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Utilisation de souris knock-out Stat3 inductibles spécifiques à la lignée ostéoblastique pour étudier le remodelage osseux alvéolaire pendant le mouvement des dents orthodontiques

Published: July 21, 2023 doi: 10.3791/65613
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, *6, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 2,3,4,5,7, 1,2,3,4,5
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University, 3National Center for Stomatology, 4National Clinical Research Center for Oral Diseases, 5Shanghai Key Laboratory of Stomatology, 6Shanghai Starriver Bilingual School, 7The 2nd Dental Center, Ninth People’s Hospital, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Cette étude fournit un protocole pour l’utilisation de souris knock-out Stat3 inductibles spécifiques à la lignée ostéoblastique pour étudier le remodelage osseux sous force orthodontique et décrit des méthodes d’analyse du remodelage osseux alvéolaire pendant le mouvement orthodontique des dents, mettant ainsi en lumière la biologie mécanique squelettique.

Abstract

L’os alvéolaire, avec un taux de renouvellement élevé, est l’os le plus activement remodelant du corps. Le mouvement orthodontique des dents (OTM) est un processus artificiel courant de remodelage osseux alvéolaire en réponse à une force mécanique, mais le mécanisme sous-jacent reste insaisissable. Des études antérieures n’ont pas été en mesure de révéler le mécanisme précis du remodelage osseux dans le temps et l’espace en raison de restrictions liées aux modèles animaux. Le transducteur de signal et activateur de la transcription 3 (STAT3) est important dans le métabolisme osseux, mais son rôle dans les ostéoblastes pendant l’OTM n’est pas clair. Pour fournir des preuves in vivo que STAT3 participe à l’OTM à des moments spécifiques et dans des cellules particulières pendant l’OTM, nous avons généré un modèle murin knock-out Stat3 spécifique à la lignée d’ostéoblastes induit par le tamoxifène, appliqué une force orthodontique et analysé le phénotype osseux alvéolaire.

La micro-tomodensitométrie (Micro-TDM) et la stéréomicroscopie ont été utilisées pour accéder à la distance OTM. L’analyse histologique a sélectionné la zone située à l’intérieur de trois racines de la première molaire (M1) dans la section transversale de l’os maxillaire comme région d’intérêt (ROI) pour évaluer l’activité métabolique des ostéoblastes et des ostéoclastes, indiquant l’effet de la force orthodontique sur l’os alvéolaire. En bref, nous fournissons un protocole pour l’utilisation de souris knock-out Stat3 inductibles spécifiques à la lignée ostéoblastique pour étudier le remodelage osseux sous force orthodontique et décrivons des méthodes d’analyse du remodelage osseux alvéolaire pendant l’OTM, jetant ainsi un nouvel éclairage sur la biologie mécanique squelettique.

Introduction

Il est généralement connu que l’os est soumis à une reconstruction constante tout au long de la vie, en réponse à des forces mécaniques selon la loi de Wolff 1,2. Une stimulation mécanique appropriée, telle que la gravité et l’exercice quotidien, maintient la masse osseuse et la force et prévient la perte osseuse en stimulant à la fois les ostéoblastes et les ostéoclastes. Les ostéoclastes, responsables de la résorption osseuse 3,4,5,6,7, et les ostéoblastes, responsables de la formation osseuse 8,9,10, maintiennent l’homéostasie osseuse et fonctionnent conjointement dans le processus biologique de remodelage osseux. En revanche, en l’absence de stimuli de charge, comme chez les astronautes soumis à une microgravité à long terme, les os subissent une perte de densité minérale osseuse de 10 %, augmentant ainsi le risque d’ostéoporose11,12. De plus, des thérapies mécaniques non invasives et pratiques, y compris l’orthodontie et l’ostéogenèse de distraction, sont apparues comme traitements pour les maladies osseuses13,14. Tous ces éléments ont montré que la force mécanique joue un rôle essentiel dans le maintien de la qualité et de la quantité des os. Des études récentes ont généralement analysé le remodelage osseux en réponse à une charge mécanique à l’aide de modèles chronophages tels que les tests de suspension des roues et de la queue, qui prenaient généralement 4 semaines ou plus pour simuler la charge ou le déchargement de la force15,16. Par conséquent, il existe une demande pour un modèle animal pratique et efficace pour étudier le remodelage osseux entraîné par la charge de force.

L’os alvéolaire est le plus actif en termes de remodelage osseux, avec un taux de renouvellement élevé17. Le mouvement orthodontique des dents (OTM), un traitement courant de la malocclusion, est un processus artificiel de remodelage osseux alvéolaire en réponse à une force mécanique. Cependant, l’OTM, qui induit un remodelage osseux rapide18, est également un moyen de gagner du temps pour étudier les effets de la force mécanique sur le remodelage osseux par rapport à d’autres modèles ayant une longue période expérimentale. Par conséquent, l’OTM est un modèle idéal pour étudier le remodelage osseux sous stimuli mécaniques. Il convient de noter que le mécanisme du remodelage osseux alvéolaire est souvent sensible au temps et qu’il est nécessaire d’observer les changements dans le remodelage osseux alvéolaire à certains moments après la modélisation. Avec le double avantage du contrôle temporel et spatial de la recombinaison de l’ADN et de la spécificité tissulaire, un modèle murin de knock-out génique conditionnel inductible est un choix approprié pour les études OTM.

