Summary
この原稿の目的は、狂犬病特異的IgGおよびIgM抗体を検出するための狂犬病間接蛍光抗体検査の使用を検討することです。
Abstract
狂犬病間接蛍光抗体(IFA)検査は、血清または脳脊髄液中のさまざまな狂犬病特異的抗体アイソタイプを検出するために開発されました。この検査は迅速な結果を提供し、いくつかの異なるシナリオで狂犬病抗体を検出するために使用できます。狂犬病IFA検査は、狂犬病を発症した患者の免疫反応を評価するための抗体の迅速かつ早期検出に特に役立ちます。生前の狂犬病診断には他の方法が優先されますが、この検査は、抗体検出を通じて最近の狂犬病ウイルスへの曝露を実証するために利用される場合があります。IFA検査では、ウイルス中和抗体(VNA)力価は得られませんが、曝露前予防(PrEP)反応は、抗体の陽性または陰性の存在によって評価できます。このテストはさまざまな状況で利用でき、さまざまなターゲットに対して結果を提供できます。この研究では、PrEPを投与された個人から採取したいくつかのペアの血清サンプルを使用し、IFAテストを使用して狂犬病抗体の存在を経時的に実証しました。
Introduction
狂犬病間接蛍光抗体(IFA)検査は、血清または脳脊髄液中のさまざまな狂犬病特異的抗体アイソタイプを検出するために使用されます。これは、生前の狂犬病患者を監視するために利用できる検査の武器庫の1つです。特に、狂犬病感染に対する患者の免疫反応を評価する抗体の早期発見に有用です。IFA検査は、他の検査、病歴、患者のワクチン接種状況と併用することで、狂犬病ウイルスやワクチンへの曝露を判断するのに役立ちます1。IFA検査はIgMおよび/またはIgGを測定するため、特異的抗体の値は、抗原1への曝露からのおおよその時間枠を示すことができます。このテストは、リストされているアプリケーションや、まだ検討されていない他のアプリケーションで役立つ場合があります。
狂犬病血清学的アッセイはいくつかあります。狂犬病ウイルス中和抗体(RVNA)を測定する主な方法は、迅速蛍光焦点阻害試験(RFFIT)、蛍光抗体ウイルス中和試験(FAVN)、またはこれらの修飾です1。ただし、これらの検査では、IgM抗体とIgG抗体は区別されません。狂犬病免疫応答のモニタリングにおいて抗体アイソタイプの鑑別が重要な場合、狂犬病IFAおよび狂犬病酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)試験が使用されますが、RVNAは測定されません。IFA検査とELISA検査は、検体中の狂犬病特異的抗体の存在を判定するために使用できますが、その実行方法にはいくつかの違いがあります。IFA検査では、細胞培養された生きたウイルスを抗原基質として利用しますが、狂犬病検出用の一般的なELISAでは、1つ以上のウイルスタンパク質を使用します。狂犬病ウイルスを培養できる実験室では、ELISA用の個々のウイルスタンパク質を購入または培養する代わりに、IFA検査をより簡単に実施できる可能性があります。検査の目的と狂犬病血清学的アッセイの結果から得られた情報は、どちらを選択するかを決定する際に考慮する必要があります2。
IgMが最初に反応し、28日目頃にクラス切り替えが観察されるまで増加し、その時点でIgGが主要な循環抗体になります3。したがって、IgMは、狂犬病ウイルスへの曝露またはワクチン接種後の限られた時間のみ予想されます。血清と脳脊髄液(CSF)の両方を検査することで、曝露がワクチン接種によるものか(抗体は血清にのみ見られる)、またはウイルス感染によるものか(CSF1に抗体を示す可能性がある)を示すことができます。
狂犬病抗体は曝露前予防(PrEP)後数年間持続することが確立されています4。IFA検査は、ワクチン接種後や曝露後のさまざまな時点でこれを実証するための有用なツールとなり得ます。
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Protocol
以下のプロトコルは、ニューヨーク州保健省ワズワースセンターによるアッセイ開発のためのヒトサンプルの倫理的使用について承認されています(プロトコル承認番号#03-019)。
1. 安全性
- 個人用保護具(PPE)、少なくとも目の保護具(眼鏡またはフェイスシールド)、サージカルマスク、および非ラテックス手袋を着用してください。
- 職員が狂犬病の予防接種を受けており、過去6か月以内に≥0.5 IU / mLの力価が実証されていることを確認します。
2. 抗原スライドの調製
注意: ウイルス、CSF、および血清のすべての操作は、バイオセーフティキャビネット(BSC)で普遍的な予防策を使用して実行してください。
- 10%ウシ胎児血清(EGM)を添加したEagleの最低限の必須培地で、3.0 x 105 細胞/mLの濃度になるように20 mLのマウス神経芽腫またはBHK-21細胞を調製し、使用するまで冷気に保ちます。
