Summary
本研究では、骨芽細胞系譜特異的 Stat3 ノックアウトマウスを用いて矯正力下での骨リモデリングを研究するためのプロトコールを提供し、歯列矯正歯の移動中の歯槽骨リモデリングの解析方法について記述し、骨格力学生物学に光を当てる。
Abstract
歯槽骨は、回転率が高く、体内で最も活発にリモデリングされている骨です。歯列矯正歯の移動(OTM)は、機械的な力に反応して歯槽骨をリモデリングする一般的な人工プロセスですが、根本的なメカニズムはとらえどころのないままです。これまでの研究では、動物モデルに関する制約により、いかなる時間的・空間的にも骨のリモデリングの正確なメカニズムを明らかにすることができませんでした。シグナル伝達因子および転写活性化因子3(STAT3)は骨代謝に重要であるが、OTM中の骨芽細胞におけるその役割は不明である。STAT3が特定の時点で、OTM中の特定の細胞でOTMに関与しているという in vivo の証拠を提供するために、タモキシフェン誘導性骨芽細胞系統特異的 Stat3 ノックアウトマウスモデルを作成し、歯列矯正力を適用し、歯槽骨表現型を分析しました。
マイクロコンピュータ断層撮影(Micro-CT)と実体顕微鏡を使用して、OTM距離にアクセスしました。組織学的解析により、上顎骨断面の第1大臼歯(M1)の3根以内に位置する領域を関心領域(ROI)として選択し、骨芽細胞と破骨細胞の代謝活性を評価し、歯槽骨に対する矯正力の影響を示しました。要するに、我々は、誘導可能な骨芽細胞系統特異的 Stat3 ノックアウトマウスを使用して、歯列矯正力下での骨リモデリングを研究し、OTM中の歯槽骨リモデリングを解析する方法を説明し、骨格力学生物学に新たな光を当てるプロトコルを提供します。
Introduction
骨は、ウォルフの法則1,2に従って機械的力に反応して、生涯を通じて絶え間なく再建されることが一般的に知られています。重力や日常的な運動などの適切な機械的刺激は、骨芽細胞と破骨細胞の両方を刺激することで、骨量と強度を維持し、骨量の減少を防ぎます。骨吸収3,4,5,6,7を担う破骨細胞と骨形成8,9,10を担う骨芽細胞は、骨の恒常性を維持し、骨リモデリングの生物学的プロセスにおいて共同で機能する。対照的に、長期間の微小重力下での宇宙飛行士のように、負荷刺激がない場合、骨は10%の骨密度喪失を被り、骨粗鬆症のリスクが高まります11,12。さらに、歯列矯正や伸展骨形成などの非侵襲的で便利な機械的治療が、骨疾患の治療法として登場しています13,14。これらはすべて、機械的な力が骨の質と量を維持する上で重要な役割を果たしていることを示しています。最近の研究では、一般的に、力の負荷または除荷をシミュレートするのに通常4週間以上かかるランニングホイールやテールサスペンションテストなどの時間のかかるモデルを使用して、機械的負荷に応答する骨のリモデリングを分析しました15,16。そのため、力負荷による骨のリモデリングを研究するための簡便で効率的な動物モデルが求められています。
歯槽骨は骨のリモデリングの点で最も活発で、高い代謝回転率17。不正咬合の一般的な治療法である歯列矯正歯の移動(OTM)は、機械的な力に反応して歯槽骨をリモデリングする人工的なプロセスです。しかし、迅速な骨リモデリングを誘導するOTM18は、実験期間の長い他のモデルと比較して、骨リモデリングに対する機械的力の影響を研究するための時間を節約する方法でもある。したがって、OTMは機械的刺激下での骨のリモデリングを研究するための理想的なモデルです。歯槽骨リモデリングのメカニズムは時間的制約を受けることが多く、モデリング後のある時点で歯槽骨リモデリングの変化を観察する必要があることは注目に値します。DNA組換えと組織特異性の時間的および空間的制御という2つの利点を持つ誘導性条件付き遺伝子ノックアウトマウスモデルは、OTM研究に適しています。
従来、OTMを介した歯槽骨リモデリングは、骨形成を伴う緊張ゾーンと骨吸収を伴う圧迫ゾーンに分けられてきた19,20,21が、より詳細であるが調節が困難である。さらに、Yuriらは、OTMにおける骨形成の時期が張力側と圧迫側で異なることを報告した22。さらに、以前の研究では、第1大臼歯が上顎歯槽骨の広いリモデリングを開始できることが実証されていました 歯列矯正力の下で、それは張力と圧力ゾーンに制約されていませんでした23。そこで、上顎骨断面のM1根3根以内に位置する領域を関心領域(ROI)として選択し、OTM下で歯槽骨リモデリングを評価するために、同じ領域の骨芽細胞と破骨細胞の活性を評価する方法を記載した。
