Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Användning av inducerbara osteoblastiska härstamningsspecifika Stat3 knockout-möss för att studera alveolär benremodellering under ortodontisk tandrörelse

Published: July 21, 2023 doi: 10.3791/65613
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, *6, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 2,3,4,5,7, 1,2,3,4,5
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University, 3National Center for Stomatology, 4National Clinical Research Center for Oral Diseases, 5Shanghai Key Laboratory of Stomatology, 6Shanghai Starriver Bilingual School, 7The 2nd Dental Center, Ninth People’s Hospital, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Denna studie ger ett protokoll för att använda inducerbara osteoblast-linjespecifika Stat3 knockout-möss för att studera benremodellering under ortodontisk kraft och beskriver metoder för att analysera alveolär benremodellering under ortodontisk tandrörelse, vilket belyser skelettmekanisk biologi.

Abstract

Det alveolära benet, med hög omsättningshastighet, är det mest aktivt omformande benet i kroppen. Ortodontisk tandrörelse (OTM) är en vanlig konstgjord process för alveolär benombyggnad som svar på mekanisk kraft, men den underliggande mekanismen är fortfarande svårfångad. Tidigare studier har inte kunnat avslöja den exakta mekanismen för benremodellering i någon tid och rum på grund av djurmodellrelaterade restriktioner. Signalomvandlaren och aktivatorn för transkription 3 (STAT3) är viktig för benmetabolismen, men dess roll i osteoblaster under OTM är oklar. För att ge in vivo-bevis för att STAT3 deltar i OTM vid specifika tidpunkter och i särskilda celler under OTM, genererade vi en tamoxifen-inducerbar osteoblast-linjespecifik Stat3 knockout-musmodell, applicerade ortodontisk kraft och analyserade den alveolära benfenotypen.

Mikrodatortomografi (Micro-CT) och stereomikroskopi användes för att komma åt OTM-avstånd. Histologisk analys valde området som ligger inom tre rötter av den första molaren (M1) i tvärsnittet av maxillärbenet som intresseområde (ROI) för att utvärdera den metaboliska aktiviteten hos osteoblaster och osteoklaster, vilket indikerar effekten av ortodontisk kraft på alveolarbenet. I korthet tillhandahåller vi ett protokoll för att använda inducerbara osteoblast-linjespecifika Stat3 knockout-möss för att studera benremodellering under ortodontisk kraft och beskriva metoder för att analysera alveolär benremodellering under OTM, vilket kastar nytt ljus över skelettmekanisk biologi.

Introduction

Det är allmänt känt att ben är under ständig rekonstruktion under hela livet, som svar på mekaniska krafter enligt Wolffs lag 1,2. Lämplig mekanisk stimulering, såsom gravitation och daglig motion, bibehåller benmassa och styrka och förhindrar benförlust genom att stimulera både osteoblaster och osteoklaster. Osteoklaster, som ansvarar för benresorption3,4,5,6,7, och osteoblaster, som ansvarar för benbildning 8,9,10, upprätthåller benhomeostas och fungerar gemensamt i den biologiska processen för benombyggnad. Däremot, i frånvaro av belastningsstimuli, som hos astronauter under långvarig mikrogravitation, drabbas benen av 10 % förlust av bentäthet, vilket ökar risken för osteoporos11,12. Dessutom har icke-invasiva och bekväma mekaniska terapier, inklusive ortodonti och distraktionsosteogenes, dykt upp som behandlingar för bensjukdomar13,14. Alla dessa har visat att mekanisk kraft spelar en avgörande roll för att upprätthålla benkvalitet och kvantitet. Nyligen genomförda studier analyserade i allmänhet benremodellering som svar på mekanisk belastning med hjälp av tidskrävande modeller som löphjuls- och svansfjädringstester, som vanligtvis tog 4 veckor eller mer för att simulera kraftbelastning eller avlastning15,16. Därför finns det en efterfrågan på en bekväm och effektiv djurmodell för att studera benombyggnad som drivs av kraftbelastning.

Det alveolära benet är det mest aktiva när det gäller benombyggnad, med en hög omsättningshastighet17. Ortodontisk tandrörelse (OTM), en vanlig behandling för bettfel, är en konstgjord process för alveolär benombyggnad som svar på mekanisk kraft. Men OTM, som inducerar snabb benremodellering18, är också ett tidsbesparande sätt att studera effekterna av mekanisk kraft på benremodellering jämfört med andra modeller med lång experimentperiod. Därför är OTM en idealisk modell för att studera benombyggnad under mekaniska stimuli. Det är anmärkningsvärt att mekanismen för alveolär benremodellering ofta är tidskänslig, och det är nödvändigt att observera förändringarna i alveolär benremodellering vid vissa tidpunkter efter modellering. Med de dubbla fördelarna med tidsmässig och rumslig kontroll av DNA-rekombination och vävnadsspecificitet är en inducerbar betingad genknockoutmusmodell ett lämpligt val för OTM-studier.

Konventionellt har OTM-medierad alveolär benremodellering delats in i spänningszoner som involverar benbildning och tryckzoner som involverar benresorption 19,20,21, vilket är mer detaljerat men svårt att reglera. Vidare rapporterade Yuri et al. att tiden för benbildning vid OTM skilde sig åt på spännings- och kompressionssidan22. Dessutom hade en tidigare studie visat att den första kindtanden kunde initiera en bred ombyggnad av det maxillära alveolära benet under ortodontisk kraft, som inte var begränsad till spännings- och tryckzonerna23. Därför valde vi området som ligger inom tre rötter av M1 i tvärsnittet av maxillärbenet som intresseområde (ROI) och beskrev metoder för att bedöma aktiviteten hos osteoblaster och osteoklaster i samma område för att utvärdera alveolär benremodellering under OTM.