Classiquement, le remodelage osseux alvéolaire médié par OTM a été divisé en zones de tension impliquant la formation osseuse et en zones de pression impliquant la résorption osseuse 19,20,21, qui est plus détaillée mais difficile à réguler. De plus, Yuri et al. ont rapporté que le temps de formation osseuse dans l’OTM différait du côté de la tension et de la compression22. De plus, une étude antérieure avait démontré que la première molaire pouvait initier un remodelage large de l’os alvéolaire maxillaire sous l’effet d’une force orthodontique, qui n’était pas contrainte aux zones de tension et de pression23. Par conséquent, nous avons sélectionné la zone située à l’intérieur de trois racines de M1 dans la section transversale de l’os maxillaire comme région d’intérêt (ROI) et décrit des méthodes pour évaluer l’activité des ostéoblastes et des ostéoclastes dans la même zone afin d’évaluer le remodelage osseux alvéolaire sous OTM.

En tant que facteur de transcription nucléaire, transducteur de signal et activateur de la transcription 3 (STAT3) s’est avéré essentiel dans l’homéostasie osseuse24,25. Des études antérieures ont rapporté une faible densité minérale osseuse et des fractures pathologiques récurrentes chez des souris mutantes Stat3 26,27. Notre étude précédente a démontré que la délétion de Stat3 dans les ostéoblastes Osx+ provoquait une malformation craniofaciale et une ostéoporose, ainsi qu’une fracture osseuse spontanée28. Récemment, nous avons fourni des preuves in vivo avec un modèle murin de délétion Stat3 inductible spécifique de l’ostéoblaste (Col1α2CreERT2 ; Stat3 fl/fl, ci-après appelé Stat3Col1α2ERT2) que STAT3 est essentiel dans la médiation des effets de la force orthodontique entraînant le remodelage osseux alvéolaire29. Dans cette étude, nous fournissons des méthodes et des protocoles pour l’utilisation de souris knock-out Stat3 inductibles spécifiques à la lignée ostéoblastique pour étudier le remodelage osseux sous force orthodontique et décrivons des méthodes d’analyse du remodelage osseux alvéolaire pendant l’OTM, mettant ainsi en lumière la biologie mécanique squelettique.

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Protocol

Toutes les méthodes impliquant des animaux décrites ici ont été approuvées par le comité d’éthique de l’Hôpital du Neuvième Peuple de Shanghai, École de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai (n° 82101048).

1. Établissement de souris knock-out Stat3 inductibles spécifiques à la lignée des ostéoblastes

NOTE : Les souris Stat3 fl/fl ont été obtenues commercialement ; la souche Col1α2CreERT2était un cadeau (voir le tableau des matériaux pour tous les détails). Des granulés de nourriture et de l’eau normalisés pour tous les animaux et des conditions environnementales normalisées en laboratoire (température ambiante de 22 °C à 26 °C et humidité de 50 % à 55 %) ont été fournis.

  1. Mettez une souris mâle sexuellement mature avec deux souris femelles dans la même cage. Après 18 jours, vérifiez la présence de nouveau-nés tous les jours. Retirez les souris femelles gestantes dans une cage vide et gardez-les seules si nécessaire. Placez les souris mâles dans d’autres cages d’élevage différentes si les souris femelles ne sont pas gestantes dans les 30 jours.
  2. Générer Stat3fl/+ ; Souris Col1α2 CreERT2 en hybridant des souris Stat3 fl/ fl avec des souris Col1α2 CreERT2 ; maintenir toutes ces souris sur le fond C57BL/6. Recueillir les extrémités de la queue de 2 à 5 mm pour le génotypage et garder le mâle Stat3fl/+ ; Col1α2CreERT2 jusqu’à ce qu’elles soient sexuellement matures (F1).
  3. Hybrider un mâle de 6 semaines Stat3fl/ + ; Souris Col1α2CreERT2 avec des souris femelles Stat3 fl/fl. Prélever des extrémités de queue de 2 à 5 mm lorsque les souris ont 2 semaines pour le génotypage, et garder le mâle Stat3 fl/ fl ; Col1α2 CreERT2(Stat3Col1α2ERT2) jusqu’à ce qu’elles soient sexuellement matures (F2).
  4. Hybrider un mâle de 6 semaines Stat3 fl/ fl ; Souris Col1α2CreERT2 avec souris femelles Stat3 fl/fl (F3). Prélever des extrémités de queue de 2 à 5 mm lorsque les souris sont âgées de 2 semaines pour le génotypage, et utiliser les souris plus jeunes du même génotype pour remplacer les souris reproductrices plus âgées lorsque cela est approprié (F3+N).
    REMARQUE : La capacité de reproduction des souris diminue après l’âge de 8 mois, de sorte que les souris dans les cages d’élevage doivent être soigneusement surveillées et remplacées au besoin. De plus, conformément aux exigences expérimentales, le nombre de cages d’élevage doit être augmenté de manière appropriée pour éviter l’extinction des souris génétiques cibles.

2. Délétion inductible de Stat3 dans les ostéoblastes exprimant Col1α2 par le tamoxifène

  1. Dissoudre le tamoxifène dans l’huile de maïs à 20 mg/mL dans un tube à centrifuger et le protéger de la lumière en l’enveloppant dans du papier d’aluminium. Placez le tube à centrifuger recouvert de papier d’aluminium sur un mélangeur rotatif et mélangez à température ambiante jusqu’à dissolution complète.
    REMARQUE : Le tamoxifène a été obtenu dans le commerce et stocké dans l’obscurité à 4 °C.
  2. Sélectionnez dix souris mâles de 6 semaines et divisez-les en groupes Stat3 fl/fl et Stat3 Col1α2ERT2 avec cinq souris dans chaque groupe. Administrer le tamoxifène (100 mg·kg-1·p.c.) tous les 2 jours pendant 1 semaine par injection intrapéritonéale.

