncia

Published: July 21, 2023 doi: 10.3791/65613
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, *6, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 2,3,4,5,7, 1,2,3,4,5
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University, 3National Center for Stomatology, 4National Clinical Research Center for Oral Diseases, 5Shanghai Key Laboratory of Stomatology, 6Shanghai Starriver Bilingual School, 7The 2nd Dental Center, Ninth People’s Hospital, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Este estudio proporciona un protocolo para el uso de ratones knockout Stat3 específicos del linaje osteoblástico inducible para estudiar la remodelación ósea bajo fuerza ortodóncica y describe métodos para analizar la remodelación ósea alveolar durante el movimiento dental de ortodoncia, arrojando así luz sobre la biología mecánica esquelética.

Abstract

El hueso alveolar, con una alta tasa de recambio, es el hueso que más activamente remodela en el cuerpo. El movimiento dental ortodóncico (OTM) es un proceso artificial común de remodelación ósea alveolar en respuesta a la fuerza mecánica, pero el mecanismo subyacente sigue siendo difícil de alcanzar. Estudios anteriores no han podido revelar el mecanismo preciso de la remodelación ósea en ningún momento y espacio debido a las restricciones relacionadas con los modelos animales. El transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3) es importante en el metabolismo óseo, pero su papel en los osteoblastos durante la OTM no está claro. Para proporcionar evidencia in vivo de que STAT3 participa en OTM en puntos de tiempo específicos y en células particulares durante OTM, generamos un modelo de ratón knockout Stat3 específico del linaje osteoblástico inducible por tamoxifeno, aplicamos fuerza ortodóncica y analizamos el fenotipo óseo alveolar.

Se utilizó microtomografía computarizada (Micro-TC) y microscopía estereoscópica para acceder a la distancia OTM. El análisis histológico seleccionó el área ubicada dentro de tres raíces del primer molar (M1) en la sección transversal del hueso maxilar como la región de interés (ROI) para evaluar la actividad metabólica de osteoblastos y osteoclastos, indicando el efecto de la fuerza ortodóncica sobre el hueso alveolar. En resumen, proporcionamos un protocolo para el uso de ratones knockout Stat3 específicos del linaje osteoblástico inducible para estudiar la remodelación ósea bajo fuerza ortodóncica y describimos métodos para analizar la remodelación ósea alveolar durante la OTM, arrojando así nueva luz sobre la biología mecánica esquelética.

Introduction

Es generalmente conocido que el hueso está en constante reconstrucción a lo largo de la vida, en respuesta a fuerzas mecánicas de acuerdo con la ley de Wolff 1,2. La estimulación mecánica adecuada, como la gravedad y el ejercicio diario, mantiene la masa ósea y la fuerza y previene la pérdida ósea al estimular tanto los osteoblastos como los osteoclastos. Los osteoclastos, responsables de la resorción ósea 3,4,5,6,7, y los osteoblastos, responsables de la formación ósea 8,9,10, mantienen la homeostasis ósea y funcionan conjuntamente en el proceso biológico de remodelación ósea. Por el contrario, en ausencia de estímulos de carga, como en los astronautas sometidos a microgravedad a largo plazo, los huesos sufren una pérdida de densidad mineral ósea del 10%, aumentando así el riesgo de osteoporosis11,12. Además, las terapias mecánicas no invasivas y convenientes, como la ortodoncia y la osteogénesis por distracción, han surgido como tratamientos para las enfermedades óseas13,14. Todo esto ha demostrado que la fuerza mecánica juega un papel fundamental en el mantenimiento de la calidad y cantidad de los huesos. En general, estudios recientes analizaron la remodelación ósea en respuesta a la carga mecánica utilizando modelos que consumen mucho tiempo, como las pruebas de suspensión de la rueda y la cola, que generalmente tardaron 4 semanas o más en simular la carga o descarga forzada15,16. Por lo tanto, existe la demanda de un modelo animal conveniente y eficiente para estudiar la remodelación ósea impulsada por la carga de fuerza.

El hueso alveolar es el más activo en términos de remodelado óseo, con una alta tasa de recambio17. El movimiento dental ortodóncico (OTM), un tratamiento común para la maloclusión, es un proceso artificial de remodelación ósea alveolar en respuesta a la fuerza mecánica. Sin embargo, la OTM, que induce un rápido remodelado óseo18, es también una forma de ahorrar tiempo para estudiar los efectos de la fuerza mecánica sobre el remodelado óseo en comparación con otros modelos con un largo período experimental. Por lo tanto, la OTM es un modelo ideal para estudiar el remodelado óseo bajo estímulos mecánicos. Cabe destacar que el mecanismo de remodelación ósea alveolar suele ser sensible al tiempo, y es necesario observar los cambios en la remodelación ósea alveolar en ciertos momentos después del modelado. Con las ventajas duales del control temporal y espacial de la recombinación del ADN y la especificidad tisular, un modelo de ratón knockout de genes condicionales inducible es una opción adecuada para los estudios de OTM.