核転写因子として、シグナル伝達因子および転写活性化因子3(STAT3)は、骨の恒常性維持に重要であることが証明されています24,25。以前の研究では、Stat3変異マウスの骨塩密度の低下と再発性の病理学的骨折が報告されています26,27。以前の研究では、Osx +骨芽細胞におけるStat3の欠失が頭蓋顔面奇形と骨粗鬆症、および自然骨折を引き起こすことが示されました28。最近、誘導性骨芽細胞特異的Stat3欠失マウスモデル(Col1α2CreERT2;Stat3 fl/fl、以下Stat3Col1α2ERT2と呼ぶ)は、STAT3が歯槽骨リモデリングを駆動する歯列矯正力の効果を媒介する上で重要であることを示している29。本研究では、骨芽細胞系譜特異的Stat3ノックアウトマウスを用いて、歯列矯正力下での骨リモデリングを研究するための方法とプロトコールを提供し、OTM中の歯槽骨リモデリングの解析方法について記述し、骨格力学生物学に光を当てる。
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Protocol
ここで説明する動物に関するすべての方法は、上海交通大学医学部上海第九人民病院の倫理委員会(第82101048号)によって承認されました。
1. 誘導性骨芽細胞系統特異的 Stat3 ノックアウトマウスの樹立
注: Stat3 fl/flマウスは市販のものを入手した。 Col1α2CreERT2株は贈り物でした(詳細については、 材料表 を参照してください)。標準化された実験室ペレットの餌と水、および標準的な実験室環境条件(室温22°C〜26°C、湿度50%〜55%)がすべての動物に提供されました。
- 性的に成熟した雄マウス1匹と雌マウス2匹を同じケージに入れます。18日後、毎日新生児をチェックします。妊娠中の雌マウスを空のケージに移し、必要に応じて放っておきます。雌マウスが30日以内に妊娠しない場合は、雄マウスを他の異なる繁殖ケージに入れます。
- Stat3fl/+を生成します。Stat3 fl/flマウスとCol1α2 CreERT2マウスをハイブリダイズすることによるCol1α2CreERT2マウス;これらすべてのマウスをC57BL/6の背景に置いてください。ジェノタイピングのために2〜5 mmのテールチップを収集し、男性のStat3fl / +を維持します。Col1α2CreERT2マウスを性的に成熟するまで(F1)。
- 6週齢の雄 Stat3fl / +をハイブリダイズします。Col1α2CreERT2 マウスと雌の Stat3 fl/fl マウス。マウスがジェノタイピングのために2週齢のときに2〜5 mmの尾の先端を収集し、雄の Stat3 fl/ flを維持します。 Col1α2CreERT2(Stat3Col1α2ERT2)マウスを性成熟するまで(F2)。
- 6週齢の雄Stat3 fl/ flを交配させます。Col1α2CreERT2マウスと雌のStat3 fl/flマウス(F3)。ジェノタイピングのためにマウスが2週齢のときに2〜5 mmの尾の先端を収集し、必要に応じて同じ遺伝子型の若いマウスを使用して古い繁殖マウスを交換します(F3 + N)。
注:マウスの生殖能力は生後8か月を過ぎると低下するため、繁殖ケージ内のマウスは注意深く監視し、必要に応じて交換する必要があります。また、実験要件に応じて、標的遺伝子マウスの絶滅を避けるために、繁殖ケージの数を適切に増やす必要があります。
2. タモキシフェンによるCol1α2発現骨芽細胞におけるStat3の誘導性欠失
- タモキシフェンをコーン油に20mg/mLまで遠心分離管に溶解し、ホイルで包んで光から保護します。ホイルで覆われた遠心分離管をロータリーミキサーに置き、完全に溶解するまで室温で混合します。
注:タモキシフェンは市販品で入手し、4°Cの暗所で保存しました。 - 6週齢の雄マウスを10匹選び、Stat3 fl/fl群とStat3Col1α2ERT2群に分け、各群に5匹ずつ分ける。タモキシフェン(100mg・kg-1・bw)を2日おきに腹腔内注射で1週間投与する。
3.歯列矯正歯の動き(OTM)モデル
- マウスを固定するための手術台として、滅菌されたプラスチック製のマウス解剖プラットフォームを準備します。
注:マウス解剖台は市販品で入手したもので、マウスを固定するための4本の調整可能なゴム製の支柱と1本の金属棒で構成されていた。手順全体を通して滅菌器具とツールを使用してください。 - 手足を固定するために、各ゴム製の支柱にゴムバンドを取り付けます。
- 2つの上部ゴムポストの間に1つのゴムバンドを結びます。ゴムバンドに糸を結び、下切歯を固定します。そして、金属棒に別の糸を結び、上切歯を保持します。