3. Modèle de mouvement dentaire orthodontique (OTM)

  1. Préparez une plate-forme de dissection de souris en plastique stérilisé comme table d’opération pour immobiliser les souris.
    REMARQUE : La table de dissection de souris a été obtenue dans le commerce et se composait de quatre poteaux en caoutchouc réglables et d’une tige métallique pour immobiliser les souris. Utilisez des instruments et des outils stériles tout au long de la procédure.
  2. Attachez une bande élastique à chaque poteau en caoutchouc pour la fixation des membres.
  3. Attachez un élastique entre les deux poteaux supérieurs en caoutchouc ; attachez un fil à l’élastique pour maintenir les incisives inférieures ; et attachez un autre fil à la tige métallique pour maintenir les incisives supérieures.
  4. Anesthésier des souris mâles âgées de 7 semaines avec une solution de 0,1 mL de chlorhydrate de dexmédétomidine (0,1 mg·kg-1·p.c.) et de zoletil (chlorhydrate de tilétamine pour 20 mg·kg-1·p.c. et chlorhydrate de zolazépam pour 20 mg·kg-1·p.c.) dissous dans une solution saline par injection intrapéritonéale avant la chirurgie. Assurez-vous que les souris sont correctement anesthésiées tout au long de l’opération.
    REMARQUE : Faites attention à la date d’utilisation effective des médicaments et n’utilisez pas de médicaments périmés.
  5. Confirmez que les souris sont sous anesthésie appropriée en serrant les orteils des membres postérieurs avec les doigts.
    REMARQUE : Si les souris ne répondent pas au test, cela signifie qu’elles sont inconscientes et que l’anesthésie a atteint la profondeur souhaitée. À ce moment-là, les souris sont dans un état de relaxation des muscles des membres, avec une respiration et un rythme cardiaque fluides, et l’opération peut commencer.
  6. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux des souris pour éviter la sécheresse et placez la souris anesthésiée en position couchée sur le dos sur la table d’opération. Utilisez quatre bandes élastiques sur les tiges en caoutchouc pour fixer les membres, un fil attaché à la tige métallique pour maintenir les incisives supérieures et un autre attaché à une bande élastique entre les deux tiges en caoutchouc supérieures pour accrocher les incisives inférieures afin de maintenir la mâchoire inférieure ouverte.
  7. Préparez des ressorts hélicoïdaux fermés (taille de fil de 0,25 mm, diamètre de 0,76 mm, longueur de 1 mm) pour l’appareil de force orthodontique.
    REMARQUE : Coupez huit fils de ressort pour chaque souris. Quatre filetages de 1 mm de longueur au milieu pour l’appareil de force et deux filetages à chaque extrémité pour la ligaturation à l’aide d’un fil de ligature en acier.
  8. Ligate une extrémité du ressort préparé à la première molaire maxillaire gauche. Liquez l’autre extrémité de l’incisive centrale avec un fil de ligature en acier de 0,1 mm renforcé par une résine réparatrice photopolymérisable après avoir appliqué de l’adhésif sur les incisives avec le coton-tige pour générer une force stable d’une magnitude de 10 g mesurée à l’aide d’un dynamomètre.
  9. Une fois l’opération terminée, placez les souris dans une cage avec d’autres souris de la même souche en convalescence, ou mettez chaque souris seule dans une cage vide. Assurez-vous que les souris ne sont pas laissées sans surveillance jusqu’à ce qu’elles aient repris suffisamment conscience 2 à 4 h après l’opération pour maintenir la décubitus sternal. Pendant les jours suivants, nourrissez les souris avec une alimentation molle et observez-les régulièrement pour vous assurer qu’aucune complication ne survient et pour déterminer le degré de douleur post-chirurgicale ; administrer des analgésiques au besoin.
    REMARQUE : Les souris qui ont subi une intervention chirurgicale ne doivent pas être retournées en compagnie d’autres souris jusqu’à ce qu’elles soient complètement rétablies. Ne mettez pas de souris post-chirurgicales en convalescence avec des souris qui ne sont pas anesthésiées. Les souris doivent être maintenues au chaud pendant la récupération.
  10. Vérifiez l’appareil orthodontique tous les jours et excluez toute souris expérimentale avec délogement.

4. Prélèvement d’échantillons

  1. Euthanasiez les souris à trois moments différents par luxation cervicale : 4 jours (j4), 7 jours (j7) et 10 jours (j10) après le début de l’OTM.
  2. Utilisez des ciseaux ophtalmiques pour couper la peau verticalement de la région cervicale, puis séparez la tête du corps avec toute la peau de la tête disséquée.
  3. Coupez la peau et les muscles buccinateurs de l’angulus oris bilatéral à la région postérieure de la mandibule. Déconnecter complètement les muscles buccaux et les tendons attachés aux coracoïdes pour enlever la mandibule et couper les os supplémentaires pour obtenir des maxillaires complets. Ensuite, retirez l’os derrière les troisièmes molaires bilatérales et arrachez la muqueuse palatine. Enfin, débranchez l’appareil orthodontique et coupez l’os entre les incisives le long de la suture palatine médiane pour obtenir l’os alvéolaire des côtés droit et gauche.
    REMARQUE : Assurez-vous que la région allant des incisives à la troisième molaire est maintenue intacte des deux côtés.