Convencionalmente, el remodelado óseo alveolar mediado por OTM se ha dividido en zonas de tensión que involucran la formación ósea y zonas de presión que involucran la resorción ósea 19,20,21, que es más detallada pero difícil de regular. Además, Yuri et al. reportaron que el tiempo de formación ósea en OTM difirió en los lados de tensión y compresión22. Además, un estudio previo había demostrado que el primer molar podía iniciar una amplia remodelación del hueso alveolar maxilar bajo la fuerza ortodóncica, que no estaba constreñida a las zonas de tensión y presión23. Por lo tanto, seleccionamos el área ubicada dentro de tres raíces de M1 en la sección transversal del hueso maxilar como la región de interés (ROI) y describimos métodos para evaluar la actividad de osteoblastos y osteoclastos en la misma área para evaluar el remodelado óseo alveolar bajo OTM.

Como factor de transcripción nuclear, el transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3) ha demostrado ser crítico en la homeostasis ósea24,25. Estudios previos han reportado baja densidad mineral ósea y fracturas patológicas recurrentes en ratones con mutación Stat3 26,27. Nuestro estudio previo demostró que la deleción de Stat3 en osteoblastos Osx+ causaba malformación craneofacial y osteoporosis, así como fractura ósea espontánea28. Recientemente, proporcionamos evidencia in vivo con un modelo de ratón de deleción Stat3 específico de osteoblasto inducible (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, en lo sucesivo denominado Stat3Col1α2ERT2) que STAT3 es fundamental para mediar los efectos de la fuerza ortodóncica que impulsa la remodelación ósea alveolar29. En este estudio, proporcionamos métodos y protocolos para el uso de ratones knockout Stat3 específicos del linaje osteoblástico inducible para estudiar la remodelación ósea bajo fuerza ortodóncica y describimos métodos para analizar la remodelación ósea alveolar durante la OTM, arrojando así luz sobre la biología mecánica esquelética.

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Protocol

Todos los métodos con animales descritos aquí fueron aprobados por el comité de ética del Noveno Hospital Popular de Shanghái, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (n.º 82101048).

1. Establecimiento de ratones knockout Stat3 específicos del linaje osteoblástico inducible

NOTA: Los ratonesStat3 fl/fl se obtuvieron comercialmente; la cepa Col1α2CreERT2fue un regalo (consulte la Tabla de materiales para obtener todos los detalles). Se proporcionaron alimentos y agua en gránulos de laboratorio estandarizados y condiciones ambientales estándar de laboratorio (temperatura ambiente de 22 °C a 26 °C y humedad del 50 % al 55 %) para todos los animales.

  1. Pon un ratón macho sexualmente maduro con dos ratones hembra en la misma jaula. Después de 18 días, revise si hay recién nacidos todos los días. Retira a los ratones hembra preñados a una jaula vacía y mantenlos solos si es necesario. Coloque a los ratones machos en otras jaulas de cría diferentes si las hembras no están preñadas dentro de los 30 días.
  2. Generar Stat3fl/+; ratones Col1α2 CreERT2 mediante la hibridación de ratones Stat3 fl/fl con ratones Col1α2CreERT2; mantener todos estos ratones en el fondo C57BL/6. Recoja las puntas de la cola de 2-5 mm para el genotipado y mantenga el macho Stat3fl/+; Ratones Col1α2CreERT2 hasta que alcanzan la madurez sexual (F1).
  3. Hibridar macho de 6 semanas de edad Stat3fl/ +; Ratones Col1α2CreERT2 con ratones hembra Stat3 fl/fl. Recoja las puntas de la cola de 2-5 mm cuando los ratones tengan 2 semanas de edad para el genotipado, y mantenga el macho Stat3 fl/ fl; Ratones Col1α2 CreERT2(Stat3Col1α2ERT2) hasta que alcanzan la madurez sexual (F2).
  4. Hibridar macho Stat3 de 6 semanas de edad fl/fl; Ratones Col1α2CreERT2 con ratones hembra Stat3 fl/fl (F3). Recoja las puntas de la cola de 2 a 5 mm cuando los ratones tengan 2 semanas de edad para el genotipado, y use los ratones más jóvenes del mismo genotipo para reemplazar a los ratones reproductores más viejos cuando sea apropiado (F3 + N).
    NOTA: La capacidad reproductiva de los ratones disminuye después de los 8 meses de edad, por lo que los ratones en las jaulas de cría deben ser monitoreados cuidadosamente y reemplazados según sea necesario. Además, de acuerdo con los requisitos experimentales, el número de jaulas reproductoras debe aumentarse adecuadamente para evitar la extinción de los ratones genéticamente diana.

2. Deleción inducible de Stat3 en osteoblastos que expresan Col1α2 por tamoxifeno

  1. Disuelva el tamoxifeno en aceite de maíz a 20 mg/ml en un tubo de centrífuga y protéjalo de la luz envolviéndolo en papel de aluminio. Coloque el tubo de centrífuga cubierto con papel de aluminio en una batidora rotativa y mezcle a temperatura ambiente hasta que se disuelva por completo.
    NOTA: El tamoxifeno se obtuvo comercialmente y se almacenó en la oscuridad a 4 °C.
  2. Seleccione diez ratones machos de 6 semanas de edad y divídalos en grupos Stat3 fl/fl y Stat3 Col1α2ERT2 con cinco ratones en cada grupo. Administrar tamoxifeno (100 mg·kg-1·pc) cada 2 días durante 1 semana mediante inyección intraperitoneal.