- 7週齢の雄マウスに、手術前に腹腔内注射により生理食塩水に溶解した塩酸デクスメデトミジン(0.1 mg·kg-1·bw)とゾレチル(20 mg·kg-1·bwの場合は塩酸チレタミンおよび20 mg·kg-1·bwの場合は塩酸ゾラゼパム)の0.1 mL溶液で麻酔をかけます。手術中、マウスが適切な麻酔を受けていることを確認してください。
注:薬の有効使用日に注意し、期限切れの薬は使用しないでください。 - マウスが適切な麻酔を受けていることを確認するために、後肢のつま先を指でつまみます。
注:マウスがテストに反応しない場合は、マウスが意識を失い、麻酔が目的の深さに達したことを意味します。その際、マウスは四肢の筋が弛緩した状態になり、呼吸や心拍数がスムーズになり、手術を開始することができます。 - マウスの目に獣医の軟膏を使用して乾燥を防ぎ、麻酔をかけたマウスを手術台の仰臥位に置きます。ゴム製の支柱に4本のゴムバンドを使用して手足を固定し、1本の糸を金属棒に取り付けて上切歯を固定し、もう1本の糸を2本の上のゴム支柱の間のゴムバンドに取り付けて下顎を引っ掛けて下顎を開いたままにします。
- 歯列矯正装置用のクローズドコイルスプリング(線径0.25mm、直径0.76mm、長さ1mm)を用意します。
注意: 各マウスのスプリングのネジ山を8本カットします。中央に長さ1mmの4本のネジ山があり、力器具用で、両端に2本のネジがあり、スチール製の結紮線を使用して結紮します。 - 上顎左第一大臼歯に準備されたスプリングの一端を結紮する。先端をQチップで切歯に接着剤を塗布した後、光硬化修復樹脂で補強された0.1mmのスチール製結紮ワイヤーで中央切歯にもう一方の端を結箮し、ダイナモメーターを使用して測定した10gの大きさの安定した力を発生させます。
- 手術終了後、回復中の同じ系統の他のマウスと一緒にマウスをケージに入れるか、各マウスを空のケージに単独で入れます。胸骨臥位を維持するために、手術後2〜4時間で十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないようにしてください。次の数日間、マウスに柔らかい食事を与え、定期的に観察して、合併症が発生しないようにし、術後の痛みの程度を確認します。必要に応じて鎮痛薬を投与します。
注:手術を受けたマウスは、完全に回復するまで他のマウスの会社に戻さないでください。術後マウスを麻酔されていないマウスと一緒に回復させないでください。回復中はマウスを暖かく保つ必要があります。 - 歯列矯正器具を毎日チェックし、脱落のある実験用マウスを除外します。
4. 検体採取
- 子宮頸管脱臼による3つの異なる時点でマウスを安楽死させます:OTM開始後4日(d4)、7日(d7)、および10日後(d10)。
- 眼科用ハサミを使用して、子宮頸部から皮膚を垂直に切断し、頭の皮膚全体を解剖して頭部を体から分離します。
- 両側角筋から下顎骨の後部までの皮膚と頬筋を切り取ります。頬側筋と烏口に付着した腱を完全に切り離して下顎骨を取り除き、余分な骨をトリミングして完全な上顎骨を取得します。次に、両側第三大臼歯の後ろの骨を取り除き、口蓋粘膜を引きちぎります。最後に、矯正器具を外し、正中口蓋縫合糸に沿って切歯間の骨を切り取り、左右の歯槽骨を取得します。
注意: 切歯から第3大臼歯までの領域が両側で無傷に保たれていることを確認してください。
5. パラフィン切片の準備
- 固定:採取した歯槽骨を4%パラホルムアルデヒドに48時間浸し、セクション6と7のドラフトで眼科用ハサミでトリミングします。
- 脱灰:検体を1x PBSで3 x 10分間静かに洗浄します。万能組織固定剤(pH 8.0)で標本を脱灰し、2日ごとに新鮮な溶液と交換し、骨が針先で容易に浸透するまで5週間行います。
- 脱水:検体を1x PBSで3 x 10分間洗浄した後、95%エタノール、100%エタノール、キシレンに各溶液2 x 1時間順次浸漬します。
- 検体をキシレンとパラフィンの1:1の混合物に30分間浸し、次に65°Cのパラフィンに一晩浸します。
- 埋め込み:適切な埋め込みタンクを選択します。歯槽骨を歯を上にして同じ高さに均一に配置します。検体を包埋タンクから取り出し、-20°Cの冷凍庫に移し、パラフィンが完全に冷却されて固まったら番号を付けます。
- ミクロトームを用いて、厚さ4μmの切片を20〜40個連続して横断面に切断し、37°Cの水に浮かべる。切片を顕微鏡スライドに接着し、42°Cで一晩焼きます。
6. OTM距離測定
- 実体顕微鏡により、咬合面から垂直に3つの時点から標本を撮影します。
- 歯槽骨をマイクロCTスキャナーでスキャンします。上顎歯槽骨の最大矢状面(3本の大臼歯が完全に見える)の3D画像を、メーカーの指示に従ってスキャナーのサポートソフトウェアを使用して再構築します。