5. Préparation pour la section de paraffine

  1. Fixation : Immerger l’os alvéolaire récolté dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 48 h et le tailler avec des ciseaux ophtalmiques dans la hotte pour les sections 6 et 7.
  2. Décalcification : Laver délicatement les échantillons avec 1x PBS pendant 3 x 10 min. Détartrer les échantillons dans un fixateur tissulaire universel (pH 8,0), remplacé par une solution fraîche tous les 2 jours, pendant 5 semaines jusqu’à ce que les os puissent être facilement pénétrés par la pointe d’une aiguille.
  3. Déshydratation : Lavez les échantillons dans 1x PBS pendant 3 x 10 min, puis plongez-les séquentiellement dans de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 100 % et du xylène, pendant 2 x 1 h chaque solution.
  4. Immergez les échantillons dans un mélange 1 :1 de xylène et de paraffine pendant 30 minutes, puis dans de la paraffine à 65 °C pendant la nuit.
  5. Enrobage : Sélectionnez les réservoirs d’encastrement appropriés. Placez l’os alvéolaire uniformément avec les dents vers le haut au même niveau. Retirez les échantillons de la cuve d’enrobage et transférez-les dans un congélateur à -20 °C, puis numérotez-les lorsque la paraffine est complètement refroidie et solide.
  6. À l’aide d’un microtome, découper de 20 à 44 μm d’épaisseur en continu dans le plan transversal et flotter sur de l’eau à 37 °C. Collez les sections sur des lames de microscope et faites cuire au four à 42 °C pendant la nuit.

6. Mesure de distance OTM

  1. Photographier des spécimens à partir de trois points temporels verticalement à partir du plan occlusal par stéréomicroscopie.
  2. Scanner l’os alvéolaire à l’aide d’un micro-scanner. Reconstruisez des images 3D du plan sagittal maximal de l’os alvéolaire maxillaire, dans lequel trois molaires sont complètement visibles, à l’aide du logiciel de support du scanner en suivant les instructions du fabricant.
  3. Mesurez la distance OTM à l’aide du logiciel ImageJ :
    1. Ouvrez le logiciel ImageJ et utilisez l’outil Ligne droite pour créer un segment de ligne de distance connue.
    2. Cliquez sur Analyze (Analyser ) et choisissez Set Scale (Définir l’échelle ) pour entrer la valeur de la distance de la ligne tracée dans Distance connue et entrez les unités dans Unit of length (Unité de longueur).
    3. Tracez une ligne entre les points médians de la crête marginale mésiale de M2 et la crête marginale distale de M1 et cliquez sur Mesure. Les résultats affichés dans la colonne Longueur représentent la distance OTM.