3. Modelo de movimiento dental de ortodoncia (OTM)

  1. Prepare una plataforma de disección de ratones de plástico esterilizada como mesa de operaciones para inmovilizar a los ratones.
    NOTA: La mesa de disección de ratones se obtuvo comercialmente y consistía en cuatro postes de goma ajustables y una varilla de metal para inmovilizar a los ratones. Utilice instrumentos y herramientas estériles durante todo el procedimiento.
  2. Coloque una banda elástica en cada poste de goma para la fijación de las extremidades.
  3. Ata una banda elástica entre los dos postes de goma superiores; atar un hilo a la banda elástica para sujetar los incisivos inferiores; y ata otro hilo a la varilla de metal para sujetar los incisivos superiores.
  4. Anestesiar ratones machos de 7 semanas de edad con una solución de 0,1 ml de clorhidrato de dexmedetomidina (0,1 mg·kg-1·pc) y zoletil (clorhidrato de tiletamina para 20 mg·kg-1·bw y clorhidrato de zolazepam para 20 mg·kg-1·bw) disueltos en solución salina mediante inyección intraperitoneal antes de la cirugía. Asegúrese de que los ratones estén bajo la anestesia adecuada durante toda la operación.
    NOTA: Preste atención a la fecha de uso efectivo de los medicamentos y no use medicamentos vencidos.
  5. Confirme que los ratones están bajo la anestesia adecuada apretando los dedos de las extremidades traseras con los dedos.
    NOTA: Si los ratones no responden a la prueba, significa que están inconscientes y que la anestesia ha alcanzado la profundidad deseada. En ese momento, los ratones se encuentran en un estado de relajación muscular de las extremidades, con respiración y frecuencia cardíaca suaves, y se puede iniciar la operación.
  6. Use ungüento veterinario en los ojos de los ratones para evitar la sequedad y coloque al ratón anestesiado en posición supina en la mesa de operaciones. Use cuatro bandas elásticas en los postes de goma para fijar las extremidades, un hilo unido a la varilla de metal para sujetar los incisivos superiores y otro unido a una banda elástica entre los dos postes de goma superiores para enganchar sobre los incisivos inferiores para mantener abierta la mandíbula inferior.
  7. Prepare resortes helicoidales cerrados (tamaño de alambre de 0,25 mm, diámetro de 0,76 mm, longitud de 1 mm) para el aparato de fuerza de ortodoncia.
    NOTA: Corta ocho hilos de resorte para cada ratón. Cuatro hilos de 1 mm de longitud en el centro para el dispositivo de fuerza y dos hilos en cada extremo para ligadura con alambre de ligadura de acero.
  8. Ligar un extremo del resorte preparado para el primer molar maxilar izquierdo. Lime el otro extremo del incisivo central con un alambre de ligadura de acero de 0,1 mm reforzado con resina restauradora fotopolimerizable después de aplicar adhesivo a los incisivos con el hisopo para generar una fuerza estable de una magnitud de 10 g medida mediante el uso de un dinamómetro.
  9. Después de completar la operación, coloque a los ratones en una jaula con otros de la misma cepa en recuperación, o coloque a cada ratón solo en una jaula vacía. Asegúrese de que los ratones no se dejen desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente 2-4 h después de la operación para mantener la decúbito esternal. Durante los próximos días, alimente a los ratones con una dieta blanda y obsérvelos regularmente para asegurarse de que no se produzcan complicaciones y determinar el grado de dolor postquirúrgico; Administre medicamentos analgésicos según sea necesario.
    NOTA: Los ratones que se han sometido a cirugía no deben devolverse a la compañía de otros ratones hasta que estén completamente recuperados. No ponga ratones posquirúrgicos en recuperación con ratones que no están anestesiados. Los ratones deben mantenerse calientes durante la recuperación.
  10. Revise el aparato de ortodoncia todos los días y excluya cualquier ratón experimental con desplazamiento.

4. Recogida de muestras

  1. Sacrificar a los ratones en tres momentos diferentes a través de la luxación cervical: 4 días (d4), 7 días (d7) y 10 días (d10) después del inicio de OTM.
  2. Use tijeras oftálmicas para cortar la piel verticalmente de la región cervical y luego separe la cabeza del cuerpo con toda la piel de la cabeza diseccionada.
  3. Cortar la piel y los músculos buccinadores desde el angulus oris bilateral hasta la región posterior de la mandíbula. Desconecte completamente los músculos bucales y los tendones unidos a los coracoides para eliminar la mandíbula y recortar los huesos adicionales para obtener maxilares completos. Luego, retire el hueso detrás de los terceros molares bilaterales y arranque la mucosa palatina. Finalmente, desconecte el aparato de ortodoncia y corte el hueso entre los incisivos a lo largo de la sutura palatina mediana para obtener el hueso alveolar de los lados derecho e izquierdo.
    NOTA: Asegúrese de que la región desde los incisivos hasta el tercer molar se mantenga intacta en ambos lados.