- ImageJソフトウェアを使用してOTM距離を測定します。
- ImageJ ソフトウェアを開き、[ 直線] ツールを使用して 、既知の距離の線分を作成します。
- [解析] をクリックして [縮尺の設定] を選択し、描画したライン距離の値を [既知の距離] に入力し、[長さの単位] に単位を入力します。
- M2の近心辺縁隆起とM1の遠位辺縁隆起の中点の間に線を引き、 Measurementをクリックします。「長さ」列に表示される結果は、 OTM 距離を表します。
7.組織学的分析
- 関心領域 (ROI) の選択: 第 1 大臼歯 (M1) の歯槽骨を、上顎骨の横断面の M1 の根の 3 根以内にある ROI として定義します。この領域は、頬舌方向に第一大臼歯の皮質骨に達するだけでなく、遠位頬根と口蓋根の間の半分の領域を含む中頬根の長軸の中央にも広がっています。
- 骨形成の解析
- カルセインとアリザリンの赤色二重標識と分析
- カルセインおよびアリザリンレッド製剤:カルセインを2%NaHCO3溶液に1 mg / mLに溶解し、アリザリンレッドSをH2Oに2 mg / mLに溶解します。
注:この研究では、カルセインとアリザリンレッドを商業的に入手しました。 - 1日目にカルセイン(20 mg·kg-1·bw)を投与し、8日目にアリザリンレッドS(40 mg·kg-1·bw)をOTM開始後の腹腔内注射で投与します。10日目にマウスを安楽死させ、歯槽骨を採取します。
- 試験片を準備し、手順5.1および5.3-5.5に従って埋め込みます。詳細については、Yang et al.30 を参照してください。
- 回転式ミクロトームを用いて、厚さ5μmの切片を横面に連続的に切断する。切片を顕微鏡スライドに接着し、中性バルサムを使用してカバーガラスで取り付けます。
注:残りのサンプルは、乾燥剤を使用して室温で保存する必要があります。 - 蛍光顕微鏡で切片を検査して写真に撮り、前述の方法に従ってミネラル同置率(MAR)と骨形成率(BFR/BS)を計算する30。
- カルセインおよびアリザリンレッド製剤:カルセインを2%NaHCO3溶液に1 mg / mLに溶解し、アリザリンレッドSをH2Oに2 mg / mLに溶解します。
- 免疫蛍光法
- 適切なパラフィン切片を選択し、65°Cで30分間焼きます。
- 脱ワックス:切片をキシレンに5分間浸し、毎回新鮮なキシレンで2回繰り返します。
- 再水和:切片を95%エタノール、75%エタノール、50%エタノール、およびddH2Oにそれぞれ5分間順次浸漬します。
- 1 x PBSで切片を2 x 5分間静かに洗浄します。
- 抗原賦活化:切片をTris-HCl(0.05 M、pH 8.0)、EDTA(0.01 M、pH 8.0)、およびプロテアーゼK(10 μg/mL)の混合物にddH2Oに浸し、37°Cで15分間インキュベートします。
- 切片を1 x PBSで3 x 5分間静かに洗浄します。
- ブロック:セクションから余分な液体を取り除き、疎水性マーカーを使用してターゲット領域の周囲に円を描きます。非特異的結合を阻害するには、10%ウシ血清アルブミンを含むブロッキングバッファーで覆い、室温で1時間インキュベートします。
注意: 結果に影響を与えないように、セクションを長時間乾燥させないように注意してください。 - 一次抗体のインキュベーション:抗オステオポンチン(OPN)抗体を抗体希釈液で推奨濃度に希釈し、各サンプルに30〜50μLを添加します。加湿チャンバー内で4°Cで一晩インキュベートします。
注:抗体液が蒸発しないように、チャンバー内に水を残し、蓋をしてください。 - 切片を1 x PBSで3 x 10分間静かに洗浄します。
注意: 手順7.2.2.10〜7.2.2.12は、暗闇の中で実行する必要があります。 - 蛍光二次抗体のインキュベーション:一次抗体に対応する適切な蛍光二次抗体を選択し、推奨濃度に希釈します。各サンプルに30〜50μLを加え、室温で1時間インキュベートします。
- 1 x PBSで切片を2 x 10分間静かに洗浄します。
- 4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む褪色防止封入剤を使用して、試料をマウントします。切片は暗所に保管し、できるだけ早く写真を撮ってください。
- デジタルカメラを組み込んだ蛍光顕微鏡検査を実施して、切片を検査および写真化し、関心領域(ROI)の陽性細胞をカウントします。
- カルセインとアリザリンの赤色二重標識と分析
- 破骨細胞形成の解析
- 酒石酸耐性酸ホスファターゼ(TRAP)染色
- 適切なパラフィン切片を選択してください。手順7.2.2.1〜7.2.2.3に従ってワックスを取り除き、水分を戻します。