7. Analyse histologique

  1. Sélection de la région d’intérêt (ROI) : Définissez l’os alvéolaire de la première molaire (M1) comme le ROI, situé exactement à l’intérieur des trois racines de M1 dans la section transversale de l’os maxillaire. Cette région atteint non seulement l’os cortical de la première molaire dans le sens buccal-lingual, mais s’étend également jusqu’au milieu du grand axe de la racine mésiobuccale, y compris la demi-zone entre la racine distobuccale et la racine palatine.
  2. Analyse de l’ostéogenèse
    1. Double marquage et analyse de la calcéine et du rouge d’alizarine
      1. Préparation de calcéine et d’alizarine rouge : Dissoudre la calcéine dans une solution de NaHCO3 à 2 % à 1 mg/mL et le rouge d’alizarine S dans H 2 O à2mg/mL.
        REMARQUE : Dans cette étude, la calcéine et le rouge d’alizarine ont été obtenus commercialement.
      2. Administrer de la calcéine (20 mg·kg-1·p.c.) le jour 1 et de l’alizarine rouge S (40 mg·kg-1.p.c.) le jour 8 par injection intrapéritonéale après le début de l’OTM. Euthanasiez les souris au jour 10 et récoltez l’os alvéolaire.
      3. Préparez les échantillons et intégrez-les en suivant les étapes 5.1 et 5.3-5.5. Pour plus de détails, voir Yang et al.30.
      4. À l’aide d’un microtome rotatif, découper des sections de 5 μm d’épaisseur en continu dans le plan transversal. Collez les sections sur les lames de microscope et montez-les avec des lamelles à l’aide d’un baume neutre.
        REMARQUE : Le reste des échantillons doit être conservé avec un dessiccant à température ambiante.
      5. Examiner et photographier les coupes au microscope à fluorescence et calculer le taux d’apposition minérale (MAR) et le taux de formation osseuse (BFR/BS) selon la méthode décrite précédemment30.
    2. Immunofluorescence
      1. Sélectionnez les sections de paraffine appropriées et faites cuire au four à 65 °C pendant 30 min.
      2. Déparaffinage : Plongez les sections dans le xylène pendant 5 min et répétez deux fois avec du xylène frais à chaque fois.
      3. Réhydratation : Immergez les sections séquentiellement dans de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 75 %, de l’éthanol à 50 % et du ddH2O, chacune pendant 5 min.
      4. Lavez délicatement les sections avec 1 x PBS pendant 2 x 5 min.
      5. Récupération de l’antigène : Immerger les coupes dans un mélange de Tris-HCl (0,05 M, pH 8,0), d’EDTA (0,01 M, pH 8,0) et de protéase K (10 μg/mL) dans du ddH2O et incuber à 37 °C pendant 15 min.
      6. Lavez délicatement les sections avec 1 x PBS pendant 3 x 5 min.
      7. Bloc : Retirez l’excédent de liquide des sections et tracez un cercle autour de la zone cible à l’aide d’un marqueur hydrophobe. Pour bloquer la liaison non spécifique, couvrir d’un tampon bloquant contenant 10 % d’albumine sérique bovine et incuber à température ambiante pendant 1 h.
        REMARQUE : Veillez à ne pas sécher les sections trop longtemps, afin de ne pas affecter les résultats.
      8. Incubation primaire de l’anticorps : Diluer l’anticorps anti-ostéopontine (OPN) avec un diluant d’anticorps à la concentration recommandée et ajouter 30 à 50 μL à chaque échantillon ; incuber à 4 °C pendant une nuit dans une chambre humidifiée.
        REMARQUE : Assurez-vous de laisser un peu d’eau dans la chambre et de la couvrir pour empêcher le liquide d’anticorps de s’évaporer.
      9. Lavez délicatement les sections avec 1 x PBS pendant 3 x 10 min.
        REMARQUE : Les étapes 7.2.2.10 à 7.2.2.12 doivent être effectuées dans l’obscurité.
      10. Incubation d’anticorps secondaires fluorescents : Sélectionnez un anticorps secondaire fluorescent approprié correspondant à l’anticorps primaire et diluez-le à la concentration recommandée. Ajouter 30 à 50 μL à chaque échantillon et incuber à température ambiante pendant 1 h.
      11. Lavez délicatement les sections avec 1 x PBS pendant 2 x 10 min.
      12. Utilisez un milieu de montage anti-décoloration avec 4'6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour monter les échantillons. Conservez les sections dans l’obscurité et photographiez-les dès que possible.
      13. Effectuer une microscopie à fluorescence à l’aide d’une caméra numérique pour examiner et photographier les coupes et compter les cellules positives dans les régions d’intérêt (ROI).
  3. Analyse de l’ostéoclastogenèse
    1. Coloration à la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP)
      1. Sélectionnez les sections de paraffine appropriées. Déparaffiner et réhydrater en suivant les étapes 7.2.2.1 à 7.2.2.3.
      2. Préparez une solution de coloration fraîche à l’aide du kit de coloration TRAP selon les instructions du fabricant et préchauffez à 37 °C.
      3. Ajouter 30 à 50 μL de solution colorante à chaque échantillon et incuber à 37 °C dans une chambre humidifiée pendant 20 à 30 minutes. Vérifiez toutes les 5 minutes jusqu’à ce que les ostéoclastes multinucléés rouges soient vus au microscope optique. Arrêtez la réaction avec ddH2O.
      4. Contre-coloration dans une solution d’hématoxyline pendant 30 s et immersion dans une solution d’ammoniac à 1% pendant 1 min pour une couleur bleue stable. Rincez à l’eau du robinet à faible débit.
      5. Montez les sections avec des lamelles à l’aide d’un baume neutre et séchez-les toute la nuit.
      6. Prenez des photos au microscope et comptez le nombre de cellules TRAP-positives avec plus de trois noyaux, en suivant notre protocole précédent30.
    2. Immunofluorescence : Utiliser l’anticorps de cathepsine K (CTSK) à la concentration recommandée pour l’immunofluorescence et suivre le protocole décrit à la rubrique 7 ci-dessus.

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Representative Results

À l’aide de ce protocole, nous avons établi un modèle de souris knock-out Stat3 inductible spécifique à la lignée d’ostéoblastes (Stat3Col1α2ERT2) pour examiner les effets de la délétion de STAT3 sur le remodelage osseux alvéolaire induit par la force orthodontique (Figure 1A,B). La délétion de STAT3 dans les ostéoblastes a été confirmée par une coloration par immunofluorescence de l’os alvéolaire (Figure 1C).

La stéréomicroscopie a indiqué que la distance OTM des souris WT augmentait à j4, j7 et j10. Cependant, chez les souris Stat3 Col1α2ERT2, la distance OTM a été réduite (Figure 2B). Ce phénomène a également été confirmé par l’analyse Micro-CT sur d10, indiquant que la délétion ostéoblastique de Stat3 ralentissait l’OTM (Figure 2C).

Pour l’analyse histologique, la zone située à l’intérieur des trois racines de M1 dans la coupe transversale au niveau de l’os maxillaire a été définie comme ROI, ce qui montre la situation globale du remodelage osseux alvéolaire (Figure 3A). La coloration à l’hématoxyline-éosine et la coloration par immunofluorescence OPN ont montré l’ensemble de l’os alvéolaire de ROI (Figure 3B,C).