- CVS-11ウイルスをEGMで希釈して、1ミリリットルあたり1.0 x 106.5 50%組織培養感染用量(TCID50)の作業希釈液で調製し、使用する準備ができるまで冷やしてください。
注:TCID50 は、以前に公開されたリードとミュンチ法によって決定されます5。 - 加湿スライドチャンバーとポリテトラフルオロエチレン(PTFE)でコーティングされたウェル顕微鏡スライドを70%エタノールで洗浄し、BSCで風乾させます。
- スライドチャンバー内の吸収紙のストリップに蒸留水(dH2O)を加えて、手順全体を通して湿度が一定に保たれるようにします。
- 鉛筆を使用して、使用する各スライドにロット番号、日付、細胞の種類、および保管に必要なその他の識別情報をラベル付けし、スライドチャンバーに入れます。
注意: ほとんどのマーカー、ペン、またはラベルは、将来のアセトン固定ステップ(ステップ2.9)に耐えられません。 - 50 μLのウイルス希釈液を、繰り返しピペットで顕微鏡スライド上の各ウェルに塗布します。次に、50 μLの細胞希釈液を各ウェルに塗布し、すでにウェルに付着しているウイルスでピペットチップを汚染しないように注意します。
- 湿度スライドチャンバーを閉じ、34〜36°Cの湿気のあるインキュベーターに入れます。 24時間後の細胞感染力を評価します。
メモ: 手順 2.8 から 2.12 は 1 枚のスライドでのみ実行してください。 - スライドを湿度チャンバーから取り出し、上清を慎重に吸引します。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で満たされたCoplinジャーでスライドを2分間洗浄し、スライドを風乾させます。
- スライドをCoplinジャーに入れ、可燃性物質用に承認された-20°Cの冷凍庫で最低1時間、冷たいアセトンにスライドを固定します。すべてのアセトンの注入と空気乾燥の手順をドラフトで実行します。
- アセトンが点滅し、スライドさせて乾かします。メーカーの指示に従って調製した狂犬病直接蛍光抗体(DFA)複合体をスライドのウェルに適用し、34〜36°Cの湿度の高いインキュベーターで30分間インキュベートします。
- PBSのCoplinジャーでスライドをそれぞれ2分間2回洗浄します。スライドを風乾します。
- 0.05 M トリス、0.15 M NaCl(pH 9.0)、20%グリセロール封入剤をカバーガラスに封入し、200倍の倍率の蛍光顕微鏡でスライドを読み取り、感染性を評価します。細胞が約50%感染していない場合は、目的の感染力に達するまで、翌日に手順2.7〜2.12を繰り返します。
注:細胞感染性は、スライドウェル上の陰性細胞と狂犬病陽性細胞の比率を視覚的に評価することに基づいて概算されます。陰性細胞は赤色に見え、陽性細胞は緑色の蛍光染色を示します。 - 残りのスライドをインキュベーターと湿度チャンバーから取り外します。各ウェルから上清を注意深く吸引し、スライドをPBSを含むCoplinジャーに1〜2分間入れます。スライドを約30分間風乾します。使用できる状態になるまで、スライドを-80°Cで保管してください。
3. サンプル調製
- 検査のために患者の血清またはCSFサンプルの希釈液を準備します。0.05%エバンスブルーを含むPBSで希釈した適切な使用濃度に必要なコンジュゲートを調製します。
注:コンジュゲートを暗所に保管し、塗布前に蛍光色素の完全性を維持してください
4. IFAの手続き
- 各アッセイに必要な数の抗原スライドを取り出し、スライドを完全に解凍して乾燥させます。
- スライドをCoplinジャーに入れ、可燃性物質用に承認された-20°Cの冷凍庫で2時間から一晩、冷たいアセトンにスライドを固定します。スライドをアセトンから取り出し、風乾させます。
- 湿度を維持するために、スライドを BSC 内の湿度チャンバーボックスに置き、dH2O に浸した吸収ストリップを入れます。各サンプル希釈サンプル、コントロールサンプル、またはPBSを50 μLずつ、あらかじめ決められたウェルに添加します。
注:各スライドには、適切な数の患者サンプルウェル、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、およびPBS細胞コントロールウェルが含まれている必要があります。 - 密閉した湿度スライドチャンバーを37°C、5%CO2 湿潤インキュベーターに入れます。スライドを30分間インキュベートしてから、インキュベーターから湿度スライドチャンバーを取り出し、BSCに入れます。
- アスピレーターチップを使用して、細胞単層を乱さないように、各ウェルから上清を慎重に吸引します。滅菌スポイトピペットを使用して、各ウェルにPBSを1滴塗布します。