Som en nukleär transkriptionsfaktor har signalomvandlare och aktivator av transkription 3 (STAT3) visat sig vara avgörande för benhomeostas24,25. Tidigare studier har rapporterat låg bentäthet och återkommande patologiska frakturer hos Stat3-muterade möss26,27. Vår tidigare studie visade att deletion av Stat3 i Osx+ osteoblaster orsakade kraniofaciala missbildningar och osteoporos, samt spontana benfrakturer28. Nyligen tillhandahöll vi in vivo-bevis med en inducerbar osteoblastspecifik Stat3-deletionsmusmodell (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, hädanefter kallad Stat3Col1α2ERT2) att STAT3 är avgörande för att förmedla effekterna av ortodontisk kraft som driver alveolär benombyggnad29. I denna studie tillhandahåller vi metoder och protokoll för att använda inducerbara osteoblast-linjespecifika Stat3 knockout-möss för att studera benremodellering under ortodontisk kraft och beskriva metoder för att analysera alveolär benremodellering under OTM, vilket belyser skelettmekanisk biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoder som involverar djur som beskrivs här har godkänts av den etiska kommittén vid Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (nr 82101048).

1. Etablering av inducerbara osteoblastlinjespecifika Stat3 knockout-möss

OBS: Stat3 fl/fl-möss erhölls kommersiellt; Col1α2CreERT2-stammenvar en gåva (se materialtabellen för alla detaljer). Standardiserad laboratoriepelletsmat och vatten och standardmiljöförhållanden i laboratoriet (rumstemperatur vid 22 °C till 26 °C och luftfuktighet vid 50%-55%) tillhandahölls för alla djur.

  1. Sätt en könsmogen hanmus med två honmöss i samma bur. Efter 18 dagar ska du kontrollera om det finns nyfödda barn varje dag. Flytta alla dräktiga honmöss till en tom bur och håll dem ensamma om det behövs. Sätt hanmöss i andra olika avelsburar om honmössen inte är dräktiga inom 30 dagar.
  2. Generera Stat3fl/+; Col1α2 CreERT2-möss genom hybridisering av Stat3 fl/fl-möss med Col1α2CreERT2-möss. underhåll alla dessa möss på C57BL/6-bakgrunden. Samla in 2-5 mm stjärtspetsar för genotypning och behåll hanen Stat3fl/+; Col1α2CreERT2-möss tills de är könsmogna (F1).
  3. Hybridisera 6 veckor gammal hane Stat3fl/ +; Col1α2CreERT2-möss med honmöss av typen Stat3 fl/fl. Samla in 2-5 mm svansspetsar när mössen är 2 veckor gamla för genotypning, och behåll hanen Stat3 fl/fl; Col1α2 CreERT2(Stat3Col1α2ERT2) möss tills de är könsmogna (F2).
  4. Hybridisera 6 veckor gammal hane Stat3 fl/fl; Col1α2CreERT2-möss med honmöss av typen Stat3 fl/fl (F3). Samla in 2-5 mm svansspetsar när mössen är 2 veckor gamla för genotypning, och använd de yngre mössen av samma genotyp för att ersätta äldre avelsmöss när det är lämpligt (F3+N).
    OBS: Mössens reproduktionsförmåga minskar efter 8 månaders ålder, så mössen i avelsburarna måste övervakas noggrant och bytas ut vid behov. Dessutom bör antalet avelsburar ökas på lämpligt sätt för att undvika att mössen dör ut.

2. Inducerbar deletion av Stat3 i kol1α2-uttryckande osteoblaster med tamoxifen

  1. Lös tamoxifen i majsolja till 20 mg/ml i ett centrifugrör och skydda mot ljus genom att linda in i folie. Lägg det folietäckta centrifugröret på en roterande mixer och blanda i rumstemperatur tills det är helt upplöst.
    OBS: Tamoxifen erhölls kommersiellt och förvarades i mörker vid 4 °C.
  2. Välj ut tio 6 veckor gamla hanmöss och dela in dem i grupperna Stat3 fl/fl och Stat3 Col1α2ERT2 med fem möss i varje grupp. Administrera tamoxifen (100 mg·kg-1·kroppsvikt) varannan dag i 1 vecka genom intraperitoneal injektion.