- メーカーの指示に従ってTRAP染色キットを使用して新鮮な染色液を調製し、37°Cに予熱します。
- 各サンプルに30〜50μLの染色液を加え、加湿チャンバー内で37°Cで20〜30分間インキュベートします。光学顕微鏡で赤い多核破骨細胞が見られるまで、5分ごとにチェックしてください。ddH2Oで反応を停止します。
- ヘマトキシリン溶液で30秒間対比染色し、1%アンモニア溶液に1分間浸漬すると、安定した青色が得られます。流れの遅い水道水ですすいでください。
- 中性バルサムを使用してカバーガラスでセクションを取り付け、一晩乾燥させます。
- 顕微鏡で写真を撮り、以前のプロトコル30に従って、3つ以上の核を持つTRAP陽性細胞の数を数えます。
- 免疫蛍光法:免疫蛍光法の推奨濃度のカテプシンK(CTSK)抗体を使用し、上記のセクション7に記載されているプロトコルに従います。
- 酒石酸耐性酸ホスファターゼ(TRAP)染色
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Representative Results
このプロトコルを用いて、誘導可能な骨芽細胞系統特異的Stat3ノックアウトマウス(Stat3Col1α2ERT2)モデルを確立し、歯列矯正の力による歯槽骨リモデリングに対するSTAT3欠失の効果を調べました(図1A、B)。骨芽細胞におけるSTAT3の欠失は、歯槽骨の免疫蛍光染色によって確認されました(図1C)。
実体顕微鏡検査では、WTマウスのOTM距離がd4、d7、およびd10で増加することが示されました。しかし、 Stat3Col1α2ERT2 マウスでは、OTM距離が短縮されました(図2B)。この現象は、d10のマイクロCT解析でも確認され、骨芽細胞の Stat3 欠失がOTMを減速させることが示されました(図2C)。
組織学的解析では、上顎骨の横断面におけるM1の3根以内に位置する領域をROIと定義し、歯槽骨リモデリングの全体的な状況を示しました(図3A)。ヘマトキシリン-エオシン染色およびOPN免疫蛍光染色により、ROIの歯槽骨全体が明らかになりました(図3B、C)。
骨形成解析では、アリザリンレッドとカルセイン標識により、歯列矯正力がWTマウスの歯槽骨のミネラル同位率(MAR)を増加させることが示されましたが、Stat3Col1α2ERT2マウスのOTM群ではWTマウスと比較してMARが低下しました(図4A)。さらに、免疫蛍光染色では、歯列矯正下でOPN+骨芽細胞の数が増加したことが示されましたが、Stat3Col1α2ERT2マウスのOTM群ではWTマウスよりもOPN+骨芽細胞が少なかったことが示されました(図4B)。破骨細胞形成解析では、TRAP染色により、歯列矯正力下で破骨細胞の数がWTマウスで増加したが、Stat3Col1α2ERT2マウスのOTM群ではWTマウスよりも破骨細胞の数が少なかったことが示された(図4C)。この現象は、CTSKの免疫蛍光染色によっても確認されました(図4D)。これらの結果から、骨芽細胞性Stat3欠損症は、歯の矯正力と歯の移動中の骨リモデリング障害に応答して、骨芽細胞と破骨細胞の両方の活性を低下させることが明らかになりました。
図1:誘導性骨芽細胞系統特異的Stat3ノックアウトマウスモデル作製。 (A)タモキシフェンによって誘導されたCol1α2発現骨芽細胞におけるStat3ノックアウトの模式図(左)。実験のスキーム:6週齢の雄の野生型マウスとStat3Col1ERT2マウスに、OTMモデル構築前の1週間から2日おきにTA(100 mg·kg-1·bw)を投与し、OTM後のd4、d7、d10の解析のために犠牲にした(右)。(B)誘導性骨芽細胞系統特異的Stat3ノックアウトマウスのハイブリダイゼーションの進行。(C)OTM後のd10のWTおよびStat3Col1ERT2マウスの肺胞骨におけるSTAT3およびOPNの二重免疫蛍光染色、および非OTM側およびOTM側の二重陽性細胞の定量。n = 5です。スケールバー = 50 μm。この図は Gong et al. 26 によるものです。略語: STAT3 = シグナルトランスデューサーおよび転写アクチベーター 3;Col1α = コラーゲン 1-α;TA = タモキシフェン;WT = 野生型;OTM = 歯列矯正の歯の動き;OPN = オステオポンチン;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:Stat3による歯列矯正の歯の動きを減速させた骨芽細胞の欠損 (A) in vivoでのOTMモデルの模式図。