- 慎重な吸引を繰り返し、各スライドをPBSで満たされたCoplinジャーに入れ、合計15分間、2回洗浄します。
- スライドを加湿チャンバーボックスに戻し、適切な抗ヒト抗体コンジュゲート50 μLを各ウェルに塗布します。手順 4.4 から 4.6 を繰り返します。
- スライドを風乾させ、封入剤でカバーガラスをマウントし、蛍光顕微鏡でスライドを読みます。
5. スライド解析
- 高い抗狂犬病抗体価が確認されたポジティブコントロールサンプルと比較した染色パターンと蛍光強度に基づいてサンプルを等級付けします。
- サンプルをネガティブ、1+、2+、3+、4+のスケールでグレーディングし、陰性の結果は蛍光染色を示さず、4+はポジティブコントロールサンプル1と同様の染色パターンを持つ明るい緑色のリンゴ色の蛍光を表します。
注:青リンゴの色は、FITC標識抗体にのみ適用されます。色は蛍光色素の選択によって異なります。 - 希釈係数で表されるエンドポイント値をサンプルに割り当て、サンプルが 1-2+ グレードを表示します。最初のアッセイでエンドポイントに達しない場合は、より高い希釈率でサンプルをテストします。
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Representative Results
すべての血清サンプルは、PrEP後のほぼ同じ期間に患者から収集されました。サンプルは、狂犬病ワクチンの最終接種から2週間後、狂犬病ワクチンシリーズの6か月後、および狂犬病ワクチンシリーズの18か月後に、5人の異なる患者からテストされました。各血清サンプルを直列に希釈し、プロトコルステップ 5.2 および 5.3 に記載されているように、IgM と IgG の両方の存在について等級付けしました。割り当てられた抗体値は、サンプルがエンドポイントグレード1-2+に達した希釈係数を表します。
PrEP後の各時点での試験結果から、さまざまなレベルの抗体存在を検出できるアッセイの能力が実証されています。最初のワクチン接種後まもなく、 図1に示すように、患者サンプルに高レベルのIgMとIgGの両方が存在しました。明るい緑色の蛍光細胞染色の領域は、抗体の存在が陽性であることを示しています。赤血球は狂犬病陰性の細胞で、抗体が結合できません。ワクチン接種から約6カ月後、患者サンプル中のIgMとIgGの両方のレベルが有意に低下したが、IgMはほぼ完全に脱落していた。ワクチン接種から18カ月後の最終時点では、緑色蛍光細胞の染色が観察されない 図2 に示すように、IgM抗体はどの患者サンプルからも検出されませんでした。しかし、IgGレベルは持続し、2週間の時点からの最初の減少に続いて、6か月の時点で検出されたレベルと同様にとどまりました。ワクチン接種後2週間、ワクチン接種後6ヶ月、ワクチン接種後18ヶ月の検体におけるIgGおよびIgM検出の結果を、それぞれ表 1、表 2、 および表3に示します。 図3 に実行段階のフローチャートを示します。
図1:狂犬病IgM IFA陽性染色。 希釈率1:8の患者血清は、PrEPワクチンシリーズの完了直後に陽性の染色パターンを示しました。画像のスケールバーは100μmを表しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:狂犬病IgM IFA陰性染色。 1:2希釈の患者血清は、PrEPワクチンシリーズの完了から約18カ月後に陽性染色を示さなかった。画像のスケールバーは100μmを表しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:狂犬病IFAのフローチャート プロセスの可視化に役立つIFA手順の主要なステップの実行段階を示すフローチャート。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 患者サンプル | 免疫グロブリンM | IgG(免疫グログラム) |
| PS1-1シリーズ | 1:32 | 1:512 |
| PS2-1シリーズ | 1:8 | 1:128 |
| PS3-1シリーズ | 1:16 | 1:256 |
| PS4-1シリーズ | 1:64 | 1:512 |
| PS5-1シリーズ | 1:16 | 1:128 |
表1:ワクチン接種後2週間の結果。 PrEPワクチンシリーズの完了から約2週間後に採取された血清サンプルからの患者サンプル結果。
| 患者サンプル | 免疫グロブリンM | IgG(免疫グログラム) |
| PS1-2 | 1:2 | 1:128 |
| PS2-2シリーズ | 1:1 | 1:128 |
| PS3-2シリーズ | 1:1 | 1:64 |
| PS4-2シリーズ | 1:1 | 1:256 |
| PS5-2シリーズ | 1:1 | 1:32 |
表2:ワクチン接種後6カ月の結果 PrEPワクチンシリーズの完了から約6か月後に採取された血清サンプルからの患者サンプルの結果。