3. Modell för ortodontisk tandrörelse (OTM)

  1. Förbered en steriliserad dissektionsplattform av plast som operationsbord för att immobilisera mössen.
    OBS: Musdissektionsbordet erhölls kommersiellt och bestod av fyra justerbara gummistolpar och en metallstång för immobilisering av mössen. Använd sterila instrument och verktyg under hela proceduren.
  2. Fäst ett elastiskt band på varje gummistolpe för fixering av extremiteter.
  3. Knyt ett elastiskt band mellan de två övre gummistolparna; Knyt en tråd till det elastiska bandet för att hålla de nedre framtänderna; och knyt en annan tråd till metallstången för att hålla de övre framtänderna.
  4. Bedöva 7 veckor gamla hanmöss med 0,1 ml lösning av dexmedetomidinhydroklorid (0,1 mg·kg-1·kroppsvikt) och zoletil (tiletaminhydroklorid i 20 mg·kg-1·bw och zolazepamhydroklorid i 20 mg·kg-1·bw) upplöst i koksaltlösning genom intraperitoneal injektion före operation. Se till att mössen är under ordentlig bedövning under hela operationen.
    OBS: Var uppmärksam på det effektiva användningsdatumet för läkemedel och använd inte utgångna läkemedel.
  5. Bekräfta att mössen är under ordentlig bedövning genom att klämma på tårna på bakbenen med fingrarna.
    OBS: Om mössen inte svarar på testet betyder det att de är medvetslösa och att bedövningen har nått önskat djup. Vid den tidpunkten är mössen i ett tillstånd av muskelavslappning i armar och ben, med jämn andning och hjärtfrekvens, och operationen kan påbörjas.
  6. Använd veterinärsalva på mössens ögon för att förhindra torrhet och placera den sövda musen i ryggläge på operationsbordet. Använd fyra elastiska band på gummistolparna för att fixera lemmarna, en tråd fäst vid metallstången för att hålla de övre framtänderna och en annan fäst vid ett elastiskt band mellan de två övre gummistolparna för att haka över de nedre framtänderna för att hålla underkäken öppen.
  7. Förbered slutna spiralfjädrar (0.25 mm trådstorlek, 0.76 mm diameter, 1 mm längd) för ortodontisk kraftapparat.
    OBS: Klipp åtta trådar av fjäder för varje mus. Fyra gängor på 1 mm längd i mitten för kraftapparat och två gängor i varje ände för ligaturering med hjälp av stålligaturtråd.
  8. Ligate ena änden av fjädern beredd till överkäkens vänstra första kindtand. Fäst den andra änden på den centrala framtanden med en 0,1 mm ligaturtråd av stål förstärkt med ljushärdande restaureringsharts efter applicering av lim på framtänderna med Q-spetsen för att generera en stabil kraft på 10 g mätt med hjälp av en dynamometer.
  9. När operationen är klar, sätt mössen i en bur med andra av samma stam i återhämtning, eller sätt varje mus i en tom bur ensam. Se till att mössen inte lämnas utan uppsikt förrän de har återfått tillräckligt medvetande 2−4 timmar efter operationen för att bibehålla sternal recumbency. Under de närmaste dagarna, mata mössen med en mjuk diet och observera dem regelbundet för att säkerställa att inga komplikationer uppstår och för att fastställa graden av postoperativ smärta; administrera smärtstillande läkemedel vid behov.
    OBS: Möss som har genomgått operation ska inte returneras till sällskap med andra möss förrän de är helt återställda. Sätt inte postoperativa möss i återhämtning med möss som inte är sövda. Möss måste hållas varma under återhämtningen.
  10. Kontrollera tandregleringen varje dag och uteslut alla försöksmöss med lossning.

4. Insamling av prover

  1. Avliva mössen vid tre olika tidpunkter via cervikal dislokation: 4 dagar (d4), 7 dagar (d7) och 10 dagar (d10) efter start av OTM.
  2. Använd en ögonsax för att klippa av huden vertikalt från livmoderhalsregionen och separera sedan huvudet från kroppen med hela huden på huvudet dissekerat.
  3. Skär av huden och buccinatormusklerna från den bilaterala angulus oris till den bakre delen av underkäken. Koppla helt bort de buckala musklerna och senorna som är fästa vid coracoiderna för att ta bort underkäken och trimma extra ben för att få kompletta överkäkar. Ta sedan bort benet bakom de bilaterala tredje kindtänderna och riv av gomslemhinnan. Koppla slutligen bort ortodontiapparaten och skär av benet mellan framtänderna längs medianussuturen för att få det alveolära benet på höger och vänster sida.
    OBS: Se till att området från framtänderna till den tredje kindtanden hålls intakt på båda sidor.

5. Förberedelse för paraffinsektion

  1. Fixering: Sänk ner det skördade alveolära benet i 4 % paraformaldehyd i 48 timmar och trimma med en ögonsax i dragskåpet för sektionerna 6 och 7.
  2. Avkalkning: Tvätta försiktigt proverna med 1x PBS i 3 x 10 min. Avkalka proverna i universellt vävnadsfixeringsmedel (pH 8,0), ersätt med färsk lösning varannan dag, i 5 veckor tills benen lätt kan penetreras av en nålspets.
  3. Uttorkning: Tvätta proverna i 1x PBS i 3 x 10 minuter och sänk sedan ner dem sekventiellt i 95 % etanol, 100 % etanol och xylen, i 2 x 1 timme varje lösning.
  4. Sänk ner proverna i en 1:1-blandning av xylen och paraffin i 30 minuter och sedan i paraffin vid 65 °C över natten.
  5. Inbäddning: Välj lämpliga inbäddningstankar. Placera det alveolära benet jämnt med tänderna upp på samma nivå. Ta ut proverna från inbäddningstanken och överför dem till en frys på -20 °C, numrera dem sedan när paraffinet är helt kylt och fast.
  6. Skär tjugo till fyrtio 4 μm tjocka sektioner kontinuerligt i tvärplanet med hjälp av en mikrotom och låt dem flyta på 37 °C vatten. Fäst sektionerna på objektglasen och grädda vid 42 °C över natten.

6. Mätning av OTM-avstånd

  1. Fotografera prover från tre tidpunkter vertikalt från ocklusalplanet med stereomikroskopi.
  2. Skanna det alveolära benet med en Micro-CT-skanner. Rekonstruera 3D-bilder av maxillära alveolära benets maximala sagittalplan, där tre kindtänder är helt synliga, med hjälp av skannerns stödprogramvara enligt tillverkarens instruktioner.
  3. Mät OTM-avståndet med hjälp av ImageJ-programvaran:
    1. Öppna programvaran ImageJ och använd verktyget Rak linje för att skapa ett linjesegment med känt avstånd.
    2. Klicka på Analysera och välj Ställ in skala för att ange värdet på det ritade linjeavståndet i Känt avstånd och ange enheter i Längdenhet.
    3. Rita en linje mellan mittpunkterna på den mesiala marginalåsen på M2 och den distala marginalåsen på M1 och klicka på Mätning. Resultaten som visas i kolumnen Längd representerar OTM-avståndet.