5. Preparación para la sección de parafina

  1. Fijación: Sumergir el hueso alveolar extraído en paraformaldehído al 4% durante 48 h y recortar con tijeras oftálmicas en la campana extractora para las secciones 6 y 7.
  2. Descalcificación: Lave suavemente las muestras con 1x PBS durante 3 x 10 min. Descalcificar las muestras en un fijador tisular universal (pH 8,0), sustituido por una solución fresca cada 2 días, durante 5 semanas hasta que los huesos puedan penetrarse fácilmente con la punta de una aguja.
  3. Deshidratación: Lave las muestras en 1 x PBS durante 3 x 10 min, y luego sumérjalas secuencialmente en etanol al 95%, etanol al 100% y xileno, durante 2 x 1 h cada solución.
  4. Sumerja las muestras en una mezcla 1:1 de xileno y parafina durante 30 minutos y luego en parafina a 65 °C durante la noche.
  5. Incrustación: Seleccione los tanques de incrustación adecuados. Coloque el hueso alveolar uniformemente con los dientes hacia arriba al mismo nivel. Retire las muestras del tanque de inclusión y transfiéralas a un congelador a -20 °C, luego numere cuando la parafina esté completamente enfriada y sólida.
  6. Con un micrótomo, corte de veinte a cuarenta secciones de 4 μm de espesor de forma continua en el plano transversal y flote en agua a 37 °C. Adherir las secciones a portaobjetos de microscopio y hornear a 42 °C durante la noche.

6. Medición de distancia OTM

  1. Fotografiar muestras de tres puntos de tiempo verticalmente desde el plano oclusal mediante microscopía estereoscópica.
  2. Escanee el hueso alveolar con un escáner de microtomografía computarizada. Reconstruya imágenes en 3D del plano sagital máximo del hueso alveolar maxilar, en el que tres molares son completamente visibles, utilizando el software de soporte del escáner siguiendo las instrucciones del fabricante.
  3. Mida la distancia OTM con el software ImageJ:
    1. Abra el software ImageJ y utilice la herramienta Línea recta para crear un segmento de línea de distancia conocida.
    2. Haga clic en Analizar y elija Establecer escala para introducir el valor de la distancia de línea dibujada en Distancia conocida e introducir unidades en Unidad de longitud.
    3. Dibuje una línea entre los puntos medios de la cresta marginal mesial de M2 y la cresta marginal distal de M1 y haga clic en Medición. Los resultados que se muestran en la columna Longitud representan la distancia OTM.