| 患者サンプル | 免疫グロブリンM | IgG(免疫グログラム) |
| PS1-3シリーズ | 検出されない | 1:128 |
| PS2-3シリーズ | 検出されない | 1:128 |
| PS3-3シリーズ | 検出されない | 1:64 |
| PS4-3シリーズ | 検出されない | 1:64 |
| PS5-3シリーズ | 検出されない | 1:32 |
表3:ワクチン接種後18カ月の結果。 PrEPワクチンシリーズの完了から約18か月後に採取された血清サンプルからの患者サンプルの結果。
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Discussion
IFA検査では、抗原抗体複合体を利用することで、狂犬病特異的抗体を可視化する標識部位が可能になります。神経芽細胞腫またはBHK細胞をマルチウェルPTFEコーティング顕微鏡スライドに播種し、狂犬病ウイルスラボ株CVS-11を接種します。単分子膜がコンフルエントになり、細胞が約50%の所望の感染力に達すると、スライドは使用準備が整うまで保存されます6。
患者血清またはCSFを感染細胞単層に塗布し、狂犬病特異的抗体がウイルス抗原7に付着するようにインキュベートします。洗浄手順に続いて、蛍光標識された抗ヒトIgGまたはIgM抗体を塗布し、サンプルアプリケーションからのウイルス結合抗体に結合します。標識抗体は、蛍光顕微鏡で可視化することができます。
このアッセイを実施する準備をする際は、患者サンプル、コントロール、およびコンジュゲートの最適な調製を決定することが重要です。最初の患者サンプルは、低希釈倍率でスクリーニングするか、希釈せずにスクリーニングして、抗体の存在をテストしました。次に、高レベルの抗体を示すペアサンプルまたは以前にスクリーニングされたサンプルを、エンドポイントまでさらに希釈しました。IgG検査用の最初の患者サンプル希釈液は、市販のIFA希釈液で調製しました。IgM検査サンプルは、最初に市販のIgGブロッキング試薬で調製しました。その後、両方の試験の連続希釈液をPBSで調製しました。
検査に用いた対照群は、狂犬病PrEPの既知のレシピエントまたは狂犬病ワクチン接種歴のない個人から入手した。すべての対照サンプルは、使用前に抗体の存在についてテストされました。IgGコントロールは、FAVNによって確認された確立された狂犬病中和抗体価を持つ狂犬病ワクチンのレシピエントから得られました。IgM陽性対照サンプルは、ワクチン接種完了後約2週間で狂犬病ワクチンの接種者から入手しました。
適切なコンジュゲートの使用は、IFAテストを実施する上でもう一つの重要な側面です。各検査に使用するコンジュゲートは、そのアッセイの抗体アイソタイプターゲットによって異なります。この場合、市販のFITC標識抗ヒトIgGおよび抗ヒトIgM抗体が利用されました。ワーキング抗体複合体希釈液は、メーカーの推奨に基づいて試験前に決定しました。
IFA検査を成功させるための手順にはいくつかの重要なステップがありますが、おそらく最も重要なのは抗原スライドの準備です。感染力が約50%に達すると、利用可能な抗体の結合部位が豊富になり、サンプルの読み取りやグレーディングの際にも明瞭になります。狂犬病陰性細胞は、標識抗体をよりよく可視化するために対照的な背景を作り出します。非特異的染色は、血清などの複雑なサンプルマトリックスを使用して蛍光染色を行う際にも問題となる可能性があります。IgG不活化試薬(Gullsorbなど)の使用は、IgM8の存在を評価する際に、干渉するIgG抗体による非特異的染色を減らすのに役立ちます。材料を適切に調製し、特殊な試薬を手順に組み込むことで、高品質の結果を維持しながら、問題のある染色を減らすことができます。
狂犬病抗体の検出、定量、同定に重点を置いた多数の検査方法が開発されています。これらの各テストは、求められる情報に応じてさまざまな方法で使用できる結果を提供します。狂犬病IFA検査は、ウイルス特異的抗体アイソタイプを同定するための強力なツールであり、RFFIT検査やFAVN検査などの他の検査方法と比較して、比較的短期間で結果を得ることができます。
IFA検査は検体中の狂犬病抗体を検出することができますが、抗体の標準化された定量は提供しません。IFA検査は、抗体検出が終了する血清希釈係数を提供します。これに対し、RFFITおよびFAVN検査は、サンプル中の抗体の中和能力を定量化し、国際単位(IU)の力価が得られ、より詳細で標準化された結果を提供します。FAVNまたはRFFIT試験の結果は、IgG抗体9と決定された中和抗体の存在を実証している。中和活性におけるIgMの役割は、その構造10のために限定的であると理解される。したがって、これらの検査はIgMの存在を特異的に検出するものではありません。