7. Histologisk analys

  1. Val av intresseområde (ROI): Definiera det alveolära benet i den första kindtanden (M1) som ROI, beläget exakt inom tre rötter av M1 i den tvärgående sektionen vid överkäksbenet. Denna region når inte bara det kortikala benet i den första kindtanden i buccal-lingual riktning, utan sträcker sig också till mitten av den långa axeln av mesiobukalkroten, inklusive halvområdet mellan distobuccal rot och palatalrot.
  2. Analys av osteogenes
    1. Kalcein och alizarin röd dubbel märkning och analys
      1. Kalcein och alizarin rött preparat: Lös kalcein i 2% NaHCO3-lösning till 1 mg/ml och alizarinrött S i H 2 O till2mg/ml.
        OBS: I denna studie erhölls calcein och alizarinrött kommersiellt.
      2. Administrera kalcein (20 mg·kg-1·kroppsvikt) på dag 1 och alizarinrött S (40 mg·kg-1·kroppsvikt) på dag 8 genom intraperitoneal injektion efter påbörjad behandling med OTM. Avliva mössen på dag 10 och skörda alveolarbenet.
      3. Förbered proverna och bädda in dem enligt steg 5.1 och 5.3-5.5. För mer information, se Yang et al.30.
      4. Använd en roterande mikrotom och skär 5 μm tjocka sektioner kontinuerligt i tvärplanet. Fäst sektionerna på objektglasen och montera med täckglas med neutral balsam.
        OBS: Resten av proverna måste förvaras med torkmedel i rumstemperatur.
      5. Undersök och fotografera snitten i fluorescensmikroskop och beräkna mineralappositionshastigheten (MAR) och benbildningshastigheten (BFR/BS) enligt den tidigare beskrivna metoden30.
    2. Immunofluorescens
      1. Välj lämpliga paraffindelar och grädda i 65 °C i 30 min.
      2. Avvaxning: Sänk ner sektionerna i xylen i 5 minuter och upprepa två gånger med färsk xylen varje gång.
      3. Rehydrering: Sänk ner sektionerna sekventiellt i 95 % etanol, 75 % etanol, 50 % etanol och ddH2O, var och en i 5 minuter.
      4. Tvätta försiktigt sektionerna med 1 x PBS i 2 x 5 min.
      5. Antigenuttag: Sänk ned sektionerna i en blandning av Tris-HCl (0,05 M, pH 8,0), EDTA (0,01 M, pH 8,0) och proteas K (10 μg/ml) i ddH2O och inkubera vid 37 °C i 15 minuter.
      6. Tvätta försiktigt sektionerna med 1 x PBS i 3 x 5 min.
      7. Block: Ta bort överflödig vätska från sektionerna och rita en cirkel runt målområdet med hjälp av en hydrofob markör. För att blockera ospecifik bindning, täck med en blockerande buffert som innehåller 10 % bovint serumalbumin och inkubera i rumstemperatur i 1 timme.
        OBS: Var försiktig så att du inte torkar sektionerna för länge, så att resultatet inte påverkas.
      8. Primär antikroppsinkubation: Späd antikroppen mot osteopontin (OPN) med spädningsvätska till den rekommenderade koncentrationen och tillsätt 30–50 μl till varje prov. inkuberas vid 4 °C över natten i en fuktad kammare.
        OBS: Se till att lämna lite vatten i kammaren och täck över den för att förhindra att antikroppsvätskan avdunstar.
      9. Tvätta försiktigt sektionerna med 1 x PBS i 3 x 10 min.
        OBS: Steg 7.2.2.10-7.2.2.12 bör utföras i mörker.
      10. Inkubation av fluorescerande sekundära antikroppar: Välj en lämplig fluorescerande sekundär antikropp som motsvarar den primära antikroppen och späd den till den rekommenderade koncentrationen. Tillsätt 30–50 μl till varje prov och inkubera i rumstemperatur i 1 timme.
      11. Tvätta försiktigt sektionerna med 1 x PBS i 2 x 10 min.
      12. Använd ett antifade-monteringsmedium med 4'6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) för att montera proverna. Förvara sektionerna i mörker och fotografera dem så snart som möjligt.
      13. Utföra fluorescensmikroskopi med en digitalkamera för att undersöka och fotografera snitten och räkna positiva celler i de intressanta områdena (ROI).
  3. Analys av osteoklastogenes
    1. Tartratresistent syrafosfatas (TRAP) färgning
      1. Välj lämpliga paraffinsektioner. Avvaxa och rehydrera enligt steg 7.2.2.1-7.2.2.3.
      2. Bered ny infärgningslösning med TRAP-färgningssatsen enligt tillverkarens anvisningar och förvärm till 37 °C.
      3. Tillsätt 30–50 μl färgningslösning till varje prov och inkubera vid 37 °C i en fuktad kammare i 20–30 minuter. Kontrollera var 5:e minut tills röda multinukleära osteoklaster ses under ett ljusmikroskop. Stoppa reaktionen med ddH2O.
      4. Motfärga i hematoxylinlösning i 30 s och doppa i 1% ammoniaklösning i 1 min för stabil blå färg. Skölj under långsamt rinnande kranvatten.
      5. Montera sektionerna med täckglas med neutral balsam och torka över natten.
      6. Ta bilder i mikroskop och räkna antalet TRAP-positiva celler med fler än tre kärnor, enligt vårt tidigare protokoll30.
    2. Immunofluorescens: Använd cathepsin K (CTSK)-antikropp i den rekommenderade koncentrationen för immunofluorescens och följ protokollet som beskrivs i avsnitt 7 ovan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med hjälp av detta protokoll etablerade vi en inducerbar osteoblast-härstamningsspecifik Stat3 knockout-musmodell (Stat3Col1α2ERT2) för att undersöka effekterna av STAT3-deletion på ortodontisk kraftdriven alveolär benremodellering (Figur 1A,B). STAT3-deletion i osteoblaster bekräftades genom immunofluorescensfärgning av alveolarbenet (Figur 1C).