Pour l’analyse ostéogénique, le marquage au rouge d’alizarine et à la calcéine a indiqué que la force orthodontique augmentait le taux d’apposition minérale (MAR) de l’os alvéolaire chez les souris WT, mais que le MAR dans le groupe OTM des souris Stat3 Col1α2ERT2 était réduit par rapport aux souris WT (Figure 4A). De plus, la coloration par immunofluorescence a démontré que le nombre d’ostéoblastes OPN+ augmentait sous l’effet de la force orthodontique, mais qu’il y avait moins d’ostéoblastes OPN+ dans le groupe OTM des souris Stat3Col1α2ERT2 que chez les souris WT (Figure 4B). Pour l’analyse ostéoclastogénique, la coloration TRAP a indiqué que, sous l’effet de la force orthodontique, le nombre d’ostéoclastes augmentait chez les souris WT, mais qu’il y avait moins d’ostéoclastes dans le groupe OTM des souris Stat3Col1α2ERT2 que chez les souris WT (Figure 4C). Ce phénomène a également été confirmé par la coloration par immunofluorescence de CTSK (Figure 4D). Ces résultats ont révélé que le déficit ostéoblastique en Stat3 réduisait l’activité des ostéoblastes et des ostéoclastes en réponse à la force orthodontique et altérait le remodelage osseux pendant le mouvement des dents.

Figure 1
Figure 1 : Illustration de la génération d’un modèle de souris knock-out Stat3 inductible spécifique à la lignée d’ostéoblastes. (A) Schéma de principe du knock-out de Stat3 dans les ostéoblastes exprimant Col1α2 induits par le tamoxifène (à gauche). Le schéma de l’expérience : des souris mâles de type sauvage et Stat3Col1ERT2 âgées de 6 semaines ont reçu de l’AT (100 mg·kg-1·p.c.) tous les 2 jours à partir d’une semaine avant la construction du modèle OTM et ont été sacrifiées pour l’analyse sur d4, d7 et d10 après l’OTM (à droite). (B) Progression de l’hybridation de souris knock-out Stat3 inductibles spécifiques à la lignée d’ostéoblastes. (C) Double coloration par immunofluorescence de STAT3 et OPN dans l’os alvéolaire de souris WT et Stat3Col1ERT2 sur d10 après OTM et quantification des cellules doublement positives sur les côtés non-OTM et OTM. n = 5 ; barres d’échelle = 50 μm. Ce chiffre provient de Gong et al. 26. Abréviations : STAT3 = transducteur de signal et activateur de la transcription 3 ; Col1α = collagène 1-alpha ; TA = tamoxifène ; WT = type sauvage ; OTM = mouvement orthodontique des dents ; OPN = ostéopontine ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Déficit ostéoblastique de Stat3 ralenti du mouvement des dents orthodontiques (A) Le schéma de principe du modèle OTM in vivo. Le ressort ligaçait entre les incisives et la première molaire (M1) et induisait une force orthodontique pour déplacer M1 vers la crête mésiale. (B) La distance OTM de d0, d4, d7 et d10 après OTM chez les souris WT et les souris Stat3Col1α2ERT2. (C) Images représentatives des côtés non-OTM et des côtés OTM chez les souris WT et Stat3Col1α2ERT2 sur d10 après OTM par micro-CT. n = 5. Barres d’échelle = 1 mm (B), 500 μm (C). Ce chiffre provient de Gong et al.26. Abréviations : STAT3 = transducteur de signal et activateur de la transcription 3 ; Col1α = collagène 1-alpha ; WT = type sauvage ; OTM = mouvement orthodontique des dents ; SAG = plan sagittal. Les courbes en pointillés indiquent la distance OTM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Illustration des régions d’intérêt. (A) Diagramme schématique des régions des ROI. La zone pointillée située à l’intérieur de trois racines de M1 dans la section transversale des maxillaires a été sélectionnée comme ROI. Les trois racines de M1 comprennent la racine mésiobuccale, la racine distobuccale et la racine palatine. (B) Coloration HE de l’ensemble de l’os alvéolaire de M1 chez la souris. (C) Coloration immunofluorescente de l’OPN dans l’ensemble de l’os alvéolaire de M1 chez la souris. Barres d’échelle = 200 μm (B), 100 μm (C). Ce chiffre provient de Gong et al.26. Abréviations : ROI = régions d’intérêt ; MB = racine mésiobuccale ; DB = racine distobuccale ; P = racine palatine ; HE = hématoxyline-éosine ; OPN = ostéopontine ; PDL = ligament parodontal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Le déficit ostéoblastique de Stat3 altère la formation osseuse et la résorption osseuse induite par la force orthodontique . (A) Marquage séquentiel du fluorochrome par la calcéine et le rouge d’alizarine S chez les souris WT et Stat3Col1α2ERT2 au cours de l’OTM et quantification des taux d’apposition minérale. n = 5. (B) Marquage par immunofluorescence et quantification des cellules OPN+ dans l’os alvéolaire à d10 après OTM chez les souris WT et Stat3Col1α2ERT2. n = 5. (C) Coloration TRAP et quantification des cellules TRAP-positives dans l’os alvéolaire sur d4 après OTM chez les souris WT et Stat3Col1α2ERT2. n = 5. (D) Marquage par immunofluorescence et quantification des cellules CTSK+ dans l’os alvéolaire sur d4 après OTM chez les souris WT et Stat3Col1α2ERT2. n = 5. Barres d’échelle = 10 μm (A), 50 μm (B-D). Ce chiffre provient de Gong et al.26. Abréviations : STAT3 = transducteur de signal et activateur de la transcription 3 ; Col1α = collagène 1-alpha ; WT = type sauvage ; OTM = mouvement orthodontique des dents ; OPN = ostéopontine ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole ; TRAP = phosphatase acide résistante au tartrate ; MAR = taux d’apposition minérale ; CTSK = cathepsine K. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La malocclusion étant l’un des troubles bucco-dentaires les plus courants, affectant la respiration, la mastication, la parole et même l’apparence, la demande d’orthodontie augmente de jour en jour, l’incidence passant de 70 % à 93 % selon une précédente enquête épidémiologique31,32. Comment accélérer le remodelage osseux alvéolaire pour augmenter l’efficacité du traitement orthodontique en toute sécurité est devenu un sujet brûlant dans ce domaine ; par conséquent, il est nécessaire de clarifier le mécanisme de remodelage osseux alvéolaire induit par l’OTM. Dans des études antérieures, les chercheurs ont utilisé l’injection de médicaments in vivo pour étudier le mécanisme de l’OTM dans des modèles animaux21,33, ce qui était simple et facile, mais il était difficile d’exclure l’influence des médicaments sur les cellules d’autres systèmes. Par conséquent, il est hautement nécessaire d’étudier le mécanisme du remodelage osseux sous la force orthodontique in vivo.