バネは切歯と第一大臼歯(M1)の間に結紮し、歯列矯正力を誘発してM1を近心隆起に向かって移動させました。(B)WTマウスおよび Stat3Col1α2ERT2 マウスにおけるOTM後のd0、d4、d7、およびd10のOTM距離。(C)マイクロCTによるOTM後のd10のWTおよび Stat3Col1α2ERT2 マウスの非OTM側とOTM側の代表画像。n = 5 です。スケールバー = 1 mm (B)、500 μm (C)。この図は Gong et al.26 によるものです。略語: STAT3 = シグナルトランスデューサーおよび転写アクチベーター 3;Col1α = コラーゲン 1-α;WT = 野生型;OTM = 歯列矯正の歯の動き;SAG = 矢状面。破線はOTM距離を示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:関心領域の図。 (A)ROIの領域の模式図。上顎骨の断面の M1 の 3 つの根の内側に位置する点線領域が ROI として選択されました。M1の3つの根には、中頬側根、遠位頬側根、口蓋根が含まれます。(B)マウスにおけるM1の歯槽骨全体のHE染色。(C)マウスのM1歯槽骨全体におけるOPNの免疫蛍光染色。スケールバー = 200 μm (B)、100 μm (C)。この図は Gong et al.26 によるものです。略語:ROIs =関心領域。MB =中頬根;DB = 腱内根;P =口蓋根;HE = ヘマトキシリン - エオシン;OPN = オステオポンチン;PDL = 歯根膜。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:Stat3の骨芽細胞欠損は、歯列矯正の力による骨の形成と吸収を損ないます。 (A)OTM中のWTおよびStat3Col1α2ERT2マウスにおけるカルセインおよびアリザリンレッドSによる連続蛍光色素標識およびミネラルアポジション率の定量化。n = 5 です。(B)WTおよびStat3Col1α2ERT2マウスのOTM後のd10歯槽骨におけるOPN+細胞の免疫蛍光染色および定量。n = 5 です。(C)WTおよびStat3Col1α2ERT2マウスのOTM後のd4歯槽骨におけるTRAP陽性細胞のTRAP染色および定量。n = 5 です。(D)WTおよびStat3Col1α2ERT2マウスのOTM後のd4歯槽骨中のCTSK+細胞の免疫蛍光染色と定量。n = 5 です。スケールバー = 10 μm (A)、50 μm (B-D)。この図は Gong et al.26 によるものです。略語: STAT3 = シグナルトランスデューサーおよび転写アクチベーター 3;Col1α = コラーゲン 1-α;WT = 野生型;OTM = 歯列矯正の歯の動き;OPN = オステオポンチン;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;TRAP = 酒石酸耐性酸ホスファターゼ;MAR = 鉱物のアポジション率CTSK = カテプシン K. この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
不正咬合は、呼吸、咀嚼、発話、さらには外見を損なう最も一般的な口腔疾患の1つであるため、歯列矯正の需要は日々増加しており、以前の疫学調査によると、発生率は70%から93%に上昇しています31,32。歯槽骨リモデリングをいかに加速し、安全に矯正治療の効率を上げるかが、この分野で話題になっています。そのため、OTMによる歯槽骨リモデリングのメカニズムを解明する必要があります。以前の研究では、研究者はin vivo薬物注射を使用して動物モデル21,33でOTMのメカニズムを研究していましたが、これは単純で簡単でしたが、他のシステムの細胞に対する薬物の影響を除外することは困難でした。そのため、歯列矯正力下での骨リモデリングのメカニズムを生体内で研究することが強く求められています。
近年、遺伝子ノックアウトマウスが広く使用されており、遺伝子機能の研究と治療標的の探索のための強固な基盤を提供している34。これらの技術の中で、全遺伝子ノックアウト技術が最も初期のアプローチでした。Adrb2-/- アドレナリン受容体(Adrb2)ノックアウトマウスモデルを使用して、OTM35中の歯槽骨リモデリングにおける交感神経系の役割を調査しました。しかし、全遺伝子ノックアウトマウスは、場合によっては胚致死をもたらし、遺伝子機能の研究を妨げる可能性があります。そこで、特定の細胞種の遺伝子を標的としたコンディショナルノックアウトマウスが開発されました。しかし、歯槽骨のリモデリングに関する研究は時間的制約が多いため、モデリング後の特定の時点での歯槽骨の変化を観察する必要があります。