Stereomikroskopi indikerade att OTM-avståndet för WT-möss ökade på d4, d7 och d10. Hos Stat3Col1α2ERT2-möss minskade dock OTM-avståndet (figur 2B). Detta fenomen bekräftades också av Micro-CT-analys på d10, vilket indikerar att osteoblastisk Stat3-deletion bromsade OTM (Figur 2C).

För histologisk analys definierades området inom tre rötter av M1 i det tvärgående snittet vid överkäksbenet som ROI, vilket visar den övergripande situationen för alveolär benremodellering (Figur 3A). Hematoxylin-eosinfärgningen och OPN immunfluorescensfärgningen visade hela det alveolära benet av ROI (Figur 3B,C).

För osteogen analys indikerade alizarinrött och kalceinmärkning att ortodontisk kraft ökade mineralappositionshastigheten (MAR) för alveolarben hos WT-möss, men MAR i OTM-gruppen hos Stat3Col1α2ERT2-möss minskade jämfört med WT-mössen (Figur 4A). Dessutom visade immunofluorescensfärgning att antalet OPN+-osteoblaster ökade under ortodontisk kraft, men det fanns färre OPN+-osteoblaster i OTM-gruppen hos Stat3Col1α2ERT2-möss än i WT-mössen (Figur 4B). För osteoklastogen analys indikerade TRAP-färgning att antalet osteoklaster ökade hos WT-möss under ortodontisk kraft, men det fanns färre osteoklaster i OTM-gruppen hos Stat3Col1α2ERT2-möss än hos WT-mössen (Figur 4C). Detta fenomen bekräftades också av immunofluorescensfärgning av CTSK (Figur 4D). Dessa resultat avslöjade att osteoblastisk Stat3-brist minskade aktiviteten hos både osteoblaster och osteoklaster som svar på ortodontisk kraft och försämrad benombyggnad under tandrörelser.

Figure 1
Figur 1: Illustration av inducerbar osteoblast-härstamningsspecifik Stat3 knockout-musmodellgeneration. (A) Schematiskt diagram över Stat3 knockout i Col1α2-uttryckande osteoblaster inducerade av tamoxifen (vänster). Schemat för experimentet: 6 veckor gamla hanmöss av vildtyp och Stat3Col1ERT2 administrerades TA (100 mg·kg-1·bw) varannan dag från en vecka före OTM-modellkonstruktion och offrades för analys på d4, d7 och d10 efter OTM (höger). (B) Hybridiseringsförlopp hos inducerbara osteoblastlinjespecifika Stat3 knockout-möss. C) Dubbel immunofluorescensfärgning av STAT3 och OPN i alveolarbenet hos WT- och Stat3Col1ERT2-möss på d10 efter OTM och kvantifiering av dubbelpositiva celler på icke-OTM-sidor och OTM-sidor. n = 5; skalstaplar = 50 μm. Denna figur är från Gong et al. 26. Förkortningar: STAT3 = signalomvandlare och aktivator för transkription 3; Col1α = kollagen 1-alfa; TA = tamoxifen; WT = vildtyp; OTM = ortodontisk tandrörelse; OPN = osteopontin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Osteoblastisk brist på Stat3 retarderad ortodontisk tandrörelse (A) Det schematiska diagrammet över OTM-modellen in vivo. Fjädern ligerade mellan framtänderna och den första kindtanden (M1) och inducerade ortodontisk kraft att flytta M1 mot mesialåsen. (B) OTM-avståndet för d0, d4, d7 och d10 efter OTM i WT-möss och Stat3Col1α2ERT2-möss . (C) Representativa bilder av icke-OTM-sidor och OTM-sidor i WT- och Stat3Col1α2ERT2-möss på d10 efter OTM med mikro-CT. n = 5. Skalstreck = 1 mm (B), 500 μm (C). Denna figur är från Gong et al.26. Förkortningar: STAT3 = signalomvandlare och aktivator för transkription 3; Col1α = kollagen 1-alfa; WT = vildtyp; OTM = ortodontisk tandrörelse; SAG = sagittalplanet. Streckade kurvor anger OTM-avståndet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Illustration av intressanta regioner. (A) Schematisk bild av de regioner som ger avkastning på investeringen. Det prickade området som ligger inom tre rötter av M1 i tvärsnittet av överkäken valdes som ROI. De tre rötterna av M1 inkluderar mesiobuckalroten, distobuccal roten och palatalroten. B) Färgning av hela alveolarbenet hos M1 hos möss. C) Immunofluorescensfärgning av OPN i hela det alveolära benet av M1 hos möss. Skalstaplar = 200 μm (B), 100 μm (C). Denna figur är från Gong et al.26. Förkortningar: ROI = intresseområden; MB = mesiobukalk rot; DB = distobuccal rot; P = palatal rot; HE = hematoxylin-eosin; OPN = osteopontin; PDL = parodontalt ligament. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Osteoblastisk brist på Stat3 försämrad ortodontisk kraftinducerad benbildning och resorption . (A) Sekventiell fluorokrommärkning med calcein- och alizarinrött S i WT- och Stat3Col1α2ERT2-möss under OTM och kvantifiering av mineralappositionshastigheter. n = 5. (B) Immunofluorescensfärgning och kvantifiering av OPN+-celler i alveolärt ben på d10 efter OTM i WT- och Stat3Col1α2ERT2-möss. n = 5. (C) TRAP-färgning och kvantifiering av TRAP-positiva celler i alveolärt ben på d4 efter OTM i WT- och Stat3Col1α2ERT2-möss. n = 5. (D) Immunofluorescensfärgning och kvantifiering av CTSK+-celler i alveolärt ben på d4 efter OTM i WT- och Stat3Col1α2ERT2-möss. n = 5. Skalstreck = 10 μm (A), 50 μm (B-D). Denna figur är från Gong et al.26. Förkortningar: STAT3 = signalomvandlare och aktivator för transkription 3; Col1α = kollagen 1-alfa; WT = vildtyp; OTM = ortodontisk tandrörelse; OPN = osteopontin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; TRAP = tartratresistent surt fosfatas, MAR = mineralappositionshastigheter, CTSK = cathepsin K. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eftersom bettfel är en av de vanligaste orala störningarna som försämrar andning, tuggning, tal och till och med utseende, ökar efterfrågan på ortodonti dag för dag och incidensen ökar från 70 % till 93 % enligt en tidigare epidemiologisk undersökning31,32. Hur man påskyndar alveolär benombyggnad för att öka effektiviteten av ortodontisk behandling på ett säkert sätt har blivit ett hett ämne inom detta område; därför är det nödvändigt att klargöra mekanismen för alveolär benremodellering som drivs av OTM. I tidigare studier har forskare använt in vivo läkemedelsinjektion för att studera mekanismen för OTM i djurmodeller21,33, vilket var enkelt och lätt, men det var svårt att utesluta läkemedels påverkan på cellerna i andra system. Därför är det mycket nödvändigt att studera mekanismen för benremodellering under ortodontisk kraft in vivo.