Au cours des dernières années, les souris knock-out géniques ont été largement utilisées, fournissant une base solide pour l’étude de la fonction des gènes et l’exploration de cibles thérapeutiques34. Parmi ces techniques, la technologie d’inactivation du gène entier a été la première approche. Le modèle murin knock-out du récepteur adrénergique Adrb2-/- (Adrb2) a été utilisé pour explorer le rôle du système nerveux sympathique dans le remodelage osseux alvéolaire au cours de l’OTM35. Cependant, les souris knock-out totale des gènes peuvent entraîner une létalité embryonnaire dans certains cas, ce qui entrave l’étude de la fonction des gènes. Par conséquent, des souris knock-out conditionnelles ont été développées, ciblant un gène dans des types cellulaires spécifiques. Cependant, comme la recherche liée au remodelage osseux alvéolaire est souvent sensible au temps, il est donc nécessaire d’observer les changements dans l’os alvéolaire à des moments précis après la modélisation.

Les souris knock-out géniques conditionnelles inductibles présentent le double avantage du contrôle temporel et spatial de la recombinaison de l’ADN et de la spécificité tissulaire, et le knock-out génique peut être réalisé à des moments précis et dans des tissus spécifiques grâce à l’application de médicaments ou d’hormones, ce qui peut mieux répondre aux besoins de la recherche. De plus, STAT3 est un facteur de transcription largement exprimé dans les os et d’autres tissus et a pour fonctions de régulation de la prolifération cellulaire, de la différenciation, de l’apoptose, du système immunitaire et d’autres fonctions importantes25. Nous avons précédemment signalé que la densité minérale osseuse des souris knock-out Stat3 spécifiques des ostéoblastes non induites était réduite28, ce qui suggère que les souris knock-out conditionnelles Stat3 non induites ne conviennent pas à l’étude mécanistique du remodelage osseux alvéolaire qui doit exclure l’influence du développement.

Par conséquent, dans cette étude, nous avons généré des souris knock-out du gène Stat3 inductibles par les ostéoblastes inductibles par le tamoxifène, Stat3Col1α2ERT2, en utilisant une technologie de knock-out génique conditionnelle inductible basée sur le système Cre/loxP, qui est contrôlable dans le temps et l’espace et plus adaptée à l’étude du mécanisme du remodelage osseux alvéolaire, ainsi qu’à l’étude plus approfondie de la fonction de cellules et de gènes spécifiques combinée au traçage de la lignée. Avant l’induction du tamoxifène, il n’y avait pas de différence évidente entre Stat3Col1α2ERT2 et les souris de type sauvage et rien de spécial dans la reproduction. Nous avons précédemment constaté que la délétion inductible de Stat3 dans les ostéoblastes Col1α2+ altère la formation osseuse et réduit la masse osseuse chez les souris adultes28. Dans cette étude, le niveau de métabolisme osseux des souris Stat3Col1α2ERT2 dans les groupes non OTM a diminué, ce qui était cohérent avec les résultats précédents. De plus, comme le niveau de métabolisme osseux du groupe OTM a diminué de manière plus significative en réponse à la force orthodontique, on pourrait considérer que Stat3 a joué un rôle important dans la régulation du métabolisme osseux sous la force mécanique. Nous avons ensuite exploré le mécanisme de remodelage osseux régulé par Stat3. Les résultats ont indiqué que Stat3 pouvait directement favoriser la différenciation des ostéoblastes 28,29 et affecter la différenciation des ostéoclastes en régulant la diaphonie entre les ostéoblastes et les ostéoclastes par la modulation de la transcription Mmp3 29.

Dans ce protocole, nous avons sélectionné la zone située à l’intérieur de trois racines de M1 dans la coupe transversale au niveau de l’os maxillaire de souris comme ROI pour évaluer le remodelage osseux alvéolaire. Avec cette zone, l’analyse de l’os alvéolaire est plus proche de celle des os longs, dans laquelle l’activité de l’ostéogenèse et de l’ostéoclastogenèse sont analysées dans la même région, plutôt que la méthode traditionnelle d’analyse des caractéristiques des différents côtés. De plus, selon l’hypothèse classique, deux médicaments aux effets opposés doivent être appliqués respectivement du côté de la pression et du côté de la tension pour accélérer le rythme de mouvement des dents. Cette méthode a fourni une base théorique pour surmonter ces goulots d’étranglement. Dans ce modèle OTM, l’amplitude de la force orthodontique a été mesurée à l’aide d’un dynamomètre. Cependant, la force serait légèrement atténuée avec la réduction de la distance entre la première molaire et les incisives. Par conséquent, il est nécessaire d’établir un système mécanique standardisé pour générer une force orthodontique plus constante et plus stable.