7. Análisis histológico

  1. Selección de la región de interés (ROI): Defina el hueso alveolar del primer molar (M1) como el ROI, ubicado exactamente dentro de tres raíces de M1 en la sección transversal del hueso maxilar. Esta región no solo alcanza el hueso cortical del primer molar en dirección buco-lingual, sino que también se extiende hasta la mitad del eje largo de la raíz mesiobucal, incluyendo la mitad del área entre la raíz distobucal y la raíz palatina.
  2. Análisis de la osteogénesis
    1. Doble marcaje y análisis de calceína y rojo de alizarina
      1. Preparación de calceína y rojo de alizarina: Disolver la calceína en una solución de NaHCO3 al 2% a 1 mg/ml y el rojo de alizarina S enH2O a 2 mg/ml.
        NOTA: En este estudio, la calceína y el rojo de alizarina se obtuvieron comercialmente.
      2. Administrar calceína (20 mg·kg-1·pc) el día 1 y alizarina roja S (40 mg·kg-1·pc) el día 8 mediante inyección intraperitoneal después del inicio de la OTM. Sacrificar a los ratones el día 10 y extraer el hueso alveolar.
      3. Prepare las muestras e insértelas siguiendo los pasos 5.1 y 5.3-5.5. Para más detalles, véase Yang et al.30.
      4. Con un micrótomo giratorio, corte secciones de 5 μm de espesor de forma continua en el plano transversal. Adherir las secciones a portaobjetos de microscopio y montarlas con cubreobjetos utilizando bálsamo neutro.
        NOTA: El resto de las muestras deben almacenarse con desecante a temperatura ambiente.
      5. Examinar y fotografiar las secciones bajo un microscopio de fluorescencia y calcular la tasa de aposición mineral (MAR) y la tasa de formación ósea (BFR/BS) de acuerdo con el método descrito anteriormente30.
    2. Inmunofluorescencia
      1. Seleccione las secciones de parafina adecuadas y hornee a 65 °C durante 30 min.
      2. Desparafinado: Sumerja las secciones en xileno durante 5 minutos y repita dos veces con xileno fresco cada vez.
      3. Rehidratación: Sumerja las secciones secuencialmente en etanol al 95%, etanol al 75%, etanol al 50% y ddH2O, cada una durante 5 min.
      4. Lave suavemente las secciones con 1 x PBS durante 2 x 5 min.
      5. Recuperación de antígenos: Sumergir las secciones en una mezcla de Tris-HCl (0,05 M, pH 8,0), EDTA (0,01 M, pH 8,0) y proteasa K (10 μg/mL) en ddH2O e incubar a 37 °C durante 15 min.
      6. Lave suavemente las secciones con 1 x PBS durante 3 x 5 min.
      7. Bloquear: Elimina el exceso de líquido de las secciones y dibuja un círculo alrededor del área objetivo con un marcador hidrofóbico. Para bloquear la unión inespecífica, cubrir con un tampón de bloqueo que contenga un 10% de albúmina sérica bovina e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
        NOTA: Tenga cuidado de no secar las secciones durante demasiado tiempo, para no afectar los resultados.
      8. Incubación primaria de anticuerpos: diluir el anticuerpo antiosteopontina (OPN) con diluyente de anticuerpos a la concentración recomendada y añadir 30-50 μL a cada muestra; incubar a 4 °C durante la noche en una cámara humidificada.
        NOTA: Asegúrese de dejar un poco de agua en la cámara y cubrirla para evitar que el líquido de anticuerpos se evapore.
      9. Lave suavemente las secciones con 1 x PBS durante 3 x 10 min.
        NOTA: Los pasos 7.2.2.10-7.2.2.12 deben realizarse en la oscuridad.
      10. Incubación de anticuerpos secundarios fluorescentes: seleccione un anticuerpo secundario fluorescente apropiado que corresponda al anticuerpo primario y dilúyalo a la concentración recomendada. Añadir 30-50 μL a cada muestra e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
      11. Lave suavemente las secciones con 1 x PBS durante 2 x 10 min.
      12. Utilice un medio de montaje antidecoloración con 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para montar las muestras. Guarde las secciones en la oscuridad y fotografíelas lo antes posible.
      13. Realizar microscopía de fluorescencia incorporando una cámara digital para examinar y fotografiar las secciones y contar las células positivas en las regiones de interés (ROIs).
  3. Análisis de la osteoclastogénesis
    1. Tinción con fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP)
      1. Seleccione las secciones de parafina adecuadas. Desparafinar y rehidratar siguiendo los pasos 7.2.2.1-7.2.2.3.
      2. Prepare una solución de tinción fresca con el kit de tinción TRAP de acuerdo con las instrucciones del fabricante y precaliente a 37 °C.
      3. Añadir 30-50 μL de solución de tinción a cada muestra e incubar a 37 °C en una cámara humidificada durante 20-30 min. Revise cada 5 minutos hasta que se vean osteoclastos multinucleados rojos bajo un microscopio óptico. Detenga la reacción con ddH2O.
      4. Contratinción en solución de hematoxilina durante 30 s y sumergir en solución de amoníaco al 1% durante 1 min para obtener un color azul estable. Enjuague con agua del grifo a fuego lento.
      5. Monta las secciones con cubreobjetos usando bálsamo neutro y sécalas durante la noche.
      6. Tomar fotografías bajo un microscopio y contar el número de células TRAP-positivas con más de tres núcleos, siguiendo nuestro protocolo anterior30.
    2. Inmunofluorescencia: Utilizar el anticuerpo de catepsina K (CTSK) a la concentración recomendada para la inmunofluorescencia y seguir el protocolo descrito en la sección 7 anterior.

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Representative Results

Utilizando este protocolo, establecimos un modelo de ratón knockout Stat3 específico del linaje osteoblástico inducible (Stat3Col1α2ERT2) para examinar los efectos de la deleción de STAT3 en la remodelación ósea alveolar impulsada por la fuerza ortodóncica (Figura 1A,B). La deleción de STAT3 en osteoblastos se confirmó mediante tinción por inmunofluorescencia del hueso alveolar (Figura 1C).

La microscopía estereoscópica indicó que la distancia OTM de los ratones WT aumentó en d4, d7 y d10. Sin embargo, en los ratones Stat3Col1α2ERT2 , la distancia OTM se redujo (Figura 2B). Este fenómeno también fue confirmado por el análisis de Micro-CT en d10, lo que indica que la deleción osteoblástica de Stat3 desaceleró la OTM (Figura 2C).

Para el análisis histológico, se definió como ROI el área ubicada dentro de tres raíces de M1 en la sección transversal del hueso maxilar, lo que muestra la situación general de remodelado óseo alveolar (Figura 3A). La tinción de hematoxilina-eosina y la tinción inmunofluorescente de OPN mostraron todo el hueso alveolar de ROI (Figura 3B, C).