誘導可能な条件付き遺伝子ノックアウトマウスは、DNA組換えと組織特異性の時間的および空間的制御という二重の利点を有し、遺伝子ノックアウトは、薬物またはホルモンの適用を通じて特定の時点および特定の組織で達成することができ、研究ニーズをよりよく満たすことができる。さらに、STAT3は骨やその他の組織に広く発現する転写因子であり、細胞の増殖、分化、アポトーシス、免疫などの重要な機能を調節する機能を持っています25。我々は以前、非誘導骨芽細胞特異的Stat3ノックアウトマウスの骨塩密度が低下したことを報告し28、非誘導条件付きStat3ノックアウトマウスは、発生の影響を排除する必要がある歯槽骨リモデリングのメカニズム研究には適していないことを示唆している。
そこで本研究では、時間的・空間的に制御可能で歯槽骨リモデリングのメカニズムの研究に適しており、特定の細胞や遺伝子の機能のさらなる研究と系統追跡の組み合わせを可能とするCre/loxPシステムに基づく誘導性条件付き遺伝子ノックアウト技術を用いて、タモキシフェン誘導性骨芽細胞特異的Stat3遺伝子ノックアウトマウスStat3Col1α2ERT2を作製しました。タモキシフェンが誘導される前は、Stat3Col1α2ERT2と野生型マウスの間に明らかな違いはなく、繁殖において特別な違いはありませんでした。我々は以前、Col1α2+骨芽細胞におけるStat3の誘導的欠失が、成体マウスの骨形成を損ない、骨量を減少させることを発見した28。この研究では、非OTM群のStat3Col1α2ERT2マウスの骨代謝レベルが低下し、以前の結果と一致しました。また、歯列矯正の力に応答してOTM群の骨代謝レベルが有意に低下したことから、Stat3は力学的力による骨代謝の調節に重要な役割を担っていると考えられる。さらに、Stat3によって制御される骨リモデリングのメカニズムを探りました。その結果、Stat3は骨芽細胞の分化を直接促進し28,29、Mmp3転写の調節を介して骨芽細胞と破骨細胞の間のクロストークを調節することで破骨細胞の分化に影響を与えることが示された29。
このプロトコルでは、マウスの上顎骨の断面におけるM1の3根以内に位置する領域をROIとして選択し、歯槽骨のリモデリングを評価しました。この領域では、歯槽骨の分析は、異なる側面の特徴を分析する従来の方法ではなく、骨形成と破骨細胞形成の活性を同じ領域で分析する長骨の分析に近くなります。さらに、古典的な仮説によると、歯の移動速度を加速するために、圧力側と張力側にそれぞれ反対の効果を持つ2つの薬を適用する必要があります。この手法は、これらのボトルネックを克服するための理論的基礎を提供しました。このOTMモデルでは、ダイナモメーターを用いて歯列矯正力の大きさを測定しました。ただし、力は、第一大臼歯と切歯の間の距離が短くなるにつれてわずかに減衰します。したがって、より一定で安定した歯列矯正力を生成するために、標準化された機械システムを確立する必要があります。
プロトコル内には、心に留めておくべきいくつかの重要なステップがあります。まず、OTMモデル構築の過程で、第1大臼歯と切歯をしっかりと結紮して、脱落による力加えの失敗を回避する必要があります。第二に、力の方向に注意を払う必要があり、垂直方向の力の加えによって引き起こされる抜歯を避けるために、第一大臼歯に水平力を加える必要があります。最後に、埋め込むときは、目的の断面に応じて試験片の向きを決定し、理想的な断面を得るために向きを調整するために切片を時間内に観察する必要があります。
結論として、OTMの誘導可能な特異的遺伝子ノックアウトマウスモデルのプロトコルを提供し、さまざまな時点での歯槽骨のリモデリングを明らかにします。さらに、これを使用して、系統追跡と組み合わせた特定の細胞や遺伝子の機能を研究します。その後、OTMメカニズム研究の分野で動的で細胞特異的なin vivo パターンを設定し、臨床での歯列矯正のエビデンスを提供します。また、骨芽細胞や破骨細胞を刺激することで迅速な骨リモデリングを可能とするOTMモデルを構築するための詳細なプロトコルを提供し、力学的な力に応答した骨リモデリングの研究に理想的なモデルを提供します。さらに、骨格力学研究のための新しい戦略を提供するために、OTM中の歯槽骨リモデリングを解析する方法について説明します。
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Disclosures