Under de senaste åren har genknockoutmöss använts i stor utsträckning, vilket ger en solid grund för studier av genfunktion och utforskning av terapeutiska mål34. Bland dessa tekniker var knockout-tekniken för hela genen den tidigaste metoden. Adrb2-/ - adrenerg receptor (Adrb2) knockout-musmodellen användes för att utforska det sympatiska nervsystemets roll i alveolär benremodellering under OTM35. Möss som helt slår ut gener kan dock i vissa fall leda till embryonal dödlighet, vilket hindrar studier av genernas funktion. Därför utvecklades betingade knockout-möss, riktade mot en gen i specifika celltyper. Men eftersom forskning relaterad till alveolär benremodellering ofta är tidskänslig, är det därför nödvändigt att observera förändringarna i alveolarbenet vid specifika tidpunkter efter modellering.

Inducerbara betingade genknockoutmöss har de dubbla fördelarna med tidsmässig och rumslig kontroll av DNA-rekombination och vävnadsspecificitet, och genknockout kan uppnås vid specifika tidpunkter och specifika vävnader genom applicering av läkemedel eller hormoner, vilket bättre kan möta forskningsbehoven. Dessutom är STAT3 en transkriptionsfaktor som uttrycks i stor utsträckning i ben och andra vävnader och har funktionerna att reglera cellproliferation, differentiering, apoptos och immun och andra viktiga funktioner25. Vi har tidigare rapporterat att bentätheten hos icke-inducerade osteoblastspecifika Stat3 knockout-möss minskade28, vilket tyder på att icke-inducerade betingade Stat3 knockout-möss inte är lämpliga för mekanistiska studier av alveolär benremodellering som måste utesluta påverkan av utveckling.

Därför genererade vi i denna studie tamoxifen-inducerbara osteoblastspecifika Stat3-genknockoutmöss, Stat3Col1α2ERT2, genom att använda inducerbar betingad genknockout-teknik baserad på Cre/loxP-systemet, som är kontrollerbar i tid och rum och mer lämplig för studier av mekanismen för alveolär benombyggnad, samt möjliggör ytterligare studier av funktionen hos specifika celler och gener i kombination med härstamningsspårning. Före induktionen av tamoxifen fanns det ingen uppenbar skillnad mellan Stat3Col1α2ERT2 och vildtypsmöss och inget speciellt i aveln. Vi har tidigare funnit att den inducerbara deletionen av Stat3 i Col1α2+ osteoblaster försämrade benbildningen och minskade benmassan hos vuxna möss28. I denna studie minskade benmetabolismnivån hos Stat3Col1α2ERT2-möss i icke-OTM-grupper, vilket överensstämde med de tidigare resultaten. Dessutom, eftersom benmetabolismnivån i OTM-gruppen minskade mer signifikant som svar på ortodontisk kraft, kan det anses att Stat3 spelade en viktig roll i regleringen av benmetabolismen under mekanisk kraft. Vi utforskade vidare mekanismen för benremodellering som regleras av Stat3. Resultaten indikerade att Stat3 direkt kunde främja osteoblastdifferentiering 28,29 och påverkade osteoklastdifferentiering genom att reglera överhörningen mellan osteoblaster och osteoklaster genom modulering av Mmp3-transkription 29.