Para el análisis osteogénico, el rojo de alizarina y el marcaje con calceína indicaron que la fuerza ortodóncica aumentó la tasa de aposición mineral (MAR) del hueso alveolar en ratones WT, pero el MAR en el grupo OTM de ratones Stat3Col1α2ERT2 se redujo en comparación con los ratones WT (Figura 4A). Además, la tinción con inmunofluorescencia demostró que el número de osteoblastos OPN+ aumentó bajo la fuerza ortodóncica, pero hubo menos osteoblastos OPN+ en el grupo OTM de ratones Stat3Col1α2ERT2 que en los ratones WT (Figura 4B). Para el análisis osteoclastogénico, la tinción TRAP indicó que, bajo fuerza ortodóncica, el número de osteoclastos aumentó en los ratones WT, pero hubo menos osteoclastos en el grupo OTM de ratones Stat3Col1α2ERT2 que en los ratones WT (Figura 4C). Este fenómeno también se confirmó mediante la tinción por inmunofluorescencia de CTSK (Figura 4D). Estos resultados revelaron que la deficiencia osteoblástica de Stat3 redujo la actividad tanto de los osteoblastos como de los osteoclastos en respuesta a la fuerza ortodóncica y al deterioro de la remodelación ósea durante el movimiento de los dientes.

Figure 1
Figura 1: Ilustración de la generación de un modelo de ratón knockout Stat3 específico del linaje osteoblástico inducible. (A) Diagrama esquemático del knockout de Stat3 en osteoblastos que expresan Col1α2 inducidos por tamoxifeno (izquierda). El esquema del experimento: a ratones machos de 6 semanas de edad de tipo salvaje y Stat3Col1ERT2 se les administró TA (100 mg·kg-1·bw) cada 2 días desde una semana antes de la construcción del modelo OTM y se sacrificaron para su análisis en d4, d7 y d10 después de OTM (derecha). (B) Progreso de la hibridación de ratones Stat3 knockout específicos del linaje osteoblástico inducible. (C) Tinción de doble inmunofluorescencia de STAT3 y OPN en el hueso alveolar de ratones WT y Stat3Col1ERT2 en d10 después de OTM y la cuantificación de células doblemente positivas en lados no OTM y lados OTM. n = 5; barras de escala = 50 μm. Esta figura es de Gong et al. 26. Abreviaturas: STAT3 = transductor de señal y activador de la transcripción 3; Col1α = colágeno 1-alfa; TA = tamoxifeno; WT = tipo salvaje; OTM = movimiento dental ortodóncico; OPN = osteopontina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Deficiencia osteoblástica de Stat3 desacelerada el movimiento dental de ortodoncia (A) El diagrama esquemático del modelo OTM in vivo. El resorte se ligó entre los incisivos y el primer molar (M1) e indujo la fuerza ortodóncica para mover M1 hacia la cresta mesial. (B) La distancia OTM de d0, d4, d7 y d10 después de OTM en ratones WT y ratones Stat3Col1α2ERT2 . (C) Imágenes representativas de lados no OTM y lados OTM en ratones WT y Stat3Col1α2ERT2 en d10 después de OTM mediante micro-CT. n = 5. Barras de escala = 1 mm (B), 500 μm (C). Esta figura es de Gong et al.26. Abreviaturas: STAT3 = transductor de señal y activador de la transcripción 3; Col1α = colágeno 1-alfa; WT = tipo salvaje; OTM = movimiento dental ortodóncico; SAG = plano sagital. Las curvas discontinuas indican la distancia OTM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Ilustración de las regiones de interés. (A) Diagrama esquemático de las regiones de ROIs. El área punteada ubicada dentro de tres raíces de M1 en la sección transversal de los maxilares se seleccionó como ROI. Las tres raíces de M1 incluyen la raíz mesiobucal, la raíz distobucal y la raíz palatina. (B) Tinción HE de todo el hueso alveolar de M1 en ratones. (C) Tinción inmunofluorescente de OPN en todo el hueso alveolar de M1 en ratones. Barras de escala = 200 μm (B), 100 μm (C). Esta figura es de Gong et al.26. Abreviaturas: ROI = regiones de interés; MB = raíz mesiobucal; DB = raíz distobucal; P = raíz palatina; HE = hematoxilina-eosina; OPN = osteopontina; PDL = ligamento periodontal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: La deficiencia osteoblástica de Stat3 alteró la formación y resorción ósea inducida por la fuerza ortodóncica . (A) Marcaje secuencial de fluorocromo por calceína y rojo de alizarina S en ratones WT y Stat3Col1α2ERT2 durante OTM y cuantificación de las tasas de aposición de minerales. n = 5. (B) Tinción de inmunofluorescencia y cuantificación de células OPN+ en hueso alveolar en d10 después de OTM en ratones WT y Stat3Col1α2ERT2. n = 5. (C) Tinción con TRAP y cuantificación de células positivas para TRAP en hueso alveolar en d4 después de OTM en ratones WT y Stat3Col1α2ERT2. n = 5. (D) Tinción de inmunofluorescencia y cuantificación de células CTSK+ en hueso alveolar en d4 después de OTM en ratones WT y Stat3Col1α2ERT2. n = 5. Barras de escala = 10 μm (A), 50 μm (B-D). Esta figura es de Gong et al.26. Abreviaturas: STAT3 = transductor de señal y activador de la transcripción 3; Col1α = colágeno 1-alfa; WT = tipo salvaje; OTM = movimiento dental ortodóncico; OPN = osteopontina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TRAP = fosfatasa ácida resistente al tartrato; MAR = tasas de aposición de minerales; CTSK = catepsina K. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Dado que la maloclusión es uno de los trastornos bucales más comunes que afectan la respiración, la masticación, el habla e incluso la apariencia, la demanda de ortodoncia aumenta día a día, con una incidencia que aumenta del 70% al 93% según una encuesta epidemiológica previa31,32. Cómo acelerar la remodelación ósea alveolar para aumentar la eficiencia del tratamiento de ortodoncia de forma segura se ha convertido en un tema candente en este campo; por lo tanto, es necesario esclarecer el mecanismo de remodelación ósea alveolar impulsado por OTM. En estudios anteriores, los investigadores utilizaron la inyección de fármacos in vivo para estudiar el mecanismo de OTM en modelos animales21,33, lo cual era simple y fácil, pero era difícil descartar la influencia de los fármacos en las células de otros sistemas. Por lo tanto, es muy necesario estudiar el mecanismo de remodelación ósea bajo fuerza ortodóncica in vivo.