著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究の一部は、中国国家自然科学基金会(81870740、82071083、82271006、82101048、81800949)からの助成金によって支援されました。上海自然科学基金会(21ZR1436900、22ZR1436700);上海学術/技術研究リーダー(20XD1422300)のプログラム。SHDCの臨床研究計画(SHDC2020CR4084);上海交通大学医学部上海第九人民病院の学際的研究基金(JYJC201902、JYJC202116);上海のハイレベル地方大学のイノベーション研究チーム(SSMUZLCX20180501);研究規律基金番号。上海交通大学医学部第九人民病院および上海交通大学口腔病学院KQYJXK2020。上海交通大学医学部上海第九人民病院のオリジナル探査プロジェクト(JYYC003);上海交通大学医学部の200人の才能プロジェクト。上海交通大学医学部生体材料・再生医療研究所共同研究プロジェクト(2022LHB02);上海交通大学医学部上海第九人民病院バイオバンクプロジェクト(YBKB201909年、YBKB202216年)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P1020 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1101 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Anti-CTSK antibody | Santa Cruz | sc-48353 | |
| Anti-OPN antibody | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | AF808 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Closed-coil springs | Innovative Material and Devices, Shanghai, China | CS1006B | |
| Col1α2CreERT2 mice | A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. | ||
| Dexmedetomidine hydrochloride | Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site | ||
| EDTA | Beyotime Biotechanology | ST069 | |
| Embedding tanks | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 80106-1100-16 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092183 | |
| ImageJ software | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| Mounting medium with DAPI | Beyotime Biotechanology | P0131 | |
| Mouse dissection platform | Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. | HK105 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| Primers for genotyping | Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC | ||
| Protease K | Sigma-Aldrich | 539480 | |
| Self-curing restorative resin | 3M ESPE, St. Paul, MN, USA | 712-035 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Tris-HCl | Beyotime Biotechanology | ST780 | |
| Universal tissue fixative | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1105 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 | |
| Zoletil | VIRBAC |
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