I detta protokoll valde vi området som ligger inom tre rötter av M1 i tvärsnittet vid överkäksbenet hos möss som ROI för att utvärdera alveolär benombyggnad. Med detta område är analysen av alveolärt ben närmare den för långa ben, där aktiviteten av osteogenes och osteoklastogenes analyseras i samma region, snarare än den traditionella metoden för att analysera egenskaperna hos olika sidor. Dessutom, enligt den klassiska hypotesen, bör två läkemedel med motsatta effekter appliceras på tryck- respektive spänningssidan för att påskynda tandens rörelsehastighet. Denna metod gav en teoretisk grund för att övervinna dessa flaskhalsar. I denna OTM-modell mättes storleken på den ortodontiska kraften med hjälp av en dynamometer. Kraften skulle dock dämpas något med minskningen av avståndet mellan den första kindtanden och framtänderna. Därför är det nödvändigt att etablera ett standardiserat mekaniskt system för att generera en mer konstant och stabil ortodontisk kraft.

Inom protokollet finns det några kritiska steg som bör hållas i åtanke. För det första, i processen för OTM-modellkonstruktion, bör den första kindtanden och framtänderna ligeras ordentligt för att undvika att kraftappliceringen misslyckas genom lossning. För det andra måste man vara uppmärksam på kraftens riktning, och horisontell kraft bör appliceras på den första kindtanden för att undvika tandutdragning orsakad av applicering av vertikal kraft. Slutligen, vid inbäddning, bör provets orientering bestämmas enligt måltvärsnittet, och sektionerna bör observeras i tid för att justera orienteringen för att få idealiska sektioner.