En los últimos años, los ratones knockout genéticos han sido ampliamente utilizados, proporcionando una base sólida para el estudio de la función génica y la exploración de dianas terapéuticas34. Entre estas técnicas, la tecnología de eliminación de genes completos fue el primer enfoque. Se utilizó el modelo de ratón knockout del receptor adrenérgico Adrb2-/- (Adrb2) para explorar el papel del sistema nervioso simpático en la remodelación ósea alveolar durante OTM35. Sin embargo, los ratones con eliminación total de genes pueden dar lugar a letalidad embrionaria en algunos casos, lo que dificulta el estudio de la función de los genes. Por lo tanto, se desarrollaron ratones knockout condicionales, dirigidos a un gen en tipos celulares específicos. Sin embargo, debido a que la investigación relacionada con el remodelado óseo alveolar suele ser sensible al tiempo, es necesario, por lo tanto, observar los cambios en el hueso alveolar en momentos específicos después del modelado.

Los ratones knockout de genes condicionales inducibles tienen la doble ventaja de control temporal y espacial de la recombinación del ADN y la especificidad tisular, y la eliminación de genes se puede lograr en puntos de tiempo específicos y tejidos específicos mediante la aplicación de medicamentos u hormonas, que pueden satisfacer mejor las necesidades de investigación. Además, STAT3 es un factor de transcripción ampliamente expresado en el hueso y otros tejidos y tiene las funciones de regular la proliferación celular, la diferenciación, la apoptosis y otras funciones inmunitarias y otras funciones importantes25. Anteriormente informamos que la densidad mineral ósea de los ratones knockout Stat3 específicos de osteoblastos no inducidos se redujo28, lo que sugiere que los ratones knockout Stat3 condicionales no inducidos no son adecuados para el estudio mecanicista de la remodelación ósea alveolar que debe excluir la influencia del desarrollo.

Por lo tanto, en este estudio, generamos ratones knockout del gen Stat3 específicos de osteoblastos inducibles por tamoxifeno, Stat3Col1α2ERT2, mediante el empleo de la tecnología de knockout de genes condicionales inducibles basada en el sistema Cre/loxP, que es controlable en el tiempo y en el espacio y más adecuado para el estudio del mecanismo de remodelación ósea alveolar, además de permitir un mayor estudio de la función de células y genes específicos combinados con el rastreo del linaje. Antes de la inducción del tamoxifeno, no había una diferencia obvia entre Stat3Col1α2ERT2 y los ratones de tipo salvaje y nada especial en la cría. Anteriormente hemos encontrado que la deleción inducible de Stat3 en los osteoblastos Col1α2+ perjudicó la formación ósea y redujo la masa ósea en ratones adultos28. En este estudio, el nivel de metabolismo óseo de los ratones Stat3Col1α2ERT2 en los grupos no OTM disminuyó, lo que fue consistente con los resultados anteriores. Además, como el nivel de metabolismo óseo del grupo OTM disminuyó más significativamente en respuesta a la fuerza ortodóncica, se pudo considerar que Stat3 jugó un papel importante en la regulación del metabolismo óseo bajo fuerza mecánica. Exploramos más a fondo el mecanismo de remodelación ósea regulado por Stat3. Los resultados indicaron que Stat3 podría promover directamente la diferenciación osteoblástica 28,29 y afectar la diferenciación osteoclastos mediante la regulación de la diafonía entre osteoblastos y osteoclastos a través de la modulación de la transcripción Mmp3 29.

En este protocolo, seleccionamos el área ubicada dentro de tres raíces de M1 en la sección transversal en el hueso maxilar de ratones como el ROI para evaluar la remodelación ósea alveolar. Con esta área, el análisis del hueso alveolar se acerca más al de los huesos largos, en los que se analiza la actividad de la osteogénesis y la osteoclastogénesis en la misma región, en lugar del método tradicional de analizar las características de los diferentes lados. Además, según la hipótesis clásica, se deben aplicar dos fármacos con efectos opuestos en los lados de la presión y la tensión, respectivamente, para acelerar la velocidad de movimiento de los dientes. Este método proporcionó una base teórica para superar estos cuellos de botella. En este modelo OTM, la magnitud de la fuerza ortodóncica se midió mediante el uso de un dinamómetro. Sin embargo, la fuerza se atenuaría ligeramente con la reducción de la distancia entre el primer molar y los incisivos. Por lo tanto, es necesario establecer un sistema mecánico estandarizado para generar una fuerza de ortodoncia más constante y estable.