テストの種類とその結果は、特定の問題に適用する場合、多少問題になる可能性があります。狂犬病ウイルス感染に対する抗体防御の防御レベルの概念は、狂犬病ワクチン接種に対する免疫応答を評価するためにもはや使用されていません。以前は、保護反応は ≥0.5 IU と定義されていました。しかし、現在の論文では、通常、免疫後の抗体反応を許容可能(≥0.5 IU)または許容できない(<0.5 IU)としています。前述のように、IFA検査はIUの抗体価を提供しないため、狂犬病に対する保護レベルを導き出すために使用すべきではありません。狂犬病を発症した患者を評価する際にIFA検査を使用すると、病気全体の免疫応答のばらつきにより、必ずしも抗体が陽性であるとは限らない。狂犬病感染の致死率はほぼ100%であるため、検査と、これらの結果からどれだけの情報を安全に導き出すことができるかを検討することが重要です11。これらの理由から、すべての狂犬病抗体検査方法を評価し、特定のシナリオでどれが最適かを判断することが常に最善です。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
このプロジェクトを支援してくださったニューヨーク州保健省ワズワースセンターに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25x55mm glass cover slips | Any | ||
| Acetone | Any | ||
| Anti-Human IgG Labeled Conjugate | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| Anti-Human IgM Labeled Conjugate | SeraCare | 5230-0286 | |
| Aspirating pipette tip | Any | ||
| BHK-21 Cells | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA Diluent | MBL BION | DIL-9993 | |
| Cell Culture water | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Coplin Jars | Any | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| Fluorescent microscope with FITC filter | Any | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | Mountant |
| Gullsorb IgM inactivation reagent | Fisher Scientific | 23-043-158 | IgG Inactivation Reagent |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Mouse Neuroblastoma Cells | ATCC | CCL-131 | |
| Multi-well PTFE coating glass slides | Any | ||
| PBS | Any | pH 7.6 | |
| Penicillin | Sigma | P-3032 | EGM |
| Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate | Millipore Sigma | 5100, 5500, 6500, RU5100, or RU5500 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Sodium Chloride crystals | Sigma-Aldrich | S5886 | Mountant |
| Sterile dropper | Any | ||
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S9137 | EGM |
| Trizma pre-set crystals pH 9.0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Mountant |
| Tryptose Phosphate Broth | BD | 260300 | EGM |
| Vitamin mix | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
References
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