Dans le protocole, il y a certaines étapes critiques qui doivent être gardées à l’esprit. Tout d’abord, dans le processus de construction du modèle OTM, la première molaire et l’incisive doivent être fermement ligaturées pour éviter l’échec de l’application de la force par délogement. Deuxièmement, il faut faire attention à la direction de la force, et une force horizontale doit être appliquée à la première molaire pour éviter l’extraction dentaire causée par l’application d’une force verticale. Enfin, lors de l’enrobage, l’orientation de l’éprouvette doit être déterminée en fonction de la section transversale cible, et les sections doivent être observées à temps pour ajuster l’orientation afin d’obtenir des sections idéales.

En conclusion, nous fournissons des protocoles pour un modèle murin inductible, spécifique et knock-out génique de l’OTM, qui révèle un remodelage osseux alvéolaire à différents moments. Nous l’utiliserons ensuite pour étudier la fonction de cellules et de gènes spécifiques combinés au traçage de la lignée. Nous avons ensuite mis en place un modèle dynamique et spécifique à la cellule in vivo dans le domaine de la recherche sur les mécanismes OTM, offrant des preuves pour l’orthodontie en clinique. De plus, cette étude fournit des protocoles détaillés pour la construction d’un modèle OTM, qui permet un remodelage osseux rapide en stimulant les ostéoblastes et les ostéoclastes et fournit un modèle idéal pour l’étude du remodelage osseux en réponse à la force mécanique. Plus que cela, nous décrivons des méthodes d’analyse du remodelage osseux alvéolaire au cours de l’OTM afin de fournir une nouvelle stratégie pour l’étude de la biologie mécanique squelettique.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Ces travaux ont été financés en partie par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949) ; la Fondation des sciences naturelles de Shanghai (21ZR1436900, 22ZR1436700) ; le programme de leader de la recherche universitaire et technologique de Shanghai (20XD1422300) ; Plan de recherche clinique de la SHDC (SHDC2020CR4084) ; le Fonds de recherche interdisciplinaire du Neuvième Hôpital du Peuple de Shanghai, Faculté de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai (JYJC201902, JYJC202116) ; l’équipe de recherche sur l’innovation des universités locales de haut niveau à Shanghai (SSMUZLCX20180501) ; le Fonds pour la discipline de recherche no. KQYJXK2020 du Neuvième Hôpital du Peuple, de l’École de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai et du Collège de stomatologie de l’Université Jiao Tong de Shanghai ; Projet d’exploration original du Neuvième Hôpital du Peuple de Shanghai, École de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai (JYYC003) ; Projet de deux cents talents de la faculté de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai ; le projet de recherche coopérative de l’Institut des biomatériaux et de la médecine régénérative de l’École de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai (2022LHB02) ; le projet de biobanque du neuvième hôpital populaire de Shanghai, École de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai (YBKB201909, YBKB202216).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  P1020
4% paraformaldehyde Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1101
Alizarin red Sigma-Aldrich A5533
Anti-CTSK antibody Santa Cruz sc-48353
Anti-OPN antibody R&D Systems, Minneapolis, MN, USA AF808
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Closed-coil springs Innovative Material and Devices, Shanghai, China CS1006B
Col1α2CreERT2 mice A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences.
Dexmedetomidine hydrochloride Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTA Beyotime Biotechanology ST069
Embedding tanks Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd 80106-1100-16
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 100092183
ImageJ software NIH, Bethesda, MD, USA
Mounting medium with DAPI Beyotime Biotechanology P0131
Mouse dissection platform Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. HK105
Paraffin Sangon biotech Co., Ltd. A601889
Primers for genotyping Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease K Sigma-Aldrich 539480
Self-curing restorative resin 3M ESPE, St. Paul, MN, USA 712-035
Stat3fl/fl mice GemPharmatech Co., Ltd D000527
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648
TRAP staining kit Sigma-Aldrich 387A
Tris-HCl Beyotime Biotechanology ST780
Universal tissue fixative Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1105
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10023418
Zoletil VIRBAC 

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References

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Médecine Numéro 197 Mouvement Dentaire Orthodontique Métabolisme Osseux Force Mécanique Modèle Animal Rôle STAT3 Dans Les Ostéoblastes Modèle De Souris Inductible Au Tamoxifène Force Orthodontique Phénotype Osseux Alvéolaire Micro-CT Microscopie Stéréoscopique Analyse Histologique Ostéoblastes Ostéoclastes
Utilisation de souris knock-out <em>Stat3</em> inductibles spécifiques à la lignée ostéoblastique pour étudier le remodelage osseux alvéolaire pendant le mouvement des dents orthodontiques
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Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong,… More

Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong, X., Yang, Y., Zhu, Y., Xu, H., Jin, A., Huang, X., Gao, X., Lu, T., Liu, J., Wang, X., Dai, Q., Jiang, L. Using Inducible Osteoblastic Lineage-Specific Stat3 Knockout Mice to Study Alveolar Bone Remodeling During Orthodontic Tooth Movement. J. Vis. Exp. (197), e65613, doi:10.3791/65613 (2023).

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