Dentro del protocolo, hay algunos pasos críticos que deben tenerse en cuenta. En primer lugar, en el proceso de construcción del modelo OTM, el primer molar y el incisivo deben estar firmemente ligados para evitar la falla de la aplicación de fuerza por desplazamiento. En segundo lugar, se debe prestar atención a la dirección de la fuerza, y se debe aplicar fuerza horizontal al primer molar para evitar la extracción del diente causada por la aplicación de la fuerza vertical. Finalmente, al incrustar, la orientación de la muestra debe determinarse de acuerdo con la sección transversal objetivo, y las secciones deben observarse a tiempo para ajustar la orientación y obtener secciones ideales.

En conclusión, proporcionamos protocolos para un modelo de ratón inducible, específico y con genes knockout de OTM, que revela la remodelación ósea alveolar en diferentes momentos temporales. Además, utilizaremos esto para estudiar la función de células y genes específicos combinados con el rastreo de linaje. A continuación, establecimos un patrón dinámico y específico de la célula in vivo en el campo de la investigación de los mecanismos OTM, ofreciendo evidencia para la ortodoncia en la clínica. Además, este estudio proporciona protocolos detallados para la construcción de un modelo OTM, que permite un rápido remodelado óseo mediante la estimulación de osteoblastos y osteoclastos y proporciona un modelo ideal para el estudio del remodelado óseo en respuesta a la fuerza mecánica. Más que eso, describimos métodos para analizar la remodelación ósea alveolar durante la OTM para proporcionar una estrategia novedosa para el estudio de la biología mecánica esquelética.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); la Fundación de Ciencias Naturales de Shanghái (21ZR1436900, 22ZR1436700); el Programa de Líder de Investigación Académica/Tecnológica de Shanghái (20XD1422300); Plan de Investigación Clínica del SHDC (SHDC2020CR4084); el Fondo de Investigación Interdisciplinaria del Noveno Hospital Popular de Shanghái, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (JYJC201902, JYJC202116); el Equipo de Investigación en Innovación de las Universidades Locales de Alto Nivel de Shanghái (SSMUZLCX20180501); el Fondo de Disciplina de Investigación no. KQYJXK2020 del Noveno Hospital Popular de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái y de la Facultad de Estomatología de la Universidad Jiao Tong de Shanghái; Proyecto de Exploración Original del Noveno Hospital Popular de Shanghái, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (JYYC003); Proyecto de Doscientos Talentos de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái; el Proyecto de Investigación Cooperativa del Instituto de Biomateriales y Medicina Regenerativa de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (2022LHB02); el Proyecto del Biobanco del Noveno Hospital Popular de Shanghái, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (YBKB201909, YBKB202216).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  P1020
4% paraformaldehyde Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1101
Alizarin red Sigma-Aldrich A5533
Anti-CTSK antibody Santa Cruz sc-48353
Anti-OPN antibody R&D Systems, Minneapolis, MN, USA AF808
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Closed-coil springs Innovative Material and Devices, Shanghai, China CS1006B
Col1α2CreERT2 mice A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences.
Dexmedetomidine hydrochloride Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTA Beyotime Biotechanology ST069
Embedding tanks Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd 80106-1100-16
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 100092183
ImageJ software NIH, Bethesda, MD, USA
Mounting medium with DAPI Beyotime Biotechanology P0131
Mouse dissection platform Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. HK105
Paraffin Sangon biotech Co., Ltd. A601889
Primers for genotyping Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease K Sigma-Aldrich 539480
Self-curing restorative resin 3M ESPE, St. Paul, MN, USA 712-035
Stat3fl/fl mice GemPharmatech Co., Ltd D000527
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648
TRAP staining kit Sigma-Aldrich 387A
Tris-HCl Beyotime Biotechanology ST780
Universal tissue fixative Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1105
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10023418
Zoletil VIRBAC 

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References

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Medicina Número 197 Movimiento de los dientes de ortodoncia Metabolismo óseo Fuerza mecánica Modelo animal Papel de STAT3 en osteoblastos Modelo de ratón inducible por tamoxifeno Fuerza ortodóncica Fenotipo óseo alveolar Micro-TC Microscopía estereoscópica Análisis histológico Osteoblastos Osteoclastos
Uso de ratones knockout <em>Stat3</em> específicos del linaje osteoblástico inducible para estudiar la remodelación del hueso alveolar durante el movimiento de los dientes de ortodoncia
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Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong,… More

Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong, X., Yang, Y., Zhu, Y., Xu, H., Jin, A., Huang, X., Gao, X., Lu, T., Liu, J., Wang, X., Dai, Q., Jiang, L. Using Inducible Osteoblastic Lineage-Specific Stat3 Knockout Mice to Study Alveolar Bone Remodeling During Orthodontic Tooth Movement. J. Vis. Exp. (197), e65613, doi:10.3791/65613 (2023).

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