Sammanfattningsvis tillhandahåller vi protokoll för en inducerbar, specifik, gen knockout-musmodell av OTM, som avslöjar alveolär benremodellering vid olika tidpunkter. Vi kommer vidare att använda detta för att studera funktionen hos specifika celler och gener i kombination med härstamningsspårning. Vi satte sedan upp ett dynamiskt och cellspecifikt mönster in vivo inom OTM-mekanismforskning, vilket ger bevis för ortodonti i kliniken. Dessutom ger denna studie detaljerade protokoll för att konstruera en OTM-modell, som möjliggör snabb benremodellering genom att stimulera osteoblaster och osteoklaster och ger en idealisk modell för studier av benremodellering som svar på mekanisk kraft. Mer än så beskriver vi metoder för att analysera alveolär benremodellering under OTM för att ge en ny strategi för studier av skelettmekanisk biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes delvis av bidrag från National Natural Science Foundation of China (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); Shanghais naturvetenskapliga stiftelse (21ZR1436900, 22ZR1436700); programmet för Shanghai Academic/Technology Research Leader (20XD1422300); SHDC:s kliniska forskningsplan (SHDC2020CR4084). den tvärvetenskapliga forskningsfonden vid Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYJC201902, JYJC202116); Innovationsforskningsgruppen vid lokala högnivåuniversitet i Shanghai (SSMUZLCX20180501). Vetenskapsområdesfonden nr. KQYJXK2020 från Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine och College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University; Ursprungligt prospekteringsprojekt vid Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYYC003); Tvåhundra talangprojekt vid Shanghai Jiao Tong University School of Medicine; det kooperativa forskningsprojektet Biomaterials and Regenerative Medicine Institute, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (2022LHB02); projektet för biobank vid Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (YBKB201909, YBKB202216).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  P1020
4% paraformaldehyde Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1101
Alizarin red Sigma-Aldrich A5533
Anti-CTSK antibody Santa Cruz sc-48353
Anti-OPN antibody R&D Systems, Minneapolis, MN, USA AF808
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Closed-coil springs Innovative Material and Devices, Shanghai, China CS1006B
Col1α2CreERT2 mice A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences.
Dexmedetomidine hydrochloride Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTA Beyotime Biotechanology ST069
Embedding tanks Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd 80106-1100-16
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 100092183
ImageJ software NIH, Bethesda, MD, USA
Mounting medium with DAPI Beyotime Biotechanology P0131
Mouse dissection platform Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. HK105
Paraffin Sangon biotech Co., Ltd. A601889
Primers for genotyping Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease K Sigma-Aldrich 539480
Self-curing restorative resin 3M ESPE, St. Paul, MN, USA 712-035
Stat3fl/fl mice GemPharmatech Co., Ltd D000527
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648
TRAP staining kit Sigma-Aldrich 387A
Tris-HCl Beyotime Biotechanology ST780
Universal tissue fixative Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1105
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10023418
Zoletil VIRBAC 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frost, H. M. The Utah paradigm of skeletal physiology: an overview of its insights for bone, cartilage and collagenous tissue organs. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 18 (6), 305-316 (2000).
  2. Frost, H. M. Wolff's Law and bone's structural adaptations to mechanical usage: an overview for clinicians. The Angle Orthodontist. 64 (3), 175-188 (1994).
  3. Gothlin, G., Ericsson, J. L. The osteoclast: review of ultrastructure, origin, and structure-function relationship. Clinical Orthopaedics and Related Research. (120), 201-231 (1976).
  4. Feng, X., Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: New Insights. Bone Research. 1 (1), 11-26 (2013).
  5. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  6. Zhu, L. X., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), eaaw6143 (2020).
  7. Dai, Q., et al. A RANKL-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mTORC1 in osteoclast formation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), 56468 (2018).
  8. Karsenty, G., Kronenberg, H. M., Settembre, C. Genetic control of bone formation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 629-648 (2009).
  9. Long, F. Building strong bones: molecular regulation of the osteoblast lineage. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (1), 27-38 (2011).
  10. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).
  11. Lang, T., et al. Cortical and trabecular bone mineral loss from the spine and hip in long-duration spaceflight. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (6), 1006-1012 (2004).
  12. Sibonga, J. D. Spaceflight-induced bone loss: is there an osteoporosis risk. Current Osteoporosis Reports. 11 (2), 92-98 (2013).
  13. Yang, Y., et al. Administration of allogeneic mesenchymal stem cells in lengthening phase accelerates early bone consolidation in rat distraction osteogenesis model. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 129 (2020).
  14. Huang, C., Holfeld, J., Schaden, W., Orgill, D., Ogawa, R. Mechanotherapy: revisiting physical therapy and recruiting mechanobiology for a new era in medicine. Trends in Molecular Medicine. 19 (9), 555-564 (2013).
  15. Shu, H. S., et al. Tracing the skeletal progenitor transition during postnatal bone formation. Cell Stem Cell. 28 (12), 2122-2136 (2021).
  16. Wang, X., et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation. Nature Medicine. 19 (1), 93-100 (2013).
  17. Huja, S. S., Fernandez, S. A., Hill, K. J., Li, Y. Remodeling dynamics in the alveolar process in skeletally mature dogs. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (12), 1243-1249 (2006).
  18. Jin, A., et al. FOXO3 mediates tooth movement by regulating force-induced osteogenesis. Journal of Dental Research. 101 (2), 196-205 (2022).
  19. Bumann, A., Carvalho, R. S., Schwarzer, C. L., Yen, E. H. Collagen synthesis from human PDL cells following orthodontic tooth movement. European Journal of Orthodontics. 19 (1), 29-37 (1997).
  20. Kitaura, H., et al. Effect of cytokines on osteoclast formation and bone resorption during mechanical force loading of the periodontal membrane. The Scientific World Journal. 2014, 617032 (2014).
  21. Lu, W., et al. Sclerostin injection enhances orthodontic tooth movement in rats. Archives of Oral Biology. 99, 43-50 (2019).
  22. Seki, Y., et al. Differentiation ability of Gli1(+) cells during orthodontic tooth movement. Bone. 166, 116609 (2023).
  23. Gong, X. Y., et al. Local orthodontic force initiates widespread remodelling of the maxillary alveolar bone. Australasian Orthodontic Journal. 36 (2), 175-183 (2020).
  24. Liu, Y., et al. STAT3 and its targeting inhibitors in osteosarcoma. Cell Proliferation. 54 (2), e12974 (2021).
  25. Guadagnin, E., Mazala, D., Chen, Y. W. STAT3 in skeletal muscle function and disorders. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2265 (2018).
  26. Saikia, B., et al. Clinical profile of hyper-IgE syndrome in India. Frontiers in Immunology. 12, 626593 (2021).
  27. van de Veen, W., et al. Impaired memory B-cell development and antibody maturation with a skewing toward IgE in patients with STAT3 hyper-IgE syndrome. Allergy. 74 (12), 2394-2405 (2019).
  28. Zhou, S. R., et al. STAT3 is critical for skeletal development and bone homeostasis by regulating osteogenesis. Nature Communications. 12 (1), 6891 (2021).
  29. Gong, X. Y., et al. Osteoblastic STAT3 is crucial for orthodontic force driving alveolar bone remodeling and tooth movement. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (1), 214-227 (2023).
  30. Yang, Y., et al. Skeletal phenotype analysis of a conditional Stat3 deletion mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), 61390 (2020).
  31. Egic, B. Prevalence of orthodontic malocclusion in schoolchildren in Slovenia. A prospective aepidemiological study. European Journal of Paediatric Dentistry. 23 (1), 39-43 (2022).
  32. Gois, E. G., et al. Incidence of malocclusion between primary and mixed dentitions among Brazilian children A 5-year longitudinal study. The Angle Orthodontist. 82 (3), 495-500 (2012).
  33. Yang, F., et al. Effects Of triptolide on tooth movement and root resorption in rats. Drug Design, Development and Therapy. 13, 3963-3975 (2019).
  34. Wang, C., Sun, H. Progress in gene knockout mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 35 (5), 784-794 (2019).
  35. Cao, H., et al. Force-induced Adrb2 in periodontal ligament cells promotes tooth movement. Journal of Dental Research. 93 (11), 1163-1169 (2014).

Tags

Medicin utgåva 197 Ortodontisk tandrörelse Benmetabolism Mekanisk kraft Djurmodell STAT3-roll i osteoblaster Tamoxifen-inducerbar musmodell ortodontisk kraft alveolär benfenotyp mikro-CT stereomikroskopi histologisk analys osteoblaster osteoklaster
Användning av inducerbara osteoblastiska härstamningsspecifika <em>Stat3</em> knockout-möss för att studera alveolär benremodellering under ortodontisk tandrörelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong,… More

Liu, Y., Sun, S., Jiang, Z., Gong, X., Yang, Y., Zhu, Y., Xu, H., Jin, A., Huang, X., Gao, X., Lu, T., Liu, J., Wang, X., Dai, Q., Jiang, L. Using Inducible Osteoblastic Lineage-Specific Stat3 Knockout Mice to Study Alveolar Bone Remodeling During Orthodontic Tooth Movement. J. Vis. Exp. (197), e65613, doi:10.3791/65613 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter